Metody výzkumu patofyziologie volných radikálů RNDr. Milan Číž, Ph.D. BFÚ AV ČR, ÚEB MU milanciz@ibp.cz 1 30.3.2020 [USEMAP] Oxidační stres •redoxní rovnováha •poškození biologických makromolekul 2 30.3.2020 [USEMAP] Oxidační stres 3 30.3.2020 [USEMAP] Oxidační stres 4 30.3.2020 [USEMAP] Metody stanovení •volných radikálů •aktivity zdrojů volných radikálů •antioxidační aktivity biologických vzorků •jednotlivých antioxidantů •poškození biologických makromolekul 5 30.3.2020 [USEMAP] Metody stanovení •Chemiluminiscence •Spektrofotometrie NBT-test redukce cytochromu C •Elektronová spinová resonance •Elektrochemie stanovení spotřeby kyslíku detekce NO •Fluorimetrie (průtoková cytometrie) 6 30.3.2020 [USEMAP] Chemiluminescence Luminofory jsou oxidovány RMKD. Při návratu do základního energetického stavu emitují fotony. Jejich detekce je možná pomocí luminometrů nebo scintilačních spektrofotometrů. Nejčastěji používané luminofory: -Luminol -Lucigenin -Isoluminol -Pholasin 7 30.3.2020 [USEMAP] Chemiluminescence 8 30.3.2020 [USEMAP] CL fagocytů 9 30.3.2020 [USEMAP] CL fagocytů 10 30.3.2020 [USEMAP] CL fagocytů 11 30.3.2020 [USEMAP] CL fagocytů 12 30.3.2020 Rozlišení intra- a extracelulární CL •SOD, kataláza, křenová peroxidáza, azid sodný •luminol vs. isoluminol [USEMAP] CL fagocytů 13 30.3.2020 plazmatická membrána cytosol luminol isoluminol [USEMAP] CL fagocytů 14 30.3.2020 Aktivátory fagocytů Místo působení opsonizované částice (OZP) povrchové receptory fMLP povrchové receptory PMA proteinkináza C vápníkový ionofor A23187 Ca2+ à PKC [USEMAP] CL fagocytů 15 30.3.2020 Rozlišení mezi RMK a RMD •antioxidanty •NO donory (sodium nitropruside, SIN-1) •Analogy L-argininu (L-NMMA, L-NAME, L-NNA) [USEMAP] Systémy generující RMKD 16 30.3.2020 •xanthin/xanthin oxidáza O2-• •peroxid vodíku + ionty přech. kovů •OH •peroxid vodíku H2O2 •ABAP ROO• •SIN-1 ONOO- •buněčné systémy (fagocyty) [USEMAP] Metoda TRAP 17 30.3.2020 •Total (peroxyl) Radical-trapping Antioxidative Parameter •stanovení celkové antioxidační kapacity ve vodě rozpustných antioxidantů •referenční vzorek: trolox [USEMAP] Metoda TRAP 18 30.3.2020 • • • • • • • • •2,2‘-azobis(2-amidinopropane) dihydrochloride •2,2‘-azobis(2-methylpropionamide) dihydrochloride [USEMAP] Metoda TRAP v lipidové fázi 19 30.3.2020 • • • • • • • • •2,2‘-azobis(2,4-dimethylvaleronitrile) [USEMAP] Metoda TRAP 20 30.3.2020 • • • • • • • [USEMAP] Metoda TRAP 21 30.3.2020 • • • • • • • [USEMAP] Metoda TRAP 22 30.3.2020 • • • • • • • [USEMAP] Chemiluminiscence 23 30.3.2020 •aktivita MPO: bromid-dependentní chemiluminiscence v přítomnosti vzorku a peroxidu vodíku •buněčná proliferace a cytotoxicita: luciferin-luciferáza závislé na ATP •regulace exprese genů reporter gene assay • • • • • • [USEMAP] Průtoková cytometrie 24 30.3.2020 •tvorba RMK neutrofily a makrofágy: Dichlorodihydrofluorescein diacetate: peroxid vodíku, peroxynitrit Dihydrorhodamine 123: peroxid vodíku, peroxynitrit Dihydroethidium (hydroethidine): superoxidový anion •oxid dusnatý: 1,2-diaminoanthroquinone • • • • • [USEMAP] Průtoková cytometrie 25 30.3.2020 Dichlorodihydrofluorescein diacetát detekce H2O2 ale i dalších intracelulárních oxidantů včetně oxidů dusíku Výhody •shodná vlnová délka s fluoresceinem •používána nejdelší dobu (od roku 1983) Nevýhody •unikání z buněk - nelze fixovat •vysoká citlivost vůči světlu •toxicita • • • [USEMAP] Průtoková cytometrie 26 30.3.2020 Dihydrorhodamin detekce H2O2 ale i dalších intracelulárních oxidantů včetně oxidů dusíku Výhody •až 10x vyšší citlivost oproti DCFH-DA •stabilita - možnost fixace Nevýhody •nespecifická detekce oxidantů •závislost na mitochondriálním membránovém potenciálu? • • • [USEMAP] Průtoková cytometrie 27 30.3.2020 Dihydroethidium detekce O2-• Výhody •dobrá specificita pro O2-• •stabilita - možnost fixace Nevýhody •HE katalyzuje dismutaci O2-• •toxický •nelze použít současně s PI • • [USEMAP] Průtoková cytometrie 28 30.3.2020 •povrchové antigeny: Mab značené různými fluorescenčními značkami •buněčný cyklus, buněčná viabilita: Propidium iodide • [USEMAP] EPR 29 30.3.2020 Metody využívající existence spinu a jeho chování v silném magnetickém poli. Podle toho, zda se jedná o spin elektronu nebo jádra se dělí spektroskopické metody na nukleární a elektronové. • •Nukleární magnetická rezonance (NMR) •Nukleární kvadrupólová rezonance (NQR) •Elektronová paramagnetická rezonance (EPR) •Muonovárezonance • Objevena 1945. Metoda je založena na měření absorpce a emise elektromagnetického záření (mikrovlny) elektronů. [USEMAP] EPR 30 30.3.2020 Na vzájemné interakci elektronového momentu hybnosti s vnějším magnetickým polem je založena elektronová paramagnetická rezonance (EPR), nazývaná také elektronová spinová rezonance (ESR). EPR spektroskopie často neumožňuje přímé stanovení krátce žijících radikálů bez použití složitých experimentálních postupů (měření při nízkých teplotách, použití tzv. flow-techniky apod.). Aby se umožnilo stanovení krátce žijících radikálů i bez použití speciálních postupů, byla v šedesátých letech vyvinuta metoda spin-trappingu. [USEMAP] EPR 31 30.3.2020 Metoda EPR je použitelná pro systémy s nenulovým spinem, tj. pro systémy, které obsahují alespoň 1 nepárový elektron. Jsou to např. paramagnetické ionty některých přechodných kovů nebo vzácných zemin s částečně zaplněnými d a f orbitaly jako Cu(II), Mn(II), Cr(III,IV), V(IV) a organické radikály. Působením magnetického pole dojde k rozštěpení původního energetického stavu E0 na energetické hladiny, odpovídající jednotlivým prostorovým orientacím celkového momentu hybnosti. [USEMAP] EPR 32 30.3.2020 [USEMAP] EPR 33 30.3.2020 [USEMAP] Spektrometrie 34 30.3.2020 •aktivita MPO: o-dianisidine •lipidová peroxidace: koncentrace TBARS •jednotlivé antioxidanty: kyselina močová, kyselina askorbová, albumin, bilirubin •oxid dusnatý: Griessova reakce (nitrity, nitráty) •viabilita, cytotoxicita, buněčná proliferace: MTT test [USEMAP] Elektrochemie 35 30.3.2020 •oxid dusnatý: Selektivní elektroda pro NO •ostatní RKM •stanovení spotřeby kyslíku [USEMAP] Poškození biologických makromolekul 36 30.3.2020 •Lipidová peroxidace Stanovení konjugovaných dienů pomocí CL Stanovení MDA spektrofotometricky, HPLC Stanovení 4-hydroxynonenalu (spektrometrie, GC-MS) [USEMAP] Poškození biologických makromolekul 37 30.3.2020 •Oxidační poškození bílkovin Stanovení karbonylových skupin proteinů (HPLC, spektrometrie) Stanovení proteinových hydroperoxidů [USEMAP] Poškození biologických makromolekul 38 30.3.2020 •Oxidační poškození DNA Stanovení 8-hydroxy-deoxy-guanosinu (8-OHdG) - HPLC, GC-MS • [USEMAP]