•Základní (esenciální) - CM, ribozomy, nukleoid • Obvyklé - tvoří se pouze v závislosti na podmínkách (kromě BS - není u mykoplazmat) • – nejsou nutné k přežití buňky, poskytují výhodu Struktury prokaryotické buňky Základní struktury •Cytoplazmatická membrána •Nukleoid •Ribozómy •Buněčná stěna •Organely pohybu •Fimbrie •Plazmidy •Kapsuly, slizy •Inkluze Obvyklé struktury - nejsou nezbytné chrání proti vyschnutí, maskuje antigeny, proti fagocytoze... •v nich odpadní nebo zásobní látky •polyhydroxyburát - vznik za nepříznivých podmínek - nedostatek živin •Karboxyzomy - fixace uhlíku •parasporální krystal - obsahuje endotoxiny > působí proti hmyzu...má ho třeba bacillus-musi se dostat do střev, aktivují se endotoxiny --> hmyz zemře Cytoplazmatická membrána •Fluidní vrstva fosfolipidů, vnořené bílkoviny – mnoho proti Eucarya •jednoduchý řetězec, esterová vazba Bacteria, Archaea – etherová v. !! •semipermeabilní – transport, respirační funkce (zastupuje mitochondrie), zakotvuje rotor bakteriálních bičíků • •G- mají plazmatickou membránu a vnější membránu oddělené periplazmatickým prostorem •Ost. prokaryota pouze vnější CM •Někt. mořské sinice plazmatické membrány bez fosfolipidů – náhradní membránový lipid - SQDG •V oceánech s nedostatkem fosforečných a dusíkatých živin GG- buňky Lipid A (toxin) Buněčná membrána obsahuje různé biologické molekuly, především lipidy a proteiny Lipidy –složení do urč.míry podle výživy a typu prostředí Hopanoidy – lipidy u 50% bakt., obdoba euk. Sterolů Cytoplazmatická membrána obsahuje tři třídy amfipatických lipidů: fosfolipidy, glykolipidy Proteiny Proteiny pevně vázané – enzymy (ATPáza, nukleáza, fosfatázy), transportéry, strukturální proteiny • Volné proteiny – fosfatázy • Inducibilní složky membrány – přítomnost - nutný spouštěcí faktor syntézy= spektrum proteinů proměnlivé Lipoproteiny – lipid do periplazmy Glykoproteiny a glykolipidy – orientovány cukernou složkou vně membrány Lipopolysacharidy G- •Vrstva lipidů – 5 nm, cca 50 atomů •Bariéra, brání úniku obsahu bunky •Semipermeabilní, selekt. permeabilní •Živiny dovnitř, odpady ven – selektivní kanály, pumpy –proteiny (import, export spec. látek) •buněčná adheze, výměna iontů a buněčná signalizace – reakce na prostředí •cílová struktura pro extrabuněčné struktury - buněčná stěna, glykokalyx • •Cytoplazmatická membrána může být uměle vytvořena - micely •Růst, tvar buněk – mění se i membrána přidáním složek •Tendence držet tvar, zacelovat trhliny • •Prokaryota – jen CM (eukaryota – i vnitrobuněčné membrány), princip stejný • Invaginace - membránou obdány i některé typy inkluzí (glykogen, PHB, S, •plyn. vakuoly, karboxyzomy) – 1 vrstevná! • • Fosfolipidy •dvojvrstva, nepropustná, samouspořádávání •hlavní silou formující lipidovou dvojvrstvu hydrofobní interakce, dále van der Waalsovy síly, elektrostatické, hydrogenní a nekovalentní interakce •fosfatidycholin • • •hydrofilní hlavička se orientuje k vodě a je spoj. se zbytkem molekuly přes fosfátovou skupinu •hydrofobní uhlovod. konce jsou nenabité, nepolární, orientace k jiným nepolárním l. •amfipatické l. •lipidové dvojvrstvy jsou v zásadě nepropustné pro polární molekuly, připouští pasivní difúzi hydrofobních molekul •voda se uspořádává kolem nich – spotřeba E Fosfátová skupina vázaná na glycerol 1) 1) 2 mastné kys.vázané na glycerol CM - 2D kapalina – fluidní mozaika •samozacelovací schopnost – trhliny vytv. rozhraní s vodou – nevýhodné, snaha zacelit •lipidy neopouští vrstvu kvůli vod. prostředí kolem, ale mohou měnit místa •Teplo - pohyby molekuly – otáčení kolem osy, výměna pozic mezi sousedy – podporuje difuzi •sniž. Teplota – nižší E , nižší rychlost výměny pohybu lipidů v membráně • •stupeň fluidity – závisí na T a fosfolipidech – čím těsněji se řetězec může sbalit, tím viskóznější bude •délka a stupeň nenasycenosti řetězců mastných kyselin •nenasycené lipidy vytvářejí ohyby - vzrůst fluidity membrány •mastné řetězce fosfolipidů a glykolipidů – cca 14 – 24 at.uhliku •kratší řetězce zvyšují fluiditu - méně interagují navzájem • •bakterie a kvasinky – snaha udržet konst. fluiditu CM •homeovisciózní adaptace - schopnost organismu regulovat fluiditu buněčné membrány změnou složení lipidů •délka a složení řetězce se mění v záv. na T prostředí •Vys. T – produkuje delší řetězce a méně dvoj. Vazeb • • •Asymetrické složení membrány •Obe vrstvy se liší počtem a slož. fosfolipidů, důl. i orientace kanálů •Nové fosfolipidy jsou synt. enzymy z mast kyselin •uvolňují se do té samé monovrstvy, pak dochází přeskupení •Flipázy – přenos selektivní – r. koncentrace fosfolipidů v k. monovrstvě • •Flexibita – sch. se ohýbat – spodní hranice 25 nm – min. pro tvorbu váčků • • Proteiny • membrána obsahuje velké množství proteinů, typicky kolem 50 % membránového objemu •různé biologické aktivity, mezibuněčná komunikace, enzymatické aktivity nebo transport látek přes membránu •velké množství proteinových receptorů a identifikačních proteinů, např. antigeny • • • • • • • • • • • • • •Integrální proteiny nebo transmembránové proteiny •Prochází skrz CM •hydrofilní cytosolická doména (interaguje s vnitřními molekulami) •hydrofilní extracelulární doména - interaguje s vnějšími molekulami •hydrofobní doména - ukotvuje uvnitř buněčné membrány •hydrofobní domény se skládají z α-helix a β listů proteinových motivů •hydrofobní vazby cca 70% •daná orientace v membráně •Iontové kanály, protonové pumpy • • • Periferní proteiny •Spojené s integrálními membránovými proteiny •dočasné interakce s biologickými membránami a jednou reagující molekula se odloučí a pokračuje ve své práci v cytoplazmě •spojeny s intergralnimi za pomoci H-mustku a elektrostat.sil • Proteiny ukotvené s lipidy •kovalentně vázané na lipidové molekuly hydrofobně vložené do buněčné membrány •Proteiny nejsou v kontaktu s membránou •elstat.síly, H-můstky •G proteiny – přenos signálu •Funkce cytoplazmatické membrány • •Bariéra, receptory, antigeny •Transport – prostá difúze, zprostředkovaná difúze, aktivní transport • • •CM v podstatě nepropustné pro polární molekuly •brání v difúzi polárním rozpuštěným látkám (AM, NK, cukry, proteiny, ionty) • •připouští pasivní difúzi hydrofobních molekul •Tj. schopnost kontrolovat pohyb těchto látek skrz transmembránové proteinové komplexy - póry, kanály a brány •Propustnost membrány je míra pasivní difuze molekul membránou •závisí hlavně na el. náboji, polaritě molekul a na mol. Hm. molekuly • membrána je hydrofilní - malé neutrální molekuly projdou skrz membránu snáze než nabité, velké molekuly •Transmembránový transport - pasivní •přenos látek přes buněčnou membránu •samovolně prostřednictvím kanálů a přenašečových proteinů •nespotřebovává energii ATP •řízen gradientem koncentrace a membránovým potenciálem •gradient elektrochemického potenciálu = rozdíl elektrochemických potenciálů na vnější a vnitřní straně membrány •hnací sílou pro pohyb iontů přes membránu •závisí na propustnosti buněčné membrány •prostá difuze, zprostředkovaná difuze, osmóza • • •1) Prostá difúze •transport látek po koncentračním spádu •Plyny (N2, O2, CO2), malé polární molekuly bez náboje (etanol, voda) •umožňuje pohyb látek uvnitř buněk a tím látkovou výměnu • • • 2) Zprostředkovaná difúze •Přenos látky po elektrochem. gradientu přenašečů v membráně •tyto procesy fungují i při aktivním transportu • kanály - hydrofilní pór, který pro přenos specifických anorganických iontů nepotřebuje změnit svou konformaci •způsob přenosu rychlejší než typ předchozí •protein může být svou konformací otevřen či uzavřen • proteinové přenašeče využívá pro přenos solutu svých konformačních změn - umožňují přenos malých ve vodě rozpustných molekul •Kapacita přenašeče je limitována •koncentrace difundované látky nejprve stoupá rychlost difuze se už rychlost difuze nemění •využíván pro transport látek spojených s metabolismem buňky a dalších látek potřebných pro fungování buněk • např. aminokyseliny, proteiny, ionty větších rozměrů • • •Uniport - transportované molekuly procházet samostatně •Kotransport - symport a antiport •Symport - prostupují molekuly stejným směrem •Antiport - prostupují směrem opačným Msc channels • mechanosensitivní – reagují na zvýšení •turgoru buňky zvětšením velikosti póru • adaptace na osmotický stres - MscL – E. coli • KANÁLY prosté •stále otevřené válcové struktury s centrálním vodním kanálem •neregulovány • př: poriny β vnější membrány - maltoporin umožňující difúzi maltodextrinů, aquaporin Maltoporin v komplexu s maltodextrinem (6 Glu jednotek Dimer GramicidinuA tvoří kanálek Pro transport Iontu K+ KANÁLY hradlové •mají schopnost se otevirat a uzavirat •polypeptid.retezec tvori hrdlo, ktere je specificky otevirano •pomocí vazebných míst rozpoznávají ionty •mají specifitu hradlo regulováno: napětím, chemicky, mechanicky •specifické iontové kanály slouží pro rychlý průchod iontů jako Na+, K+a Cl- • Př: K+ pasivně difundují z cytoplasmy do extracelulárního prostoru přes transmembránové proteiny - tetramery řízené el. polem • • •Aktivní transport •aktivní transport vede ke kumulaci látky, transport •I proti koncentračnímu spádu za spotřeby ATP • •ATPáza (adenosin trifosfatáza) •enzym, katalyzuje hydrolýzu ATP na ADP a fosfát •energie vzniklá zmíněnými defosforylacemi se užívá k pohánění jiných chemických reakcí •např transport iontů přes membránu • • I)primární akt. transport •zdroj energie nesouvisí s dalším průběhem přenosu •je zapotřebí přítomnost volné energie •pouze jedna částice (např. na Na+/K+ ATPáza, která současně čerpá sodík z buňky a draslík do buňky) • •ABC transportéry – motivy vážící ATP a štěpící jej při příjmu látky •bakterie stovky typů pro transport •ABC transprortéry jsou schopné přenášet přes membránu sacharidy, aminokyseliny, lipidy, ionty, peptidy i proteiny, toxiny a léky včetně antibiotik •Př: (E. coli tak přijímá vit. B12 z prostředí), export toxinů • •Primární aktivní transportéry se dají klasifikovat na základě způsobu získávání potřebné energie: •hydrolýzou ATP – vyskytují se ve všech doménách •dekarboxylací –v prokaryontních organismech •přenosem methylové skupiny – vyskytují se u archeí •oxidoreduktázou- zdroj energie je oxidace redukovaného substrátu •světelnou energií- vyskytují se u archeí • Během činnosti ABC transportéru MsbA se periodicky mění jeho prostorové uspořádání Bakteriální ABC transportér pro vitamín B12 •II) Sekundární • •zdroj energie - spřažení s přenosem jiné látky ve směru koncentračního gradientu •energie uložená v gradientu je využita k přenosu druhé částice proti směru koncentračního spádu (symport, antiport) •proces spojen se změnou koncentrace na membráně •sodno-draselná pumpa •která udržuje koncentrací rozdíl sodíku a draslíku mezi intracelulárním a extracelulárním prostředím tím, že vyčerpává sodík z buňky a naopak vychytává draslík •antiport sodíku a draslíku proti koncentračnímu gradientu – u sodno-draselné pumpy je zdrojem energie ATP 3 Na+ (in) + 2 K+ (out) + ATP + H2O  3 Na+ (out) + 2 K+ (in ) + ADP + Pi •Skupinová translokace • méně častá •při transportu substrát chemicky modifikován (dostane se do buňky a zůstává v ní) •př: fosfotransferázový systém •fosforylace substrátu; akumulace PEP (přináší do buňky cukry proti koncentračnímu spádu) • • • • • • • • • • • •Vysokoenergetická fosfátová skupina je z fosfoenolpyruvátu přenesena na glukózu za tvorby glukóza-6-fosfátu Buněčná stěna •součást buněčného skeletu •dává buňce tvar •mechanickou ochranu •ochraňuje před zářením, vyschnutím, chemickým poškozením •stěna kompenzuje osmotický přetlak uvnitř buňky • •Peptidoglykan (murein) •peptidova slozka - tetrapeptid - alanin, kys glutanova, nejaky zbytek • (G+ = lyzin; G- =diaminopimelová kys.) a zase alanin •Glykan – cukerná složka, NAG, NAM (N-acetylglukózamin+N-acetylmuramová k.) •Peptidoglykan = uniformní disacharid •N-acetylglukózamin + N-acetylmuramová Tetrapeptid L- a D-AMK Spojení: rozdíl v pozici 3 Interpeptidový můstek u G+ Acidorezistentní mykobakteria, nokardie.. nebarvitelné Gramem: N-glykolylmuramová ! •Peptidoglykan G+ G+ : tetrapeptidy spojeny pentapeptidem G- :tetrapeptidy spojeny přímo D-ala na DAP G- •vrstvami polysacharidových řetězců, v němž se střídá N-acetylglukosamin a N-acetylmuramová kyselina •Spojeny O-glykosidovou vazbou - lze narušit například působením lysozymu •Zbytky kyseliny N-acetylmuramové vytváří vzájemné propojení řetězců pomocí krátkých peptidů (tetrapeptidy) - tj. transpeptidace •Na proces transpeptidaze působí antibiotika jako peniciliny a cefalosporiny Polymer Spojení tetrapeptidů různé u G+ a G- •Lysozym – štěpí vazbu mezi aminocukry = působí na hotovou stěnu •Penicilin – brání spojení tetrapeptidů = působí při syntéze stěny •Bacitracin - cyklický polypeptid blokující defosforylaci fosfolipidu, potřebného pro transportní funkci během výstavby buněčné stěny Taxonomický význam BS • Barvení buněčné stěny • Chemotaxonomie složek stěny a membrány •Aminkokyselinové složení tetrapeptidu a můstku!! Micrococcaceae •až druhově •charakteristická struktura můstku Streptomycety •3 pozice unikátní L-amino DAP kyselina Stěna spory: jiné a unikátní složení peptidoglykanu •jedny z nejmensich prokaryotic.organismu •jsou pleiomorfni (koky, kokotycky, tycky) •nektera mykoplazmata tvori pouzdra •nektera tvori výběžky (zejména patogennni druhy) --> adheze na hostitelskou bunku • •jsou rezistentni na ATB ktere pusobi na BS (logicky - ptz nemaji BS - neumi syntetizovat peptidoglykan) • • Mykoplazmata •Během evoluce se objevily mnohonásobné redukce velikosti genomu •Pozměněn i genetický kód •tempo evoluce je vysoké •redukce velikosti genomu - evoluce Mollicutes na striktní parazity •velká část metabolické mašinérie zakrněla • • mykoplazmata -nejmenší známý mikroorganismus schopný samostatného života u člověka izolovano asi 11 druhu •M. pneumoniae je nejvýznamnějším •patogenem lidského respiračního systému •(faryngitis, tracheobronchitis, bronchitis, •bronchiolitis, pneumoniae, pneumonitis, •otitis acuta, bulózní hemorrhagická •myringitis) •detekuje se serologicky - pritomnost protilatek • •M. hominis vyvolává např. lidskou primární atypickou pneumonii •urogenitalni trakt u zen-zavazne oporodni a opotratove horecky, poskozeni plodu, zevni genital-loziska •Zacina byt rezistenti vuci erytromycinu (ATB)!!!!!!!! • •M. genitalium, M. urealyticum • • Mycobacterium tuberculosis – patogen člověka Mycobacterium africanum – patogen člověka Mycobacterium bovis - patogen skotu i člověka •Mycobacterium - Acidoresistentní bakterie •nebarvitelne Gramem!!! •proto unikalo Mycobacterium tuberculosis •barvi se specialnim acidorezistentnim barvenim • •toto barveni se pouziva, ale castejsi je molekularni zjistovani • •Hydrofobní buněčná stěna •problém s transportem Fe •siderofory – chelatizují Fe - exocheliny – extracelulární •mykobaktiny – uvnitř buňky • •Pomalý růst – 3-9 týdnů •zpomalení transportu přes hydrofobní povrch •RNA-pol – nižší reakční rychlost (pomalejší syntéza RNA) •nízký poměr RNA/DNA – pomalejší syntéza proteinů • • •Interakce s povrchy – biotickými i abiotickými •Bakterie evolučně úspěšné – kolonizují všechny niky... •jeden z faktorů virulence • •Adheze •poskytuje mikroorganizmům výhodu v přežití •lepší dostupnost a využitelnost substrátu •adsorpce makromolekul a malých hydrofobních molekul na povrch •lepší využitelnost koncentrovaných živin •ochrana před inhibičními účinky antibakteriálních látek • (antibiotika, chlor, těžké kovy) •ochrana před bakteriofágy a parazitickými bakteriemi •nevýhody – př. potlačení pohyblivosti • Adheze bakterií •Vsuvka: Cytologie buňky a virulence •Patogenita – schopnost organizmu způsobovat onemocnění •Virulence – stupeň patogenity – míra schopnosti organizmu infikovat a způsobovat onemocnění • • Faktory virulence = struktury/složky buňky •faktory adheze •extracelulární enzymy – invazivní faktory (hyaluronidáza, kolagenáza, koaguláza, kinázy, keratináza, mucináza) •faktory zabraňující fagocytóze (kapsuly, produkty metabolizmu) • •endotoxin - uvolněn až po zániku buněčné stěny bakterie • =lipopolysacharid (LPS), vnější membrány gramnegativních bakterií •Lipid A – tvoří lipidovou složku endotoxinu zodpovědnou za toxicitu •exotoxin - toxin uvolňovaný bakteriemi do okolí Exotoxin - botulotoxin Endotoxin = LPS A Adheze bakterií a indukce cytologických změn •k adhezi je potreba kompatibilita mezi bakterii a cilovou molekulou... jako klic do zamku.. •staří, prostredi, adheze - toto urcuje tvar bunky • •ptz k adhezi potrebuje receptory - meni tvar bunek • •„surface sensing“ ne všechny buňky na všechny povrchy •vhodné receptory a kompatibilita s cílovou molekulou •(Corynebacterium diphtheriae epitel hrdla; Streptococcus salivarius– zub, chlopně...) •hydrofobicita buněčného povrchu (hydrofobní MO formují biofilmy) Interakce buňky s povrchem indukuje změnu exprese genů •buněčné morfologie • motility a adheze - souvislost mezi cytologickými znaky a proměnlivými formami existence buňek •Blízkost bakteríí k povrchu vyvolává změny v ph, osmolalitě a rotaci bičíků Buňka •pilli, povrchové proteiny, kapsuly a sliz •Prostředí – náboj, hydrofobicita, topografie povrchu •vystavené různé chemické skupiny reagují s fyzikálně chemickými vlastnostmi buňky •Bioenergetika, technologie (fermentory), znečištění, •bioremediace, biofilm, infekce •Budoucí výzkum: ovlivněním buněčné adheze modulací •hydrofobicity buněk; vývoj nepřilnavých materiálů •biofilm - zubni povlak (casto oportunní patogeny) Adheze bakterií - význam Bakterie a hostitelský makroorganizmus adheze bakterií biofilm •Zubní povlak •– A. van Leewenhoek (kys. - mléčná, máselná, propionová, octová, mravenčí) • •Střevní sliznice •Infekce •– sliznice nebo uvnitř tkáně; •- endokarditida •- trvalý biofilm na chlopních •(hl. strepto- a stafylokoky; •nebezpečí krvácivých dásní..) •- rány; bércové vředy; spáleniny Biofilm a medicína •Cévky – arteriální, žilní •Močové katetry •Dýchací a dializační přístroje •Umělé chlopně •Kontaktní čočky •Děložní tělísko • •Bakterie jsou unášeny proudem krve a mohou začít infekční proces na odlehlém místě…. • Nemusí být kontakt s vnějškem! - kovové náhrady kloubů •Stafylokoky – fibronektin-binding protein.. •pseudomonády, E. coli, streptokoky, aktinomycety… •Vytrvalá syntéza a uvolňování toxinů… Biofilm skloviny 700 kmenů z 18ti rodů Mezibuněčný kontakt – role adhezinů (lektiny) a receptorů (sacharidy) Kontak s povrchem zubu – pelikula proteinů, lektiny... (Rickert et al. 2003) •Adheze: Střevní mikroflóra •Střevní mikroflora: 10 14 CFU/ml •napomaha traveni •tvorba vitaminu •brani patogenum k prilnuti • • •bifidobakterie, kvasinky... tenke strevo •clostridie, enterobakterie (E.coli), matanogenni archaea...stluste strevo • • Proměna s věkem, dietou (polysacharidy; prebiotika..) •imunitou, hygienou a ATB léčbou •kdyz se narodi dítě - je uplne sterilní - az s tim jak prechazi na stravu, prorezavaji se zuby --> ztrata sterility, do tela mnoho bakterii • • •Poměr populací – „přínosná mikroflora“ vs. anaerobní •mikroflora jako clostridia... •Alterovaná střevní mikroflora – obezita, cukrovka, záněty, •metabolické poruchy •predevsim bakterie mlecneho kvaseni!!! •kompetice s patogeny o prostredi--zlepseni laktozove tolerance, snizeni hladiny cholesterolu, posileni vrozene imunity, smirneni symptomu na alergeny (snizeni alergie) • Střevní mikroflora a probiotika Funkční potraviny: bakterie mléčného kvašení, fermentace zeleniny •metabolizmus, produkce vitamínů, zábrana adheze patogenů, modulace imunity – alergie, bakteriociny • probiotický efekt – kmenově specifický (genetické inženýrství – konstrukce vhodných kmenů...) • živé vektory a nosiče vakcín – protektivních antigenů Mikroorganismy používané jako probiotika •Další funkce probiotik Produkce bakteriocinů x patogenům Produkce EPS – biofilm – quorum sensing Produkce biosurfaktantů – antimikrobní aktivita proti pg, snížení adheze pg Produkce antioxidantů – vychytávají volné radikály (superoxidové anionty, hydroxylové radikály) Prebiotika jsou nestravitelné oligosacharidy, které stimulují růst anebo aktivitu určité bakterie nebo skupiny bakterií, které mají pozitivní účinek na lidské zdraví Inulin, oligofruktóza, galaktooligosacharidy a laktulóza splňují všechna kritéria prebiotika Cílovými mikroorganizmy pro prebiotika jsou hlavně bifidobakterie