Bi8920 Pokročilé mikroskopické techniky doc. RNDr. Jakub Neradil, Ph.D. Ústav experimentální biologie PřF MU Princip fluorescence Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2020 - 01 / 27.2. • definice a princip fluorescence • fluorochromy Program přednášky: Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2020 - 01 / 27.2. „Viditelné“ světlo elektromagnetické vlnění o vlnové délce 400-700 nm elementární částice = foton - představuje kvantum el.mag. energie duální povaha - vlnová i částicová (dle metody studia) vlnová délka (λ) – délka jednoho kmitu (400-700 nm) frekvence (f) – počet kmitů za sekundu (4-8*1014 s-1 [Hz]) rychlost světla (c) = konstantní ve vakuu (300.000 km*s-1) platí vztahy: c =  * f f = c /  E = h * f E = h * c /  Planckova konstanta h = 6,626*10-34 J*s Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2020 - 01 / 27.2. vlnová délka ~ barva světla http://olympus.magnet.fsu.edu/primer/java/wavebasics/index.html Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2020 - 01 / 27.2. Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2020 - 01 / 27.2. LUMINISCENCE jev při kterém vysílá látka do prostoru světlo dělení dle indukce – chemiluminiscence : vyvoláno chemickou reakcí např. oxidace luciferinu luciferázou u světlušky, ECL detekční činidlo Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2020 - 01 / 27.2. -Fotoluminiscence záření je vyvoláno jiným zářením a) fluorescence b) fosforescence fluorochrom = fluorofor látka schopná fluorescence excitační záření luminiscenci vyvolává emisní záření vysílané látkou Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2020 - 01 / 27.2. Podstata fluorescence Jablonskiho diagram vyšší energetické hladiny základní energetická hladina excitační záření emisní záření http://olympus.magnet.fsu. edu/primer/java/fluorescen ce/exciteemit/index.html Relaxation Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2020 - 01 / 27.2. Průběh fluorescence 1. excitace elektronů fotony ze základní energetické hladiny do excitovaného stavu trvání 10-15 s 2. excitovaný stav pokles na nejnižší hladinu excitace (relaxace) ztráta energie ve formě tepla trvání 10-14 – 10-11 s 3. emise světla => fluorescence trvání 10-7 – 10-9 s = doba dohasínání Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2020 - 01 / 27.2. recyklace photobleaching http://olympus.magnet.fsu.edu/primer/java/fluorescence/photobleaching/index.html Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2020 - 01 / 27.2. Princip fluorescence http://media.invitrogen.com.edgesuite.net/tuto rials/1Intro/player.html Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2020 - 01 / 27.2. fosforescence doba dohasínání 10-3 – 102 s Podstata fluorescence a fosforescence Jablonského diagram Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2020 - 01 / 27.2. Jablonského diagram- zjednodušený http://olympus.magnet.fsu.edu/primer/java/jablonski/lightandcolor/index.html Jablonského diagram http://olympus.magnet.fsu.edu/primer/java/jablonski/jabintro/index.html Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2020 - 01 / 27.2. Spin je kvantová vlastnost elementárních částic - vnitřní moment hybnosti částice. Spiny částic přispívají k celkovému momentu hybnosti soustavy. ↑ ↓ ↑↓ ↑ ↓ ↓ ↓ S0 S1 S2 T1 excitovaný singletový stav - elektrony obsazují vyšší energ. hladiny -porušuje se párování elektronů na jednotlivých hladinách - spin se při excitaci nemění základní singletový stav -všechny elektrony jsou spárovány -mají opačný spin -velikost +1/2, -1/2 tripletový stav (zakázaný) -méně pravděpodobný -elektrony mají stejný spin E fluorescence fosforescence Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2020 - 01 / 27.2. Stokesův posun • Vlnová délka excitujícího světla je menší než emitovaného (ex< em) • Energie excitujícího světla je větší než emitovaného (Eex> Eem) • V rámci relaxace v excitovaných stavech dochází ke ztrátě energie Sir G.G. Stokes Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2020 - 01 / 27.2. Absorbční (excitační ) spektrum závislost intenzity fluorescence na excitační vlnové délce (měřeno při konstatní emisní vlnové délce) Emisní spektrum závislost intenzity fluorescence na vlnové délce při konstantní vlnové délce excitace Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2020 - 01 / 27.2. • obě spektra mají své maxima • excitační maximum • emisní maximum • vzdálenost mezi nimi – Stokesův posun Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2020 - 01 / 27.2. Emisní spektrum určitého fluorochromu • je nezávislé na vlnové délce excitace • emise z nejnižšího excitovaného stavu (S1) • mění se pouze intenzita fluorescence • intenzita emisního spektra odpovídá amplitudě excitace Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2020 - 01 / 27.2. Symetrie mezi absorpčním a emisním spektrem • struktura vibračních hladin základního i excitovaných stavů je stejná • absorpce (excitace) a emise do odpovídajících hladin nastává se stejnou pravděpodobností • absorpční a emisní spektra zrcadlově symetrická Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2020 - 01 / 27.2. Excitační a emisní spektrum http://media.invitrogen.com.edgesuite.net/tutorials /2Spectra/player.html Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2020 - 01 / 27.2. Molární extinkční koeficient (molární absorptivita) • vyjadřuje míru schopnosti látky absorbovat světlo Lambert-Beerův zákon A = ɛ · c · l • A – absorbance (bez jednotek) • ɛ – molární extinkční koeficient (l·mol-1·cm-1) • c – molární koncentrace (mol·l-1) • l – dráha (cm) Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2020 - 01 / 27.2. Kvantový výtěžek fluorescence (Qantum Yield = QY) QY = počet emitovaných fotonů počet absorbovaných fotonů • vyjadřuje míru schopnosti excitačního vlnění vyvolat fluorescenci • maximálně = 1 (teoreticky; energetické ztráty) Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2020 - 01 / 27.2. Standardy pro určení kvantového výtěžku fluorescence Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2020 - 01 / 27.2. fluorochrom = fluorofor látka schopná fluorescence • často obsahuje polycyklické nenasycené sloučeniny a atomy (s více elektrony – např. P, S) • čím více benzenových jader, tím více roste absopční maximum benzen naftalen antracen tetracen pentacen 262 nm 272 nm 375nm 475nm 580nm Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2020 - 01 / 27.2. Skupiny fluoroforů Vlastní (vnitřní) fluorescence látek Přirozeně se vyskytující fluorofory aminokyseliny, kofaktory enzymů, chlorofyl, green fluorescent protein.. Nevlastní (vnější) fluorescence látek • Přímá vazba fluorochromu na molekuly nebo buněčné struktury • použití sondy DNA, buněčná stěna, plazmatická membrána… mitochondriální aktivita - respirační vzplanutí, pH indikátory, membránový potenciál.. • Nepřímá vazba fluorochromu • použití značky navázání na imunoglobulin (protilátku) nebo úsek nukleové kyseliny, phalloidin, annexin V… Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2020 - 01 / 27.2. hlavní zdroj fluorescence proteinů v UV spektru -indolová skupina Trp Trp v sekvencích jen 1% metabolicky náročná syntéza Přirozeně se vyskytující fluorofory - aminokyseliny Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2020 - 01 / 27.2. Přirozeně se vyskytující fluorofory - kofaktory Nikotinamid adenin Flavin adenin dinukleotid (NADH) dinukleotid (FAD) Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2020 - 01 / 27.2. Přirozeně se vyskytující fluorofory - kofaktory • NAD+ není fluorescenční • fluorochrom = redukovaný nikotinamidový ring Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2020 - 01 / 27.2. Přirozeně se vyskytující fluorofory – chlorofyl • porfyrinové jádro + Mg Stokesův posun až 200nm Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2020 - 01 / 27.2. Přirozeně se vyskytující fluorofory – chlorofyl využití: • hodnocení výskytu fytoplanktonu ve vodě • studium fotosyntézy • fyziologický stav rostlin - stres Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2020 - 01 / 27.2. Nevlastní (vnější) fluorescence Nepřímá vazba fluorochromu – ZNAČKY značky jsou vázány k molekulám (proteiny, peptidy, oligonukleotidy..) kovalentní vazbou proteiny – vazba na aminové (NH2-), thiolové (SH-) skupiny nebo histidinové řetězce požadavky • vysoká intenzita fluorescence • stabilita při ozařování • minimální vliv na biologické vlastnosti vzorku Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2020 - 01 / 27.2. Rhodaminy • historicky nejpoužívanější fluorescenční značky • převážně na protilátky • ve formě derivátů • vysoký kvantový výtěžek 0,3-0,8 • photobleaching tetramethylrhodamine isothiocyanate (TRITC) ex. – 541nm, em. – 572nm Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2020 - 01 / 27.2. Chicago river St. Patrick's Day fluorescein Fluorescein isothiocyanate (FITC) ex. - 495 nm, em. - 521 nm Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2020 - 01 / 27.2. Cy značky (Cyanine dyes) • zástupci Cy2, Cy3, Cy3.5, Cy5, Cy5.5, Cy7 • částečně nasycené heterocykly + další aromatická jádra • ex. a em. spektra podobná klasickým fluoroforům • kratší Stokesův posun (30nm) • fotostabilní • vyšší kvantový výtěžek Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2020 - 01 / 27.2. Alexa Fluor Dyes (Molecular Probes) • sulfonovaný derivát rhodaminu • vyšší kvantový výtěžek  svítivost • zesílená fotostabilita (↓photobleaching) • pH stabilita • dlouhodobě stabilní • využití – živé buňky, tkáňové řezy, fixované preparáty • velký výběr rozsahu ex. a em. maxim • od UV po near-infrared oblast • označení podle vlnové délky zdroje excitačního záření Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2020 - 01 / 27.2. Fotostabilita fluorochromů • každý fluorofor podléhá vysvícení v průběhu souvislého osvětlení • ve FM silná intenzita dopadajícího záření • nejstabilnější – značky Alexa • není znám princip předpovědi stability dle struktury Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2020 - 01 / 27.2. Quantum dots • fluorofory (značky) = po absorbci fotonů emitují světlo o větší vlnové délce • anorganické nanokrystaly • velikost 10-20nm (GFP 4,2 x 2,4 nm) složení: jádro: několik 100x-1000x molekul polovodičového materiálu (Cd, Se, Te) obal: polovodič (ZnS), stabilizuje jádro, zlepšuje optické a fyzikální vlastnosti plášť: amfifilní polymer, umožňuje vazbu dalších molekul vnější plášť: polyethylene glycol (PEG) – snižuje nespecifickou vazbu Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2020 - 01 / 27.2. Quantum dots Vlastnosti: • vlnová délka emise závisí na velikosti částice • umožňují vícebarevnou detekci jedním excitačním zdrojem • možnost konjugace s primárními i sekundárními protilátkami nebo streptavidinem • více molekul IgG na jednu částici • vyšší jas než klasické fluorofory • násobně vyšší stabilita • velký Stokesův shift Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2020 - 01 / 27.2. Quantum dots • vazba na protilátku – srovnání s „klasickým“ konjugátem Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2020 - 01 / 27.2. Nevlastní (vnější) fluorescence Přímá vazba fluorochromu na molekuly nebo buněčné struktury – SONDY • ke struktuře se váží nekovalentně • po vazbě často mění fluorescenční vlastnosti • zesílení fluorescence nějčastější použití • buněčné membrány • nukleové kyseliny • buněčná stěna (calcofluor, primulin) • Fluorescenční indikátory změna fluorescence (spektra nebo intenzity) v závislosti na určité látce – prvek, pH, ROS… Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2020 - 01 / 27.2. Mebránové fluorescenční sondy • membrány nejsou samy o sobě fluorescenční • vazba sond na nepolární uhlovodíkové řetězce MK • studium - transportu přes membránu - transport lipidů v buňkách - přenos signálů zprostředkovaný lipidy - interakce léčiv s membránou • rozdělení a) fluorescenční analogy přirozených lipidů a) malé amfifilní a lipofilní organické fluorofory Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2020 - 01 / 27.2. Příklady a umístění fluorescenčních lipidových sond v membráně Mebránové fluorescenční sondy bis-pyren-PC NBD-C6-HPC DPH Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2020 - 01 / 27.2. Fluorescenční sondy pro nukleové kyseliny • nukleotidy ani NK nemají schopnost fluorescence • vazba sond na různá místa ethidium bromide Hoechst 33258 Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2020 - 01 / 27.2. • interkalační sondy - ethidium bromide, propidium iodide, 7-AAD (aminoactinomycin D) • vazba do malého žlábku – DAPI, Hoechst dyes (33342, 33258) • ostatní – akridinová oranž (DNA) akridinová oranž (RNA) Normalizovaná fluorescenční emisní spektra DNA sond 1) Hoechst 33258 (DAPI) 2) acridine orange 3) ethidium bromide 4) 7-aminoactinomycin D Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2020 - 01 / 27.2. Fluorescenční sondy pro nukleové kyseliny DAPI PI AO Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2020 - 01 / 27.2. cyaninové sondy (Molecular Probes) • nízká vnitřní fluorescence (QY=0,01) bez vazby na NK • po vazbě na NK 1000x zvýšená intenzita (QY=0,9) • vysoká afinita pro NK • minimální vazba na ostatní biopolymery • široký rozsah emisních maxim • dělení dle propustnosti pl. membrány • neprostupující: TOTO family, TO-PRO family, SYTOX • prostupující : SYTO (RNA i DNA specificita) Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2020 - 01 / 27.2. lidský neutrofil, DNA, SYTO® 13 směs živých a mrtvých bakterií, DNA, SYTOX® Blue linie MRC-5, RNA SYTO® RNASelect™ emisní spektra skupiny TOTO Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2020 - 01 / 27.2.