Taxe bakteriálních buněk CYTOLOGIE A MORFOLOGIE PROKARYOT 4 •aktivní reakce bakterií na vnější podmět z prostředí •slouží k vyhledávání zdroje potravy •schopnost přemístit se k místu s optimálním pH •vyhledání míst s optimální teplotou apod… • •zpravidla jde o pohyb směrem k/nebo od zdroje signálu •chem. látky mohou být atraktanty – vyvolávají pohyb bakterie k příhodnějšímu prostředí (vyšší koncentrace vhodných živin) •repelenty - pohyb z nepříznivého prostředí (vyšší koncentrace negativních látek -toxinů) •taxe je vykonávána prokaryotickými i eukaryotickými organizmy •pomocí struktur na povrchu – bičík, fimbrie, pili •shlukování buněk za účelem vytvoření plodnice – Myxobacteria •intenzita odpovědi závisí i na teplotě • Taxe •Přítomnost/nepřítomnost atraktantu •bakterie se nachází v dynamicky se měnícím prostředí •mění se dostupnost živin, dochází k vyčerpání esenciálních živin •dochází ke konkurenčnímu boji o živiny •mezi buňkami téhož druhu i mezi druhy navzájem •produkce metabolitů (i toxinů) •soutěžení o životní prostor •taxe také závisí na signální komunikaci mezi buňkami – tzv. quorum sensing Quorum sensing •chemická komunikace ve společenstvu •umožňuje bakterii vnímat a reagovat na změny v hustotě bakterií v daném prostředí •spočívá v produkci chemických signálních molekul autoinduktorů – účelová komunikace mezi buňkami •dosažení prahové koncentrace autoinduktoru, produkované dostatečným počtem jedinců, vede k ovlivnění exprese genů •to vede ke změně fyziologického chování buňky •klíčem procesu je celkový počet bakterií ve vztahu ke kapacitě jejich okolí •pokud se v oblasti nachází pouze několik buněk, nic se nestane •autoinduktor se vyskytuje v příliš nízké koncentraci a nevyvolá u buněk specifické chování • •Quorum sensing • •produkce extracelulárních signálů až nad určitou hustotou populace !!! •důležité v patogenezi - načasování rozmístění faktorů virulence v hostiteli je kritický bod –patogen se může hromadit bez vykazování virulence •více než 4 % z téměř 6 000 genů P. aeruginosa je regulováno pomocí quorum sensing • •přítomnost určitého množství buněk daného druhu (druhů) navozuje symbiózu mezi organizmy, virulenci, produkci antibiotik •umožňuje populaci koordinovat odpověď na konkrétní situaci • • • •komunikace probíhá formou signálu generování signálu přijmutí signálu •signálem je chemická látka,autoinduktor -malá bílkovina, oligosacharid, mastná kyselina nebo jejich kombinace •u G+ - signalní molekuly - oligopeptidy •u G- - N-acyl-homoserinlakton • •každý druh má svoje signály, které nejsou rušeny signály jiných druhů •signály se uplatňují jak v rámci druhu, tak i mezidruhově („quorum sensing cross talk“) • •Chemotaxe •pohyb vyvolaný přítomností chemické látky • •Aerotaxe •ŕeakce na koncetraci plynného kyslíku • •Fototaxe •pohyb jako reakce na světlo (pozitivní, negativní) •rozpoznávání různých vlnových délek a intenzity světla • •Magnetotaxe •pohyb podél magnetického pole Země Typy taxe •Chemotaxe • •cílený pohyb buňky v koncentračním gradientu chemické látky (obvykle pomocí bičíku) •během pohybu je měněna doba „pobytu“ •ve vyšších koncentracích živin je delší • v nízkých je kratší •postupným zjišťováním koncentrace se buňka dostane až k optimální koncentraci •proces trvá relativně dlouho, ale buňka se neomylně dostane vždy k optimální koncentraci. •buňka se tedy musí neustále adaptovatna stávající koncentraci •na základě této adaptace může buň rozpoznat vyšší koncentrace •chemotaxe je jednou z nejprozkoumanějších signálních drah •bakterie vyhodnocují změnu gradientu koncentrace v prostoru i v čase •detekují 2% změnu koncentrace •Fototaxe • •pohyb bakterií při fototaxi je jiný než u chemotaxe •při fototaxi je pohyb označován jako šokový •pokud se buňka dostane do zastíněného místa, velmi rychle se zastaví a změní směr k osvětlenému místu –odpověď na změnu světelných podmínek •buňka nedokáže změřit absolutní množství světla, ale velmi přesně reaguje na změnu intenzity světla(s přesností až 5%) •fototaxe je rychlejší než chemotaxe •většina bakterií je fotofobní (kromě sinic, samozřejmě J) •orientovaný pohyb bakterií (obvykle s bičíkem) řízený světlem •pohyb není závislý na fototrofii (např. Isosphaera pallida, klouzavý pohyb, aerob, heterotrof) •pozitivní a negativní fototaxe •reakce buňky na světlo je závislá na druhu pigmentu (absorpční maximum při různých vlnových délkách) •výsledkem může být potom „nahromadění“ buněk v místě s optimální vlnovou délkou a intenzit • • • •fototaxe má 2 mechanismy spuštění: •odpověd spuštena bioenergetickými následky fotosyntézy • nebo odpověď spuštěna fotoreceptory - fotosyntetické reakční centrum=RC RC – photosyntheti reaction center ETC - electron transfer chain SRI, SRII - photoreceptors HtrI, HtrII – signal transducers PYP - photoactive yellow protein (negativní fototaxe - Halorhodospirum halophila) •Magnetotaxe • •schopnost bakterií, jednobuněčných řas a některých prvoků orientovat se v magnetickém poli Země •magnetozómy–mají vlastnosti permanentního dipólového magnetu •obsahují feromagnetický minerál magnetit(Fe3O4) v čisté formě •bakterie v sulfidických sedimentech mohou obsahovat greigit (Fe3S4) nebo pyrit (FeS2) •velikost magnetozómů: 30-120 nm, počet: 5 -40 v buňce •morfologicky různé •pohyb buňky je pasivní podél siločar magnetického pole Země •přímým pohybem (buňky jsou „pasivně taženy) pomocí magnetické síly vznikající mezi magnetickým dipólem buňky a magnetickým polem Země •průměrná rychlost magnetotaktických bakterií je 150 μm/s • •někdy dojde k seskupení koků sdružených po 10 -30 buňkách do multicelulárního útvaru obdaného společnou vrstvou •podle typu magnetického materiálu a vztahu ke kyslíku existují 3 základní fyziologické skupiny magnetotaktických bakterií • 1.mikroaerofilní(svrchní vrstva vodního sloupce) v magnetozómech magnetit 2.fakultativně anaerobní (větší hloubky s nižší koncentrací O2) v magnetozómech pyrit 3.obligátní anaerobové(nejspodnější vrstvy) v magnetozómech greig magnetosomy •Signální dráhy •založena na rozpoznání významných a nevýznamných signálů •vytvoření sítě pro regulaci přepisu genů nebo pro přenos signálů •monitoring environmentálních a vnitrobuněčných dějů a následná odpověď •tj. vypínání či zapinání exprese genů •neustálá evoluce senzorů, receptorů a přenašečů signálu – pro zvýšení citlivosti a zároveň pro inhibici neustálé stimulace •adaptace na atraktant/repelent probíhá kovalentními modifikacemi struktur receptorů •kovalentní modifikace – navázání fosfátu (fosforylace) či ztráta fosfátové skupiny (defosforylace), čímž dojde ke změně konformace enzymu • zjednodušeně - enzymy katabolických drah jsou fosforylací aktivovány a enzymy anabolických drah deaktivovány •design chemoreceptorů je konzervovaný •sestává z membr.receptorů • •u bakterií je to dvoukomponentní systém (TCS) • •receptor = histidin fosforyláza spustí nebo zastaví transkripci příslušného genu • •Organizace signálních drah •pestrá struktura signálních proteinů •tok informace od N-konce senzoru k C-doméně přenašeče (N-to-C flow) •různé receptory se shodují v senzorických sektorech •jeden signál může spouštět více úrovní/drah odpovědi •posel signální dráhy bývá cAMP (aktivátor proteinkináz) a cyklický diguanylát •souhra signálních drah • Signalizace a chemotaxe • •výzkum v oblasti chemotaxe od.r 1880 •síť chemotaktických drah je komplexní, adaptabilní a má „paměť“ ... •probíhá analýza rušivých elementů spolu s analýzou podstatných signálů •spočívá v samotné struktuře a interakcích proteinů sítě drah •chemoreceptory s proměnlivými senzory (5 typů) •dochází k regulaci chemotaxe •Senzory rozeznávají serin, aspartát, ribózu, galaktózu, dipeptidy a redoxní reakce • •Prostorová organizace senzorů •proteiny chemotaxe a pohybu jsou rozmístěné do klastrů •receptory fungují jako signalizující di- nebo trimery • amplifikují (zesilují) a integrují chemotaktické signály • •na živiny chudé medium: • vysoká hladina exprese receptorů •a jiných chemotaktických proteinů •zvyšuje hustotu a kooperaci receptorů •regulace preference ligandu Struktury pohybu •většina struktur důležitých pro přežití bakerií je umístěna na pólech •Chemotaxe – strukturně-funkční vztahy • •Vysoce konzervované chemoreceptory – Bacteria, Archaea •E. coli a salmonela - multimer na jednom nebo obou pólech buňky •tisíce regulačních proteinů a proteinů pro přenos signálu •objevena diverzita od modelových mikroorganismů •- velikost a topologie chemoreceptorů •- modus signálu •- přítomnost přídatných proteinů přenášejících signál •Mechanismus chemotaxe E. coli • •regulace pomocí MCP systému •MCP = „methyl accepting chemotactic protein“ •váží se na něj proteiny CheA a CheW – enzymy cytosolu • •složen z CHe proteinů • •CheW • receptor, spolupracuje s CheA (to je kináza) • ta reauguje tím, že se autofosforyluje •P předá dále na protein s označením Y •Y pokud je fosforylován naváže se na DNA •a rotace bičíku je PO směru hodin.ručiček • • •CheZ •odebírá fosfát z Y •Y je nefosforylované •bičík se otáčí PROTI směru hod.ručiček • Pohyb buňky k živine není nikdy přímočarý a nikdy není souvislý – střídá se fáze plavání a vznášení se •Bičík - prokaryota vs eukaryota • •prokaryota •bičík z flagelinu, hnací síla=pmf •rotace bičíku kolem vlastní osy •poháněn proton motive force (pmf) – pohyb protonů přes cytoplazmatickou membránu • •eukaryota •hnací motor=ATP, bičík je z tubulinu •pohyb=ohýbání • • Vnitřní faktory ovlivňující pohyb •počet bičíků •lokalizace bičíků •dostatek redukčních ekvivalentů •Bakteriální bičík - Flagellum •dutá trubice tvořena globulárním proteinem flagelinem •flagelin je tvořen 1 – 4 proteiny •podobná stavba bičíku u všech dosud zkoumaných druhů bakterií •tloušťka 13 – 20 nm, délka bičíku několikanásobně větší než délka buňky •rychlost pohybu 1 – 100 μm/s •počet bičíků se v průběhu života bakterie může měnit •pokud je bičíků víc - mohou se spolu splétat • zpravidla se při přestupu do viskóznějšího prostředí vytvoří další bičíky •molekul.hmotnost flagelinu větší než pilinu •flagelární antigen •začíná v CM (oproti fimbriím) •bičíky lze snadno odstranit sklem – lámou se • • motility test medium (polotuhé medium •Bičík •semirigidní vláknitá struktura • těsně nad plasmatickou membránou upevněn pružným háčkem („hook“) •ten ho spojuje s komplexem proteinů tvořícím motor •motor je fixován v membráně a pracuje na principu protonové pumpy •je to skupina proteinů pracujících jako rotor a stator motoru •pod háčkem se nacházejí 3 páry kruhových destiček •2 páry jsou statické, 1 pár se točí • všemi třemi páry prochází točící se bičík •kolem páru točících se destiček se nachází statický protein MOT (odv. od „motility“) •MOT je zodpovědný za transport proton - pro funkci bičíku nezbytný! • pod 3. párem destiček se nachází protein FLI (flip) - dokáže přepínat směr otáčení bičíku • •https://www.youtube.com/watch?v=dYt5135_0bs •Při otáčení CCW (counter-clockwise, proti směru hodinových ručiček) bakterie plave vpřed •při otáčení CW (clockwise, po směru hodinových ručiček) bičík pořádně nezabírá, protáčí se, a bakterie zůstává na místě • Přepínání mezi CW a CCW zajišťuje protein FLI •během chemotaxe plave bakterie cca 1 sec CCW a 1/10 sekundy stojí díky CW na místě •při CV vyhodnocuje, zda se pohybuje správným směrem vzhledem k atraktantu •pokud se přiblížila ke zdroji pokračuje při pohybu stejným směrem •pokud se vzdálila, náhodně zvolí směr jiný • •Komponenty bičíku •bazální tělísko, kterým je ukotven v membráně •G- bakt. - 3 kruhy (CM, PG a VM) v cyt.membrane, peptidoglykanu, vnější membráně •G+ bakt. - 2 kruhy • • háček (hook) •vlastní vlákno •bazální tělísko zůstává ukotveno i po odstranění bičíkového vlákna •to je do 20 až 30 min dosyntetizováno Rozdíl v ukotvení bičíku u G- a G+ bakterií G- bakterie •buň.stěna není tak pevná • navíc mají vnější membrána • = více kotvících disků •L ring - vnější membrána •P ring – PG buněčné stěny • G+ : •bazální tělísko - 2 disky •spodní disk v cytoplasmatické membráně •horní disk v buněčné stěně – složí jako kluzné ložisko •tam se otáčí osa a je ukotven háček pro ohyb •Tvorba bičíku •schopnost samouspořádávání – „self-assembly“ •molekuly flagelinu jsou středem vlákna transportovány na konec bičíku •flageliny jsou skládány ve formě levotočivé šroubovici •na konci se připevňují a bičík tím prodlužují •bičík se dosyntetizuje vždy do stejné délky •tvorba bičíku velmi rychlá Selfassembly.... https://www.youtube.com/watch?v=N5Dv_u81Rw4 EM - ultrastruktura bičíku uspořádání bičíků: taxonomický znak Metody pozorování bičíků •Pozorování pohybu bičíku – visutá kapka •důležitý dostatek kyslíku •v temném poli a intenzivním světle • •Pozorování bičíků samotných: • •světelný mikroskop •spec. barvení (obalení bičíku vrstvou mořidla, • znásobení a zviditelnění jeho průměru) • •elektronový mikroskop •negativní barvení – barvení pozadí •otiskové preparáty po rychlém zmražení na -150 C Pohyb bakteriální buňky •spojeno s pohybem po tkáních/sliznicích •swimming motility – pohyb bičíky, plavání - schopny všechny buňky s bičíkem •swarming motility – plazivý pohyb kolonií, bičíky, Proteus •twitching motility – trhavý, skákavý pohyb – př. Neisseria gonorrheae, Legionella pneumophila •gliding motility – klouzavý pohyb • •motility medium - terasovitý růst – střídání fází u rodu Proteus • • •twitching motility -Legionella pneumophila •Plazivý pohyb kolonií (swarming) •Proteus, Vibrio •pohyb indukovaný kontaktem s tuhým médiem •delší buňky, více bičíků •oblak, roj buněk, který se pohybuje koordinovaným •pohybem •má schopnost přerůstat i vyvýšené útvary na médiu •plazení je char. jen pro některé rody •např. Gama a Alfaproteobakterie (proteus, salmonella) •umožňuje jim to lepší adherenci k hostiteli •plazivý pohyb je dáván do souvislosti s infekcemi v urogenital.traktu •pro plazení je potreba tuhe medium a další bakterie •samostatná buňka plazení není schopna • •Klouzavý pohyb (Gliding motility) •uplatňuje se na pevných površích •mechanismus nejasný •proton multi force (PMF) je asi taky hnací silou • •přizpůsobení – tvorba slizu, surfaktanty, specif. membránové komponenty • které tvoří reverzibilní vazbu se substrátem – „actine-like“ systém • • • •Makoto Miyata - zkoumal klouzavý pohyb Mycoplasma mobile •pomoci cytoskeletárních filament udržují nesférický tvar •není zatím znám mechanismus, jak k němu dochází • •(„They look like schmoos that are pulled along by their heads. How they are able to glide is a mystery“.) • • • Miyata, M., Ryu, W.S., and Berg, H.C. "Force and velocity of Mycoplasma 22.10.2015 mobile gliding." J. Bacteriol. 184, 1827-1831 (2002). Klouzavý pohyb – tvorba plodnice myxobakterií •při nedostatku živi u myxobakterií --> vytvoří plodnici --> přežije díky ní nutriční stres •Bičíky Archaea •strukturní a funkční podobnost bakteriálním bičíkům • •Rozdíly: • pohon ATP (mechanismus neznámý) •bičík nemá centrální dutiny – nemožnost dorůstání od konce •k jeho skládání nedochází od konce ale od základu •koordinovaný pohyb více filament Fimbrie - pili •termín fimbrie je obecnější, pilus označuje struktury sloužící ke konjugaci) • struktura BS, stovky •kratší než bičík •Ø2-8 nm, délka 0,1 – několik nm, 3-5 molekul •fce: přenos DNA konjugací, přichycení fágů • •primárně skládají z oligomerních pilinových proteinů – dutá vlákna stočená do spirály • různě velké, typicky u G- bakterií • •některé pilusy (tzv. pilusy čtvrtého typu) slouží k pohybu • dojde k adhezi pilusu na substrát, pak se pilus stáhne a přitáhne k sobě celou buňku •výsledný pohyb charakteristicky trhaný • • •mnohé fimbrie umožňují adhezi buněk k nenabitému povrchu • např. při vzniku infekce, biofilmu •zpravidla rozmístěné rovnoměrně po celém povrchu buňky a nebo rostou z opačných pólů •mutantní bakterie postrádající tyto fimbrie- nemohou přilnout k jejich cílovému povrchu • proto nemohou způsobit chorobu •PILI – fimbrie – 2 typy • •I. •kódované chromozomálně •slouží ke specifické kolonizaci u symbiontů, parazitů a patogenů •Př: Vibrio cholerae O1, E.coli – uropatogenní P pilus, adherence fimbrie + enterotoxin E. coli) • •II. •sex fimbrie - F-pilusy či konjugativní pilusy • (F pilus u E.coli, konjugativní plazmidy salmonel) •kódované konjugativním plazmidem u donora • spojují jednu bakterii k druhé, propojují jejich cytoplazmy •umožňují tím výměnu genetické informace – plazmidů •plazmidy mohou následně umožnit určitou novou funkci, například rezistenci k ATB •bakterie mohou mít až 10 sexuálních pilusů •někdy jich využívají bakteriofágy při vstupu do bakteriálních buněk • •barvení fimbrií: •- kys.fosfowolframová •- kys. osmičelová • základní stavební jednotka...oligomerní pilinové proteiny PILI - fimbrie • Různě velké, typicky u G- • struktura B.S, stovky • duté, vždy nepohyblivá trubička - 3, 4 nebo 5 vláken stočených do spirály – protein pilin • kratší než bičík - Ø2-8 nm, délka 0,1 – několik nm, 3-5 molekul • Fce: přenos DNA konjugací, přichycení fágů Pohyb (twitching motility); adheze k nenabitým povrchům 22.10.2015 35 •Curli •u Enterobakterií •slouží k agregaci, adhezi, formování •proteinové komponenty Enterobacteriaceae •forma amyloidních vláken •objeveny 1980 •slouží k adhezi na povrchy, agregace buněk • formování biofilmu •napomáhají invazi do hostitele •indukují zánět Eukaryotický cytoskelet a jeho modifikace vlivem patogenů •Cytoskelet hostitele slouží k: •k adheze na povrch •následuje invaze - vstup patogena do buňky •umožňuje pohyb uvnitř a mezi buňkami •pak dojde k remodelaci hostitelských buněk – např. formování vakuol •je ovlivněn viry i bakteriálními patogeny • •Virulenční faktory : •struktury umožňující patogenům dostat se do hostitele •překonat jeho imunitní systém •kolonizovat a využívat buňky hostitele •větsina je kódována plazmidy • • Patogenita bakterií a eukaryotický aktinový cytoskelet hraje roli při změnách (pohybu buňky a pohlcení bakterie) euk. CM při fagocytóze Intracelulární patogeni •interakce bakteriálních produktů s receptory CM za regulace cytoskeletu •nebo přímým vstupem produktů do buňky •mají ligandy reagující s receptory a translokují tak molekuly efektorů do cytoplasmy •bakterie tak svými produkty manipulují aktinový cytoskelet pro vlastní proliferaci • dojde ke stimulace polymerace aktinu a zvýšené fagocytóze bakterií •a tedy rychlému násobení počtu bakteriálních buněk ve tkáních • Extracelulární patogeni •naopak produkují substance vstupující do eukaryotické buňky • ty pak ničící síť aktinových vláken •to zabrání pohlcení a natrávení eukaryotickou buňkou •extracel. patogeni se přichytí pomocí podstavců, intra. pak se do buňky dostanou endocytózou •Enterotoxigenní E. coli (ETEC) •tzv. cestovatelský průjem • •4 typy fimbriálních struktur: •Fimbrie sensu stricto •Fibrily •Fimbrie typu 4 •curli Enteropatogenní E. coli (EPEC) •prujmovité onemocnění u dětí • ve vyšších dávkách i u dospělých • jejim vlivem dochazí k lézím a k polymerizaci aktinu a myosinu --> přestavba cytoskeletu • vytváří tzv. intimní adherenci = přilne velice blízko k povrchu pilu •dojde k přemístění receptoru Tir ke stěně střeva --> přestavba aktinu a myosinu --> tvorba podstavce --> pohyb bakterie, kolonizace •bakterie vylučuje EspC protein --> produkce toxinu •Enteroagregativní E. coli (EAEC) •průjem a zvýšená teplota, děti i dospělí • •ke kolonizaci dochazí díky agregativní adherenci •tato E coli donutí enterocyty k tvorbe slizu •plazmid pAA kóduje fimbrie agregativní adherence •Extraintestinální E. coli • •tato e coli není primárně ve střevech •často jsou v mocových cestách, v krvi • •způsobují novorozenecké meningitidy •hrají roli v nozokomiálních nemocích • • • • • • • • • •mají hodně virulenčních faktorů : • • bičiky, fimbrie • produkce exotoxinů, membr. vázaných toxinů • siderofor • (váže železo z host.buněk – Fe pak stimuluje růst bakterii) • DĚKUJI ZA POZORNOST