CYTOLOGIE A MORFOLOGIE PROKARYOT 3 Nukleoid, ribozomy, inkluze Nukleoid •oblast, kde se nachází dvoušroubovicová (ds) kruhová molekula DNA - chromozom •složen ze 60 % z DNA, dále z proteinů a RNA •z proteinů jsou nejčastější transkripční faktory – enzymy pro replikaci a expresi •z RNA především mRNA •transkripční faktory netvoří nukleozomy (jako u Eukaryot) • •obsahuje ještě tzv. plazmidy - menší cirkulární dsDNA, mají různé funkce •např. přenos DNA z donorové bakterie na recipientní při jejich konjugaci (F-plazmid) •nebo obsahují geny kódující enzymy schopné modifikovat antibiotika - exprese se pak projeví jako rezistence na příslušná antibiotika (R-plazmidy) • •kondenzace do kompaktní struktury • HLP (histon-like) proteiny asociované s DNA napomáhají skládání NK • vysoce konzervované u eubakterií Superhelicita = nadšroubovicové vinutí, terc. struktura •závity přitaženy: negativní superpoiling (fyziologický stav) •závity rozvolněny: pozitivní s., relaxovaná podoba DNA – spotřeba ATP Enzymy topoizomerázy (štěpí 2 řetězce) • např. gyráza - umožňuje měnit tzv. terciární strukturu (supercoiling) DNA (vytváří negativní supercoiling, aby se DNA udržovala co nejvolnější a bylo snazší ji rozplést během replikace) • DNA je zákonitě stočena do kliček a nadšroubovic •nukleoid není od cytoplazmy oddělen jadernou membránou •na několika místech je fixován k cytoplazmatické membráně Strukturní organizace DNA Genom prokaryot •zpravidla cirkulární ds DNA, ale někt. mikroorganismy mají i více než 1 chromozom •lineární – Borrelia, Streptomyces, Coxiella, Paracoccus denitrificans •více než 2 oddělené chromozomy – Vibrio cholerae, Borrelia burgdorferi •velikost genomu cca 0,6 – 10 Mbp, E. coli – 4,1 Mbp, 0.58 Mbp Mycoplasma genitalium, 4.4 Mbp Mycobacterium tuberculosis •průměrná hmotnost: 5 . 10 – 15 g DNA • •G+C obsah (melting point) je taxon. specifický: 28% (Clostridium) - 72% (Sarcina) •geny nejsou členěny na exony a introny = proteosyntéza probíhá velmi rychle •vysoká frekvence mutace • •NCBI – databáze sekvenovaných genomů • https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ Genom •haploidní chromozom •páry bazí A-T, C-G: •neplatí paradox hodnoty C •replikace předchází dělení buňky •reprodukce – asexuální = tvorba klonů... •změna sekvence – rekombinací nebo mutacemi Paradox C hodnoty = velikost genomu nesouhlasi s komplexitou organismu (u eukaryot neplatí, že čim větší genom, tím je organismus vyspělejší... http://www.osel.cz/5327-paris-japonica-pokorila-bahnika.html První sekvenovanýmikroorganismus: Haemophilus influenzae (1995 by The Institute for Genomic Research) Počet genů: 575 – 5500.. High coding densities....vetšina genů kodujících (Člověk 3 mld bp a 23 000 genů) Genetická informace •velikost genomu závisí na živ. strategii •„specialisté“: ~1,5 MBp •„generalisté“- ~4 – 8 MBp ze strukturních genů •obsahuje jen málo NEkodujících oblastí (12%) Složky genomu: •chromozom •plazmidy – F, R, Ti, Col - col plazmidy - tvoří látku s ATB účinkem •mobilní elementy: transpozony, inzerční konjugativní plazmidy •mobilizatelné plazmidy - jsou schopné přenosu jen za účasti konjug.plasmidu - epizomální integrace plazmidu do chromozomu hostitele Profágy •r. způsoby přenosu •transformace, konjugace, transdukce • Replikony •geny, které majici společný promotor, jsou přepisovány současně a regulovány stejným operátorem... • • Adaptace •genom kóduje, ale vyvíjí se, mění se… • •po několika miliardách let evoluce adaptace na různé typy živ. prostředí •a) evoluční adaptace •b) regulace metabolizmu v daném momentě • • vývoj ochranných látek chránících proteiny a NK (unikátní chem.struktury) •př: dipikolinová, “histon – like” proteiny, HS proteiny…) • •místa ori (počátek) a ter (konec) •charakter replikonu - zacatek replikace v ORI, konec v TER •polymeráza jede vždy od 5 k 3 konci •semikonzervativni replikace – tzn. v nové molekule je jedno vlákno mateřské, druhé de novo •semidiskontinuální repl. - jeden řetězec je vedoucí, druhý spožděný (okazakiho fragmenty - důležitá je syntéza primeru - pomocí enzymu primázy) •prodlužování buňky •nová replikace ještě před úplným rozdělením buňky.. •dalsi enzymy:primaza, helikaza, dna polymeraza, topoizomerazy •primáza + helikáza tvoří primozom •vznik primeru není náhodné - v úsecích 1000-2000 párů bází Replikace gen. informace Transkripce •přepis DNA do mRNA •enzym RNA polymeráza •na úrovni mRNA se ovlivňují proteiny, které vzniknou v buňce •pokud b.nepotřebuje protein - vypne transkr.t oho genu->hladina mRNA je různa •reverzni transktipce - naopak (z mRNA do DNA) - reverzni transkriptaza, např u retrovirů •RNA-polymeráza – 5 podjednotek •syntéza 1 mRNA trvá 1 min, nejsou postranskripční úpravy •různá hladina mRNA = různá hladina proteinů •evolučně konzervované, podobná eukaryotické (rozdíly ve složení genů, prokaryotická je spojena s translací) Translace •z mRNA do polypeptidového řetězce za účasti AMK probíhá na ribozomech •na jednom vlákně mRNA může být více ribozomů, translace probíhá současně Průběh translace: •Iniciace translace •Elongace polypeptidového řetězce •Terminace translace • selektivní působení někt. ATB pouze na bakteriální ribozomy •Archea – odlišnosti, větší resistence na ATB (proteosyntéza je inhibována anisomycinem ) Ribozomy •ve vysokých počtech v cytoplazmě všech známých buněk • •funkcí je tvorba proteinů - proteosyntéza • •z řetězce RNA je syntetizován polypeptid • •velké komplexní struktury, složeny zejména z rRNA a proteinů • •dvě podjednotky, menší a větší • •k ribozomu se napojuje mRNA, která obsahuje přepis genetické informace • •pořadí trojic bází určuje aminokyseliny (AMK) napojené na tRNA • •tyto AMK jsou dále spojeny v jeden polypeptid – protein, který po úpravách plní svou funkci v organismu Struktura ribozomální podjednotky: 70S = 30S + 50S (Svedbergovy jednotky) (sedimentaci vedle hmotnosti ovlivňuje i konformace) 30S………..1540 nukleotidů, 21 proteinů 50S………..2900 nukleotidů, 34 proteinů E – místo exitu tRNA P - peptidylové vazebné místo A - aminoacylové vazebné místo 3 místa na ribozomu: •Aminoacylové misto - do něj vstoupí tRNA s AMK •Peptidilové místo - tRNA na kterem vzniká polypeptidový řetězec •Místo EXITu - odchazi tRNA ktera odevzdala AMKyselinu Prostorově i časově regulováno – tato všestrannost zabezpečuje morfologickou potažmo fyziologickou diferenciaci v procesu buněčného cyklu! a) statická skupina proteinů - precizně lokalizovaná, proměny jen na bázi podjednotek (integrální membr.proteiny…) b) proměnlivá – díky cytoskeletu a pohybu proteinů „diffusion-and-capture“ (Rudner, 2002), sítě dynamických interakcí Buněčná organizace proteinů v buňce: Transport proteinů translokony - proteiny v CM (cyt.membráně) •tvoří kanál •na něj přímo naváže ribozom (membránové proteiny jsou přímo zabudovány) •nebo se na translokon naváže přímo na protein - translokon pak rozhodne, jestli se protein dostane ven nebo zůstane v buňce Zvláštnosti genomu některých bakterií Deinococcus radiodurans • 1956 (Arthur W. Anderson) – maso po radiaci... • přežil radiaci, která je 3000x silnějš než hodnota, která by usmrtila člověka • ionizující záření – zlomy obou řetězců NK -má reparační mechanizmy a DNA si opraví!!! • 2 lineární chromozomy, megaplazmid a malý plazmid http://www.genomenewsnetwork.org/articles/07_02/deinococcus.shtml Epulopiscium - výjimka v asexuální reprodukci •nejdelší známá bakterie, delší než 0,5 mm! • •střevní symbionti rybek Acanthuridae (bodlok) •polyploidie •uvnitř bakterie se vytvoří až 12 spor!!! •dozrají-->lýze bunky-->spory jsou aktivní!!! (ne dormantní) Azotobacter vinelandii • Schopen fixace dusíku • Metabolizuje mnoho uhlovodíků, org.kys a alkoholů • Počet chromozomů závisí na fázi buněčného cyklu • Exponenciální fáze: 2-4 kopie • Stacionární fáze – 50-100 Buchnera spp. • Vnitrobuněční symbionti mši (mutualismus) • velikost genomu – 7x menší než genom E. coli !! • 640 kbp • Chromozom + 2 plazmidy • Počet chromozomů však závisí na vývojovém stadiu mšice Agrobacterium tumefaciens • Gramnegativní, pohyblivé • Nádory rostlin • Přírodní genetický inženýr transformující svou DNA do buněk rostlin • 5,7 Mbp • 1 cirkulární + 1 lineární chromozom a 2 plazmidy • Tumor Inducing plasmid – zodpovědný za virulenci Tvořen vláknitými proteiny, udržují: •tvar buňky •polarita •buněčné dělení a segregace chromozomů a plazmidů • • jsou analogické cytoskeletárním strukturám eukaryotní buňky (3D strukturou, biochemickými vlastnostmi) Yu-Ling Shih and Lawrence Rothfield (2006): The Bacterial Cytoskeleton.Microbiology and Molecular Biology Reviews, p. 729-754, Vol. 70, No. 321 Bakteriální cytoskelet FtsZ analog tubulinu - protein buněčného dělení (filamentous-temperature sensitive protein Z) - strukt. podobnost – GTP vazebná doména (20% N-konec,nikoli Ckonec) -vyžadován pro start časné syntézy PG vedoucí k tvorbě mezivrstev MreB •analog aktinu - determinace tvaru buňky, prodl.stélky •kokovité buňky - chybí homology MreB genů - Crescentin •analog intermediálním filamentům •distribuce MreB genů v říši Bacteria ukazují, že nesférické buňky vlastní jeden nebo více těchto genů (L.J.F. Jones, R. Carballido-Lopez and J. Errington, (2001), Cell, 104, 913-922 22) •zkoumána podobnost - krystalická struktura proteinu MreB (T. maritima) vs. eukaryotický aktin •pomocí MAD (Multi-wavelength anomalous diffraction), EM •strukturálně jsou si podobné, i svou orientací •2 shod. podjednotky jako u aktinu - - - - Ent, Amos, Löwe (2007): Bacterial Origin of the mreB T. maritima další proteiny s vlastnostmi aktinu: •ParM (E. coli) •MamK (Magnetospirillum magneticum) •bakteriální cytoskelet a proteiny určující tvar buněčné stěny •jako MreC spolupracují při lokalizaci komplexů koordinovaně syntetizujících buněčnou stěnu •u tyček jsou dvě možnosti:k elongaci dochazí na pólech (u buněk které nemají rntb protein) nebo uprostřed 1) Polymerace tisíců mol. FtsZ 2) Formování prstence 3) Přídatné proteiny – min. 1 - ZipA (gamma-proteobact.) - FtsA (Firmicutes) 4) MinC a MinD proteiny 5) Determinace tvaru buňky - MreB, MreC, MreD, Mbl Růst BS při dělení MreC •je podstatný pro prostorovou organizaci složek holoenzymů periplazmy syntetizujících peptidoglykan MreB •řídí řídí lokalizaciprekurzorů peptidoglykanu v cytosolu •fluorescenční značení dokazuje, že MreB a FtsZ, MreC a RodA působí při syntéze peptidoglykanu •MreB a FtsZ jsou vyžadovány pro morfogenezi polární stélky FtsZ •reguluje prostorové umístění enzymu MurG produkujícího lipid II (prekurzor peptidoglykanu) •umístění FtsZ do kruhu během prodlužování buňky je následováno MurG •dojde k přesměrování syntézy prekurzorů peptidoglykanu do středu buňky •dochází k tomu před buněčnou konstrikcí • •za nepřítomnosti FtsZ se enzym MurG neakumuluje uprostřed buňky •buněčná elongace tedy pokračuje inzercí peptidoglykanu i po okrajích buněčné stěny •buňka tedy k elongaci využívá systém syntézy buněčné stěny závislý i neávislý na FtsZ •závisí na načasování uspořádání FtsZ během elongace buňky http://rum-data.nature.com/nrm/journal/v6/n11/fig_tab/nrm1745_F3.html?foxtrotcallback=true •zásobní látky •produkty metabolismu •uložené nepotřebné látky •bez membrány nebo s membránou - není dvojvrstvou fosfolipidů,jednovrstevná! •v cytoplazmě v podobě granul nebo kapének •svým charakteristickým vzhledem uvnitř buněk napomáhají identifikaci •produkce rekombinantních proteinů „zabalení“ a stabilizace proteinů, nahromadění • Inkluze Př: modely formování inkluzí PHA (polyhydroxyalkanoát) •protein v inkuzích je chráněn proti proteázám a navíc je čistý! •fůzní proteiny - nesou signalní sekvenci pro to, aby se rovnou do inkluzí dostaly.... •inkluze se dají rozpustit a dostat tak protein zpátky Imobilizace molekul v inkluzích protein of interest granule-associated proteins Following growth in conditions suitable for PHA synthesis... •rozvoj využití inkluzí jako katalyzátorů v průmyslu a biotechnologiích „surové inkluze“ •aktivita enzymů je v nich vysoká! •inkluze jsou snadno odstranitelné • • výhoda: •vysoký obsah proteinů •možnost agregace i rekombinantních proteinů (enzymů) bez jejich inaktivace - •viz např. výzkum doc. Stanislav Obruča , VUT Brno – bioplasty • Glykogen •počet 1-10 •zejména v Bacillu a Enterobakterií - pohotová rezerva energie •rozpustný polymer glukózy, silně větvený •až 50 % sušiny •může a nemusí mít membránu, v rámci rodu lze obojí zároveň •ve světelném mikroskopu není viditelný • barvení Lugolovým roztokem Inkluze s membránou PHB • kyselina polyhydroxymáselná • až 60% sušiny • viditelná ve světelném mikroskopu • odpadní produkt • vyskytuje se u aerobů: Bacillus, Pseudomonas Síra •viditelné kapénky amorfní síry •chemolitotrofní sirné bakterie - oxidace redukovaných sirných sloučenin = zdroj energie Př. granula elementární síry u Beggiatoa •oxidace sirovodíku primárně poskytuje elementární síru •síra je následně oxidována na sulfát Síru lze najít i u fototrofních sirných bakterií - zelených a purpurových • není zdrojem energie, ale zdrojem elektronů v procesu fotosyntézy!!! Plynové vakuoly •cylindrické aerosomy (45 – 200 nm) • sinice a planktonní bakterie (cca u 50ti rodů bakterií) • často purpurové a zelené sirné b. a halofilní Archea • plyny vznikající při metabolismu • u archeí napomáhají pohybu ve vodě • množství plynu závisí na teplotě a viskozitě • membrána z jedné vrstvy bílkovin •především u vodních org - nadnáší je •buňka je schopna regulovat obsah plynu --> pohyb •vakuola může prasknout, kdyz dojde k přeplnění •(je známo 14 genů, které tuto vakuolu kódují) Karboxizomy •mikrokompartment, tvar mnohostěnu •fixace uhlíku •koncentrují oxid uhličitý a enzym RuBisCo •u všech sinic •u některých chemotrofních bakterií schopných fixace uhlíku (nitrifikační bakterie a thiobacily) • řas jejich funkci nahrazuje pyrenoid • syntéza hexóz •obvykle 1-10 •za vhodných podmínek se počet zvyšuje A) Synechococcus karboxyzom B) –II- negativní barvení C) H. neapolitanus karboxyzom D) H. neapolitanus karboxyzom,negativní barvení Chlorobiové váčky •u fototrofních bakterií •zásobárny pigmentů – bakteriochlorofyl A,C a D a karotenoidy •nikoli reakce a vazba světla •přenášeny do chromatoforů, kde probíhá fotosyntéza •počet: 2-10, je závislý na aktivitě buňky •v těsné blízkosti cytoplazmatické membrány, ale ne spojeny Magnetosomy • krystaly oxidu železnato – železitého •orientace v magnetickém poli = magnetotaxe • vodní organizmy citlivé ke kyslíku - obaleny speciální membránou umožňující precipitaci Fe3O4 Inkluze bez membrány Krystaly parasporální •bioinsekticidy produkované bakteriemi Bacillus thuringiensis během sporulace •důsledek nadprodukce bílkovin tvořících obaly endospory •parasporální inkluze byly použity jako první bioinsekticid proti moučnému červu •i selektivní působení (až na druhy) https://www.researchgate.net/publication/225633057_Insecticidal_Protein_Crystals_of_Bacillus_thurin giensis Polyfosfátová granula = volutin •vznik při nadbytku ATP, zásobárna fosfátu •dobře viditelný pod mikroskopem •Kulovitá tělíska, až 500 molekul v řetízku – proto je nerozpustný ve vodě •nikdy není zdrojem energie •vazba mezi molekulami je energeticky bohatá a vyžaduje dodání energie •je katalyzována polyfosfát kinázou • •počet 1 – mnoho, podle metabolismu •vysoký počet je v době před přechodem do klidového stadia Slouží jako: •rezervoár fosforu •alternativní zdroj P (namísto ATP) při fosforylaci cukrů při jejich katabolismu • chelatační činidlo divalentních iontů •jako pufr při alkalickém stresu •jako regulátor při odpovědích na stres Pigmenty •produkty primárního i sek. metabolismu •produkovány v závislosti na stanovišti • •pokud jsou produktem primárního metabolismu – jsou bezpodmínečně potřeba (bakteriochlorofyl, karotenoidy) •využívají se při metabolismu nebo mají protektivní účinek či jiný ekologický význam (inhibiční účinky) •protektivní účinek – absorbuje světlo o určité vlnové délce, jsou syntetizovány až v rámci sekundárního metabolismu • absorbce UV záření, pufry při ničení kyslíkatých radikálů •je důležité např. u patogenů: fagocyty na ně nemohou toliko působit např. peroxidem vodíku! • •Př: karotenoidy Streptococcus B – závažný původce pneumonií a meningitid u novorozenců •zlatý karotenoid Staphylococcus aureus opět brání proti oxidačním reakcím imunitního systému •buňka může produkovat endo- (protektivní) i exopigmenty různých barev •řada pigmentů vzniká nadprodukcí látek. •lokalizace podle své úlohy: v cytoplazmě, v CM u fototrofů, v periplazmatickém prostoru, (v buněčné stěně u kvasinek), jako exopigmenty – ekologický význam (inhibiční agens, ATB) Nejčastěji vyskytující se pigmenty: • karotenoidy – endopigmenty u většiny buněk • bakteriochlorofyly a,b,c,d – anaerobní prostředí • prodigiozin – extracelulární, mikrobicidní účinek – bakterie a plísně • melaniny – hnědé, černé, tmavě červené - v závislosti na době kultivace • antokyany – sek.metab., barva závisí na pH • fenaziny - extracelulární, sek. metab., mikrobicidní účinek – bakterie a plísně (Erwinia) - např. u Pseudomonas - u patogenů jsou spojeny s virulencí - kolonizuje dýchací cesty u pacientů s cystickou fibrózou - u nepatogenních jim poskytuji kompetiční vyhodu např. v půdě • Př: Micrococcus flavocianus – žlutý endopigment a fialový exopigment - na MPA agaru jen žlutý endopigment - na glukozó-kvasničném agaru – oba pigmenty (faktory : pH prostředí? Kultivační medium? Stáří kultury? Endopigment? Exopigment? Mikrobicidní? Protektivní?) Úprava a využití bakteriálních pigmentů •potravinové doplňky – karoteny - retina, antioxidanty (melanin) •barviva v potravinářství •některé pigmenty fluoreskují •přírodní barviva textilií – akrylová vlákna, hedvábí, bavlna (vydrží míň), PE (míň), ... většina syntetických barviv obtížně degradovatelná a toxická! (obsah karcinogenních dioxinů) Př: žlutooranžové, červené a růžové pigmenty Chryseobacterium sp., Serratia marceseus, Chromobacterium violaceum https://bioplasticsnews.com/2020/01/23/textile-pigments-bacteria/ Slizy • polysacharidy •lépe odstranitelné, difúzní, neorganizované Pouzdra • kapsuly – mikro a makro •dobře organizované, rigidní, AMK nebo cukry Glykokalyx • ochrana před fagocytózou • před protilátkami • před vysycháním • před detergenty • vazba na povrch předmětů, tvorba biofilmu Struktury vně buněčné stěny Sliz •řídký difúzní neorganizovaný materiál •spojuje více buněk, snadno odstranitelný, nejčastěji polysacharid •může sloužit k pohybu ve vlhkém prostředí •sliz je méně organizovaný a méně přimknutý k BS, než kapsula - Kapsula – virulence •pouzdra dělíme na makrokapsuly a mikrokapsuly •MIKRO - jsou z bílkovin, polysacharidů a lipidů •MAKRO- z polysacharidů (streptococus), bílkovin (bacilus), celulosa.... makrokapsula bývá až 2x tlustčí nez samotná bunka •vždy převládá buď bílkovina nebo polysacharid •jeden druh až 60 druhů kapsulových antigenů •tvorba pouzdra ovlivněna složením media, prostředím… • kapsula způsobovat virulenci (patogeničnost) bakterií, např. E.coli, Streptococcus pneumoniae Negativní barvení - Streptococcus pyogenes TEM (28,000X) Glykokalyx • netvoří se v laboratorních podmínkách za dostatku živin •síťovina z vláken polysacharidů a glykoproteinů • umožňuje adherenci, která je málo až vysoce specifická • kationty umožňují spojení stejně nabitých buněk a povrchů •kdyz mají bakterie dost živin, glykokalyx se nevytvoří •adherence -> málo specifická (třeba přilnavost k zubům) i hodně specifická (např. v močové trubici) • Pochvy • výhradně z polysacharidů (rozdíl od pouzdra) •chemické složení a zbarvení druhově specifické •funkce je pouze podpůrná (mechanicky) • glukóza + kyselina glukuronová (Sphaerotilus) u jiných rodů např. fukóza •někdy i hydroxidy kovů – v malém množství (zbarvení; Fe, Mn, Cu; závisí na druhu) •Př: Sphaerotilus, Leptothrix - tvoří se u přisedlých mikroorganismů •(vytvoří trubkovité útvary, ve kterých se mohou bakterie volne pohybovat)