Bi8920 Pokročilé mikroskopické metody doc. RNDr. Jakub Neradil, Ph.D. Ústav experimentální biologie PřF MU Principy a postupy imunofluorescenčního značení buněk [USEMAP] Bi8920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 03 •imunocytochemie •typy protilátek a jejich výroba •postup imunofluorescenčního barvení Program přednášky: [USEMAP] Bi8920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 03 Nevlastní (vnější) fluorescence Přímá vazba fluorochromu na molekuly nebo buněčné struktury - sondy DNA, buněčná stěna, plazmatická membrána… mitochondriální aktivita - respirační vzplanutí, pH indikátory, membránový potenciál. Nepřímá vazba fluorochromu – značky navázání na imunoglobulin (protilátku) nebo úsek nukleové kyseliny, annexin V, phalloidin.. [USEMAP] Bi8920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 03 Imunocytochemie (ICC) / imunohistochemie (IHC) •soubor metod, které umožňují detekci antigenu v buňce nebo tkáni (in situ) • •pomocí značených protilátek [USEMAP] Bi8920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 03 Albert Hewett Coons, M.D. (1912 - 1978) •zakladatel imunofluorescence •použití fluorochromem značené protilátky [USEMAP] Bi8920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 03 Protilátky •patří do skupiny imunoglobulinů •třídy: IgA, IgD, IgE, IgG, IgM (u savců) •složení: 2x těžký řetězec (H), 2x lehký řetězec (L) •H řetězce: různé dle antigenních a strukturálních vlastností Ig -> podtypy (alfa, delta, epsilon, gama, mí) •L řetězce: lambda nebo kapa – různě, v závislosti na typu Ig •H a L – spojení disulfidickými vazbami, podíl na terciární struktuře, udržuje stabilitu Ig •nejčastěji pro imunofluorescenci IgG a IgM [USEMAP] Bi8920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 03 [USEMAP] Bi8920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 03 [USEMAP] Bi8920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 03 IgG obecný vzorec: gama2 lambda2 nebo gama2 kapa2 průměrná Mr = 150kDa, H = 50kDa, L = 25kDa domény - variabilní (V) a konstantní (C), velikost 80-120AA na N-koncích : L řetězec: 1x VL doména H řetězec: 1x VH doména na C-koncích : L řetězec: 1x CL doména H řetězec: 3x - CH1, CH2, CH3 [USEMAP] Bi8920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 03 VL a VH tvoří vazebné místo antigenu, v této části hypervariabilní oblasti – tyto se během reakce s antigenem dostávají nejblíže (0,2 - 0,3 nm) Struktura vazebného místa, která je unikátně charakteristická pro danou protilátku, se nazývá idiotyp -> každý klon protilátky má jiný idiotyp https://classconnection.s3.amazonaws.com/770/flashcards/1788770/png/hypervariable_loops134712079640 3.png [USEMAP] Bi8920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 03 Struktura – odvozena od enzymatického štěpení •papain- štěpí v pantové oblasti H řetězce vznik: Ø 2x monovaletních Fab (Fragment antigen binding) Ø 1x Fc (Fragment crystallizable) •pepsin – štěpí v C-koncové oblasti H řetězce vznik: Ø 1x bivalentní F(ab´)2 Ø zbytek Fc fragmentu je degradován 2 x [USEMAP] Bi8920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 03 [USEMAP] Bi8920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 03 IgM •pentamer, Mr=900kDa, 5x podjednotka po 180kDa •obecný vzorec (mí2 kapa2)5 nebo (mí2 lambda2)5 •struktura spojena řetězcem „J“ (15kDa) •stejné štěpení proteinázami jako IgG, vznik 10x Fab a Fc; 5x F(ab)2 •Fc - cyklický pentamer (340kDa) [USEMAP] Bi8920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 03 Imunitní odpověď •imunizace antigenem - vyrovnání koncentrace mezi intra a extravaskulárním prostorem •zachytávání antigenu v uzlinách •latentní (indukční) fáze – asi týden •první tvorba IgM – primární odpověď •později nebo po další imunizaci (booster)– převážně tvorba IgG – sekundární odpověď •různá délka poločasu - IgM = 4-6 dní, IgG = 3 týdny [USEMAP] Bi8920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 03 Polyklonální protilátky pro ICC •produkce různými klony B- lymfocytů •reakce s různými epitopy daného antigenu •nejčastější producent – králík (New Zeeland White rabbit) , koza, prase, ovce... [USEMAP] Bi8920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 03 [USEMAP] Bi8920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 03 Příprava polyklonálních protilátek •navržení a syntéza peptidu (antigen) •ověření čistoty hmotnostní spektrometrií a chromatografií •coupling – vazba s KLH glykoproteinem • •KLH – Keyhole limpet hemocyanin •plž (Megathura crenulata) •produkce vysoce imunogenního glykoproteinu KLH •dodá imunogenitu i peptidu https://encrypted-tbn2.google.com/images?q=tbn:ANd9GcQsy--4T_q3HyeEnuUDgyowQ590c0ZRZ6b0C-91iK7Uc1nf EKoa [USEMAP] Bi8920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 03 Příprava polyklonálních protilátek •imunizace – kontrola specificity vůči antigenu •získání séra [USEMAP] Bi8920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 03 Příprava polyklonálních protilátek •imunizace [USEMAP] Bi8920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 03 Ověřování afinity protilátky k antigenu metoda: dot-blot 1)na membránu nanesen antigen 2)kapka různě ředěné protilátky 3)detekce anti-králičí protilátkou konjugovanou s chromogenem [USEMAP] Bi8920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 03 Monoklonální protilátky pro ICC •produkovány pouze jedním klonem B-lymfocytů •všechny molekuly imunoglobulinu jsou totožné •reagují pouze s jedním specifickým epitopem na antigenu •nejčastěji myší •příprava pomocí hybridomů: fůze B-lymfocytu a myelomové b. [USEMAP] Bi8920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 03 Tvorba monoklonalních protilátek ~AUT0008 hybridoma3 hybridoma2 [USEMAP] Bi8920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 03 https://youtu.be/G3VT_PAqihU Bi8920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 03 První monoklonální protilátka (1975) •myší monoklonální protilátka – klon Sp1 (IgM) •proti SRBC (sheep red blood cells) •fůze myších buněk z myelomu a sleziny [USEMAP] Bi8920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 03 Konjugace protilátky s fluorochromem vazba přes aminoskupinu, vznik amidu [USEMAP] Bi8920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 03 •vazba přes thiolovou skupinu (-SH) •nutné v redukujícím prostředí – porušení disulfidických vazeb •vyšší senzitivita konjugátu – specifičtější místo značení • Konjugace protilátky s fluorochromem [USEMAP] Bi8920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 03 Přímá vs. nepřímá imunofluorescence •přímá imunofluorescence – původní metoda (1942) •přímá vazba protilátky s fluorochromem na antigen •rychlá, méně univerzální, nižší intenzita signálu •využití pro flow-cytometrii • fluorochrom imunoglobulin epitop antigenu [USEMAP] Bi8920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 03 Přímá imunofluorescence a)značená protilátka od dodavatele b)vlastní označení zvolené protilátky vybraným fluorochromem rapid1_35 Innova Biosciences, Lightning-Link® [USEMAP] Bi8920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 03 Nepřímá imunofluorescence dvoukroková 1)primární protilátka x antigenu 2)sekundární značená protilátka x primární protilátce •univerzální, více primárních protilátek z jednoho organismu lze kombinovat s jednou sekundární protilátkou •vyšší citlivost - na I. Ab více rozeznatelných epitopů, více navázaných molekul II. Ab [USEMAP] Bi8920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 03 Základní postup imunofluorescenčního barvení buněčných kultur 1)fixace 2)permeabilizace 3)blokování nespecifických vazeb 4)inkubace s protilátkou / protilátkami 5)counterstaining (detekce DNA) 6)montování [USEMAP] Bi8920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 03 Základní postup imunofluorescenčního barvení tkáňových řezů 1)parafínové řezy (±4 mm) na podložním skle 2)deparafinizace – xylen 3)rehydratace – sestupná alkoholová řada 4)reaktivace antigenů (antigen retrieval) v tlakové komoře při vyšší teplotě (97°C) 5)blokování nespecifických vazeb 6)inkubace s protilátkou/-ami (enzym/chromogen – platí pro klasickou IHC) 7)counterstaining 8)montování [USEMAP] Bi8920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 03 Fixativa požadavky •rychle proniká do buňky/tkáně •fixuje b. struktury a zabraňuje reakci buňky a tím vzniku strukturálních artefaktů •zamezí ztrátě rozpustných proteinů •nesmí vykazovat autofluorescenci •rozdíly v závislosti na detekované struktuře •chemická fixativa •mrazová substituce •mikrovlnná fixace [USEMAP] Bi8920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 03 Chemická fixativa koagulační chemická fixativa •MetOH – nejčastěji -20°C, bez permeabilizace •EtOH •aceton výhody •rychlá fixace, díky dehydrataci •proteiny jsou koagulovány nebo extrahovány •zachovává rozpoznání antigenu nevýhody •výrazné smrštění vzorku (až o 50%) •zkreslení morfologie a velikosti [USEMAP] Bi8920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 03 Crosslinkující chemická fixativa vytváří metylenové vazby -CH2- (crosslinks) mezi různými skupinami makromolekul •formaldehyd •glutaraldehyd.. nejčastěji paraformaldehyd (4% PFA) •reaktivní skupiny: amidová, guanidinová, thiolová, fenolová, imidazolová a indolylová •crosslinky i v nukleových kyselinách (ne však v lipidech) •pomalejší vytváření crosslinků, ale rychlejší průnik do buňky (než glutaraldehyd) •toxický, potenciální karcinogen [USEMAP] Bi8920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 03 E:\DCIM\102MSDCF\DSC04382.JPG Permeabilizace • •použití v závislosti na umístění detekované molekuly •na externí straně pl. membrány – netřeba •po fixaci aldehydy, nutnost permeabilizovat membránu, aby mohly být detekovány intracelulární molekuly •použití organických rozpouštědel nebo detergentů nejčastěji: •TRITON X-100 (0,1-1%), •Tween 20 •NP-40 (= Igepal) •Brij… [USEMAP] Bi8920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 03 Blokování nespecifických vazeb nutnost vyvázání: •nespecifických vazebných míst, na která by mohla nasednout protilátka •nevymytého fixativa •polárních nebo velmi hydrofobních struktur •zvyšuje specificitu protilátky •snižuje signál z pozadí nejčastěji používané: •bovinní sérový albumin (BSA): 1-10%, •sérum (ze stejného zvířete jako II. Ab, nebo jiné než I. a II. Ab) •želatina [USEMAP] Bi8920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 03 directIF.jpg indirectIF.jpg Přímá a nepřímá imunofluorescence [USEMAP] Bi8920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 03 https://youtu.be/OH2GFeaGV6w Dvojité značení nepřímá imunofluorescence [USEMAP] Bi8920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 03 https://youtu.be/pteO6FRWo3g Celkový postup nepřímá imunofluorescence [USEMAP] Bi8920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 03 Negativní kontrola •nutné pro vyloučení falešných výsledků •vícenásobné značení – kontroly pro jednotlivé fluorochromy •použití isotypové kontroly – stejný typ protilátky s fluorochromem bez specificity •použití neznačených buněk – vyloučení autofluorescence GFAP Isotype Control Staining Data GFAP Purified Antibody Staining isotypová kontrola pozitivní značení [USEMAP] Bi8920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 03 Pozitivní kontrola •detekce „ověřeného“ proteinu (tubulin, aktin) •linie s ověřenou expresí daného proteinu •transfekovaná linie s over-expresí daného proteinu http://www.proteinatlas.org/images/18530/144_E9_2_blue_red_green.jpg HeLa: a-tubulin A431: EGFR IF-IC [USEMAP] Bi8920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 03 Montování = uzavírání •uchování preparátu na delší dobu •bez přístupu vzduchu •v prostředí bránícím vyhasínání fluorescence •mohou současně označovat nukleové kyseliny (+DAPI, aj.) tuhnoucí vs. netuhnoucí montovací média •na bázi polyvinyl alkoholu (např. Mowiol) – tuhne •na bázi glycerolu (např. Vectashield) – potřeba zarámovat sklo – gel, parafín, lak na nehty.. [USEMAP] Bi8920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 03 Biofreaks - GGS LIVE - Immunofluorescence - Protocol.jpg Celkový postup nepřímého imunofluorescenčního značení – 1. část [USEMAP] Bi8920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 03 Biofreaks - GGS LIVE - Immunofluorescence - Protocol.jpg Celkový postup nepřímého imunofluorescenčního značení – 2. část [USEMAP] Bi8920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 03 Nepřímá vazba fluorochromu – značky navázání na imunoglobulin (protilátku) nebo úsek nukleové kyseliny, phalloidin.. Phalloidin •mykotoxin - obsažen v některých jedovatých druzích muchomůrek •Amanita phalloides - muchomůrka zelená (obsah přibližně 0,01 %) •inhibice depolymerizace aktinových filament •vazba na F-aktin •konjugace s fluorochromy Alexa Fluor 488 phalloidin [USEMAP] Bi8920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 03 Annexin V + fluorochrom detekce fosfatidylserinu („eat me“ signal) v apoptóze apo13 membrany NucView 488-Detecting caspase-3 activity in live cells，caspase-3 substrate,caspase-3 inhibitor Annexin V - TRITC kaspáza-3 (FITC) [USEMAP] Bi8920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 03 Interaktivní materiály •http://www.proteinatlas.org/ • •http://www.sigmaaldrich.com/czech-republic.html •http://www.abcam.com/ •https://www.scbt.com/scbt/home/ •http://www.cellsignal.com/index.jsp •http://www.agilent.com/en/dako-products •http://www.thermofisher.com/cz/en/home/brands/molecular-probes.html • •http://www.protilatky.cz/ [USEMAP] Bi8920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 03 Bi8920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 03 Interaktivní materiály •http://www.proteinatlas.org/ • •http://www.sigmaaldrich.com/czech-republic.html •http://www.abcam.com/ •https://www.scbt.com/scbt/home/ •http://www.cellsignal.com/index.jsp •http://www.agilent.com/en/dako-products •http://www.thermofisher.com/cz/en/home/brands/molecular-probes.html • •http://www.protilatky.cz/ [USEMAP] Bi8920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 03 Bi8920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 03 Interaktivní materiály •http://www.proteinatlas.org/ • •http://www.sigmaaldrich.com/czech-republic.html •http://www.abcam.com/ •https://www.scbt.com/scbt/home/ •http://www.cellsignal.com/index.jsp •http://www.agilent.com/en/dako-products •http://www.thermofisher.com/cz/en/home/brands/molecular-probes.html • •http://www.protilatky.cz/ [USEMAP] Bi8920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 03 Bi8920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 03 Interaktivní materiály •http://www.proteinatlas.org/ • •http://www.sigmaaldrich.com/czech-republic.html •http://www.abcam.com/ •https://www.scbt.com/scbt/home/ •http://www.cellsignal.com/index.jsp •http://www.agilent.com/en/dako-products •http://www.thermofisher.com/cz/en/home/brands/molecular-probes.html • •http://www.protilatky.cz/ [USEMAP]