„Biotransformace“ = metabolismus
cizorodých látek a regulace hladin
biotransformačních enzymů
ENZYMY METABOLISMU CIZORODÝCH LÁTEK
Enzymy 1. fáze biotransformace xenobiotik, steroidních
hormonů a mastných kyselin – monooxygenázy (CYP, AKR,
FMO), reduktázy (AKR, NQO), hydrolázy (esterázy,
epoxidhydrolázy); další reakce: hydratace, isomerace.
2. fáze biotransformace – transferázy (GST, UDPGT, SULF,
acetylázy aj.); antioxidační enzymy (SOD, CAT, GPx, GR).
3. fáze biotransformace (ABC transportéry)
BIOTRANSFORMACE CIZORODÝCH LÁTEK
A STEROIDŮ, EIKOSANOIDŮ AJ. ENDOGENNÍCH
LÁTEK
1. FÁZE BIOTRANSFORMACE:
monooxygenázové reakce
(substrát)
R-H + O2 + NADPH R-OH + NADP+ + H2O
(produkt)
CYP enzymy
Funkce cytochromů P450 (CYP):
- Nejprve je nutný přenos elektronů z NADPH na CYP enzym (NADPH:P450-
oxidoreduktáza)
- Aktivace molekuly kyslíku, „roztržení“ vazby
- Oxidace substrátu (hydroxylace, N-demethylace, epoxidace, dehalogenace...)
R-H R-OH
O
- C = C - - C –- C -N-CH3 N-H + HCHO
ROLE CYP1A1/CYP1A2/CYP1B1 A EPOXIDHYDROLÁZ V
METABOLICKÉ AKTIVACI POLYCYKLICKÝCH
AROMATICKÝCH UHLOVODÍKŮ
Seznam nejvýznamnějších cytochromů P450,
které jsou zodpovědné za biotransformaci
cizorodých látek:
 CYP1A1, CYP1A2, CYP1B1 (metabolizuje polycyklické aromatické
uhlovodíky);
 CYP2C9 (metabolizuje nesteroidní antiflogistika a
další léčiva), CYP2D6 (beta-blokátory, kodein); CYP2E1
(org. rozpouštědla jako ethanol, benzen, toluen)
 CYP3A4 (metabolizuje asi 30% všech xenobiotik,
především léčiv včetně antibiotik);
 CYP4A11 a další CYPs metabolizující mastné kyseliny
(CYP4A = PUFA hydroxylázy; CYP2C a CYP2J = PUFA
epoxygenázy) a některá xenobiotika.
Další desítky CYP enzymů jsou zapojeny do biosyntézy a
metabolismu endogenních látek, např. CYP7A (hydroxylace
cholesterolu), CYP17 (hydroxylace steroidů), CYP19
(aromatáza – přeměna androgenů na estrogeny).
Vlastnosti cytochromů P450
Cytochromy P450 = hemoproteiny; v UV-VIS spektru maximum při 450
nm (v redukovaném stavu a navázaný oxid uhelnatý); výjimka mezi
enzymy: široká substrátová specifita, různé katalytické aktivity, výskyt
nejvíce v játrech, GIT, plicích, ledvinách, ale i v dalších tkáních).
Klasifikace podle podobnosti sekvencí: genové rodiny CYP1, CYP2, CYP3,
CYP4 atd., podrodiny CYP1A, CYP1B atd. (cca 60% sekvence),
jednotlivé isoformy CYP1A1, CYP1A2, CYP1B1; polymorfismus.
CYP3A4 s navázaným inhibitorem Aktivní místo CYP1A2 s navázaným -naftoflavonem
(modrá barva)
CYKLUS CYTOCHROMU P450:
AKTIVACE KYSLÍKU A MONOOXYGENACE
Přenos elektronů:
NADPH
NADPH:P450 oxido-
reduktáza
cytochrom P450
(substrát RH,
produkt ROH,
produkce ROS)
Aktivace kyslíku:
ROS = vedlejší
produkty
interakcí se substrátem vzniká
vysokospinová forma Fe3+-hemu a
dochází k přenosu elektronů
STEROIDY: substrátová specifita CYP enzymů
(s výjimkou aromatázy monooxygenázové reakce inaktivují
steroidní hormony)
Hydroxylace steroidů
v různých pozicích
(v závorkách isoformy
CYP enzymů)
6-hydroxylace =
specifická reakce CYP3A
aromatáza
METABOLISMUS POLYCHLOROVANÝCH
BIFENYLŮ (PCB) – příklad 1. fáze metabolismu
persistentních organických sloučenin
Mikrobiální
degradace
včetně arom. jádra
Metabolismus
u vyšších
živočichů:
oxidativní metab.
(hl. cesty A-D, C)
Persistetní arom.
sloučeniny: obsahují Cl
v sousedních pozicích –
bariéra vzniku epoxidu
monooxygenázovou reakcí
REGULACE CYPs: nukleární a cytosolové
receptory kontrolují expresi CYP proteinů
expozice a indukce CYP enzymů ovlivňuje metabolismus endogenních látek!
(společné enzymy CYP pro biotransformaci cizorodých i endogenních látek)
expozice ciz. látkami
indukuje hladiny
CYP enzymů
XENOBIOTIKA, STEROIDY AJ.
LÁTKY INDUKUJÍ VLASTNÍ
METABOLISMUS AKTIVACÍ
RECEPTORŮ/TRANSKRIPČNÍCH
FAKTORŮ, KTERÉ KONTROLUJÍ
EXPRESI BIOTRANSFORMAČNÍCH
ENZYMŮ A ABC TRANSPORTÉRŮ
- vazba xenobiotika na receptor
(aktivace receptoru)
- dimerizace receptoru
- vazba receptoru na specifické
responsní elementy v promoterových
oblastech cílových genů
NUKLEÁRNÍ A CYTOSOLOVÉ RECEPTORY
nukleární receptory cytosolový receptor
dimerizační partner
specif. responsní element v promoterechligand receptoru
NUKLEÁRNÍ A CYTOSOLOVÉ RECEPTORY
KONTROLUJÍCÍ EXPRESI CYP ENZYMŮ
Cizorodé nebo
endogenní látky,
které indukují
hladiny CYP
enzymů
SEZNAM CYTOCHROMŮ P450 (CYP) ZODPOVĚDNÝCH
ZA BIOSYNTÉZU / METABOLISMUS STEROIDŮ A
METABOLISMUS XENOBIOTIK
 CYP1A1, CYP1A2, CYP1B1: genová exprese regulována AhR (indukce
dioxiny, PAH; endogenní ligandy?); monooxygenace PAH, estradiolu;
 CYP2B: exprese regulována GR/CAR, indukce steroidy,
fenobarbitalem, monooxygenace velké řady xenobiotik, testosteronu aj.
 CYP2A, CYP2C, CYP2D
 CYP2E: indukce především stabilizací proteinu (indukují etanol, pyrazol
aj.), monooxygenace etanolu, (-1)-hydroxylace mastných kyselin
 CYP3A: exprese regulována GR/PXR; indukce dexametazonem aj.
steroidy, monooxygenace velké řady xenobiotik (nejdůležitější enzym
biotranformace), 6-hydroxylace testosteronu
 CYP4A: exprese regulována PPAR, indukce peroxisomálními
proliferátory (clofibrate, dialkylestery kyseliny ftalové), -hydroxylace
mastných kyselin
 CYP7A, CYP11A, CYP17, CYP19 (aromatáza): enzymy steroidogeneze
 další důležité CYP metabolismu vitamínu D3 a kyseliny retinové
REGULACE EXPRESE BIOTRANSFORMAČNÍCH
ENZYMŮ:
CYTOSOLOVÝ Ah (aryl hydrocarbon) RECEPTOR
AhR (Aryl hydrocarbon receptor)
biotransformačních enzymů
CYP1A1/1A2/1B1, UGT, GST,
NQO1, ...
regulátorů bun. cyklu /
apoptózy (p27, Bax,...)
přímé interakce (ER?,..)
AhR kontroluje genovou expresi
další funkce AhR-dependentní genové exprese
AKTIVACE Ah RECEPTORU A INDUKCE
CYP1A1 SUBSTRÁTEM CYP1A
AhR/ARNT nasedá na XRE = DRE = xenobiotic (dioxin) response element
substrát S je ligandem AhR monooxygenázová reakce
LIGANDY / INDUKTORY AhR
Strukturní podobnost (šířka, výška, molekulární objem, planarita molekuly)
Nekoplanární látky
(např. PCB se dvěma
chlóry v pozici ortho)
nevykazují planární
pozici aromatických jader
a nejsou agonisty AhR
TCDD = nejsilnější agonista AhR
= modelový dioxinový toxikant
Koplanární PCB
(podobný dioxinům, agonista AhR)
ENDOGENNÍ AGONISTÉ AhR
dosud nejsou přesně určeny (deriváty tryptofanu ?)
Fyziologické
funkce AhR:
nezbytný v řadě
procesů
vývoje tkání,
differenciace
buněk aj.
(viz myší AhR-
deficientní
modely)
AKTIVACE Ah RECEPTORU / AhRDEPENDENTNÍ
GENOVÁ EXPRESE
Produkty genové
exprese:
-detox./bioaktiv. enzymy
- apoptóza;
- bun. cyklus;
- ?
Přímé interakce AhR
(„cross-talk“ s ER, ...)
Regulace AhR:
- degradace AhR po
navázání ligandu
- AHRR = AhR represor
REGULACE CYTOCHROMU P4501B1 (CYP1B1)
DRE =
dioxin
response
element
(je velmi komplexní – několik responsních elementů)
REGULACE EXPRESE BIOTRANSFORMAČNÍCH
ENZYMŮ:
NUKLEÁRNÍ RECEPTORY
NUKLEÁRNÍ RECEPTORY (NR)
NUKLEÁRNÍ RECEPTORY:
struktura domén receptorů
vazba ligandu
aktivace MAPK
NUKLEÁRNÍ RECEPTORY MOHOU BÝT
AKTIVOVÁNY TAKÉ PROTEINKINÁZAMI
Ligand-independentní
modulace
transkripčního
faktoru (MAPK, PKA,..)
NUKLEÁRNÍ RECEPTORY - KLASIFIKACE
Ligandy (agonisté) jaderných receptorů
NUKLEÁRNÍ RECEPTORY
= „xenosensory“ a „lipidní sensory“
(aktivace transkripce po expozici xenobiotiky resp. lipidy)
NUKLEÁRNÍ RECEPTORY:
vazba antagonistického a agonistického ligandu
Antagonisté:
vazba bez
transaktivace
REGULACE GR / PXR / CAR
Více úrovní
regulace;
aktivace nízkou
vs. vysokou
koncentrací
ligandu
FENOBARBITAL (PB) – agonista CAR
(a induktor biotransformačních enzymů), ale
také indukce metabolismu endogenních látek
Biotransformace:
enzymy 1. fáze
enzymy 2. fáze
Modulace endogenního
metabolismu
PPAR
(Peroxisomal
Proliferator-
Activated
Receptor alpha)
Induktory:
mastné
kyseliny,
hypo-
lipidemika
(fibráty),
environ.
látky
(ftaláty)
kontroluje expresi
CYP4A11 a enzymů
metabolismu lipidů
LIGANDY PPAR
Di(2-ethylhexyl)ftalát (DEHP)
C O– –CH CH2– – – – –CH CH CH CH2 2 2 3
C O– –CH CH2– – – – –CH CH CH CH2 2 2 3
O CH2
CH2
CH3
CH3
O
Farmaka
(hypolimidemika)
Environmentální
kontaminanty
(Endogenní) lipidy
DŮSLEDKY AKTIVACE PPAR
Nerovnoměrná
indukce CYP4A
(vedl. produkt: H2O2)
a dalších enzymů
(např. CAT)
dependentních
na PPARalfa
DALŠÍ ENZYMY 1.FÁZE
BIOTRASFORMACE A JEJICH
REGULACE
DALŠÍ ENZYMY 1.FÁZE BIOTRASFORMACE A
JEJICH REGULACE
- flavinmonooxygenázy (FAD enzymy, NADPH přímo reaguje s
enzymem);
- peroxidázy (hemoproteiny oxidující 2-aminofluoren, PAH, fenoly;
radikálové jednoelektronové reakce);
- alkoholdehydrogenázy (koenzym NADH, oxidace prim. a sek.
alkoholů);
- aldehyddehydrogenázy (oxidace= detoxikace aldehydů a ketonů);
- aldoketoreduktázy (AKR, oxidační reakce alkoholů – NAD+; redukce
aldehydů a ketonů na alkoholy za účasti NADPH);
- reduktázy xenobiotik (aldoketoreduktázy AKR, dehydrogenázy s
krátkým řetězcem SDR, dehydrogenázy se středně dlouhým
řetězcem, NADPH/chinonoxidoreduktáza - dvouelektronová redukce
chinonů);
- hydrolázy (štěpení substrátu za účasti vody; acetylcholinesterázy,
karboxyesterázy, epoxidhydrolázy)
ALKOHOLDEHYDROGENÁZY
Metabolismus etanolu třemi
enzymovými systémy
ALDOKETOREDUKTÁZY
-většinou monomerické NAD(P)(H)-dependentní oxidoreduktázy;
konvertují karbonyl alkohol
- dosud 115 enzymů ve 14 „genových rodinách“;
- substrátová specifita: cukerné aldehydy; steroidní
hormony; prostaglandiny a lipidové aldehydy;
metabolizují také některé chemické karcinogeny
(NNK, PAH-trans-dihydrodioly, aflatoxindialdehyd)
Příklady lidských AKR:
AKR1A1 (aldehydreduktáza)
AKR1B1 (aldosareduktáza)
AKR1C1-1C4 (20-, 3-, 3/17-, 3-HSD)
AKR1D1 (5-reduktáza)
1. fáze biotransformace PAH:
účast CYP1A1/1A2/1B1 (monooxygenace), EH
(hydroláza) a AKR (reduktáza)
katecholy =
- metabolity PAHs,
- podobně
metabolity
steroidů (E2)
Detoxikace
versus
bioaktivace
ALDOKETOREDUKTÁZY
Detoxikace NNK
Biotransformace aldehydů
lipidní peroxidace
REGULACE ALDOKETOREDUKTÁZ
KLASICKÝ POHLED NA INDUKCI GENOVÉ EXPRESE
KONTROLOVANOU XRE A ARE: transkr. faktor Nrf2 je
indukován reaktivními metabolity a ox. stresem
Miao et al., Biochem. Pharmacol., 2004
XRE = xenobiotic (dioxin) respons element;
ARE = antioxidant response element
Bifunkční induktory
= xenobiotika
aktivující
AhR a Nrf2
NQO; GST a další
enzymy 2. fáze
biotransformace
TRANSKRIPČNÍ FAKTOR Nrf2 JE
REGULOVÁN OXIDATIVNÍM STRESEM /
ELEKTROFILNÍMI METABOLITY A TAKÉ
AKTIVACÍ AhR
Miao et al., JBC, 2005
Keum, Biomol
Ther, 2012
EPOXIDHYDROLÁZY
Funkce:
- metabolismus lipidů (epoxidů) v živočišných a rostlinných buňkách
- metabolismus intermediátů xenobiotik s epoxidovou skupinou
celkem 7 forem EH:
- savčí solubilní (cytosolová) EH – inaktivace epoxy-mastných kyselin
- mikrosomální EH – inaktivace BaP-dihydrodiolepoxidu
- leukotrien A4 hydroláza
etc.
Regulace např. aktivací Nrf-2
ROLE CYP1A1/CYP1A2/CYP1B1 A
EPOXIDHYDROLÁZ V METABOLICKÉ AKTIVACI
POLYCYKLICKÝCH AROMATICKÝCH UHLOVODÍKŮ