BÍ8920 Pokročilé mikroskopické techniky Princip fluorescence doc. RNDr. Jakub Neradil, Ph.D. Ústav experimentální biologie PřF MU Program přednášky: • definice a princip fluorescence • fluorochromy BÍS920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2020 - 01 / 27.2. „Viditelné" světlo elektromagnetické vlnění o vlnové délce 400-700 nm elementární částice = foton - představuje kvantum el.mag. energie duální povaha - vlnová i časticová (dle metody studia) vlnová délka (A) - délka jednoho kmitu (400-700 nm) frekvence (f) - počet kmitů za sekundu (4-8*1014s 1 [Hz]) rychlost světla (c) = konstantní ve vakuu (300.000 km*s _1) Electromagnetic Wave platí vztahy: c = X*f E = h *f BÍS920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2020 - 01 / 27.2. Planckova konstanta h = 6,626* 1034J*s vlnová délka ~ barva světla Ultraviolet UV (Invisible) Spectrum of "White" Light I Visible Wavelengths j Infrared IR (Invisible) 300nm 400nm SOOnm 600nm 700nm SOOnm Figure 2 BLUE CYAN GREEN YELLOW RED shorter longer httĽ://olympus.maRnet.fsu.edu/pľimer/iava/wavebasics/index.html BÍS920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2020 - 01 / 27.2. 480THz SlOTHz S40THz 610 THz 670THz 7501Hz 635 nm 590nm 560 nm 490 nm 450 nm 400 nm ! BÍ8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2020 - 01 / 27.2. — LUMINISCENCE jev při kterém vysílá látka do prostoru světlo dělení dle indukce - chemiluminiscence : vyvoláno chemickou reakcí např. oxidace luciferinu luciferázou u světlušky, ECL detekční činidlo "IS Set oři dory Ab-HRP Protein Primary Ab Hybcmd ECL Peracid Oxidized form of enzyme + luminal + enhancer Oxidized product Hyperfilm ECL BÍS920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2020 - 01 / 27.2. > -f -Fotoluminiscence záření je vyvoláno jiným zářením a) fluorescence b) fosforescence fluorochrom = fluorofor látka schopná fluorescence excitační záření luminiscenci vyvolává emisní záření vysílané látkou ■W7 Absorption Excitation Emission BÍS920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2020 - 01 / 27.2. excitační zářeni Podstata fluorescence Jablonskiho diagram vyšší energetické hladiny Loss of Energy 2>- Relaxation h tt p ://□ ly m p us, mag net.f sued u/p ri me-r/java/f I u oresce n ce/exd te em it/ i n dex. ht m I Stokes' Observation UV Absorption Figure 1 základní energetická hladina Visible Fluorescence Emission emisní záření BÍS920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2020 - 01 / 27.2. Průběh fluorescence 1. excitace elektronů fotony ze základní energetické hladiny do excitovaného stavu trvání 10"15 s 2. excitovaný stav pokles na nejnižší hladinu excitace (relaxace) ztráta energie ve formě tepla trvání 10-14-10-n s 3. emise světla => fluorescence trvání 10"7 - 10~9 s = doba dohasínaní ■v _ BÍS920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2020 - 01 / 27.2. recyklace photobleaching Excitation Absorption Emission Ground Vale Destruction Absorption Emission Ground !.Li(e Fluorescein Before Photobleaching 13 sec http://olvmpus.magnet.fsu.edu/primer/iava/fluorescence/photoblearhirm/index.html BÍS920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2020 - Ol / 27.2. Princip fluorescence http://media.invitrogen.com.edgesuite.net/tuto rials/llntro/player.html Podstata fluorescence a fosforescence Jablonského diagram Jablonski Energy Diagram Excitation (Absorption) 10*16 Seconds internal Conversion and Vibrational Relaxation 10"14.10"11 Sec Fluorescence (10~9-10"7 Sec) Excited Singlet States 5! Vibrational nergy States I Delayed Fluorescence Intersystem Crossing Quenching Non-Radiative s 2—— Relaxation o iH^ s Excited J Triplet í State 0 ov Non-Radiative Relaxation (Triplet) Phosphorescence (103-102 Sec) Ground State Figure 1 Alexander Jablonski (1898-1980) fosforescence doba dohasínaní IQ3- ÍO2 s BÍ8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2020 - Ol / 27.2. Jablonského diagram- zjednodušený http://olympus.maffnet/fsu.ed^ Jablonského diagram http://olympus.mafínetfsu.edu/primer/iava/iablonski/iabintro/index.htm BÍS920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2020 - 01 / 27.2. Spin je kvantová vlastnost elementárních částic - vnitřní moment hybnosti částice. Spiny částic přispívají k celkovému momentu hybnosti soustavy. excitovaný s i ng letový stav - elektrony obsazují vyšší energ. hladiny -porušuje se párování elektronů na jednotlivých hladinách - spin se při excitaci nemění A E základní singletový stav -všechny elektrony jsou spárovány -mají opačný spin -velikost+1/2, -1/2 i TI tripletový stav (zakázaný) -méně pravděpodobný -elektrony mají stejný spin fluorescence fosforescence BÍ8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2020 - 01 / 27.2. > J Stokesův posun • Vlnová délka excitujícího světla je menší než emitovaného (A,ex< A,em) • Energie excitujícího světla je větší než emitovaného (Eex> Eem) • V rámci relaxace v excitovaných stavech dochází ke ztrátě energie BLUE-CLASS h CHJflO WINDOW C í: IT A T ION FILTFK < i. 0 0 nm 8 OF WINE EMISSION FI LTf fl UU*SMlT& * 4Q0nn Mfiurv 1.6. [í\ptTÍmťni;il sťtierruilii' for detection of thť Slokcs shift. ťJ/i j/rť Change of Refratiffibility of Light, ity O, C 5/»fo»í, M.A.. F.R.S.. Fellow of Pembroke College, (out Ijh avian Professor of Mathematics in the University of Cambridge. Phil. Trans. Royal Society ofbmdon (1852) pp. 46.1-562. Received May II. — Read May 27. 1852. Sir G.G. Stokes BÍS920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2020 - 01 / 27.2. Absorbční (excitační) spektrum závislost intenzity fluorescence na excitační vlnové délce (měřeno při konstatní emisní vlnové délce) Emisní spektrum závislost intenzity fluorescence na vlnové délce při konstantní vlnové délce excitace Absorption and Emission Spectra with Overlap Profile (b) ♦ UV Wavelength Emission Spectrum Wavelength Spectrat Ov Wavelength IR-*> BÍS920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2020 - 01 / 27.2. • obě spektra mají své maxima • excitační maximum • emisní maximum • vzdálenost mezi nimi - Stokesův posun Excitation maximum Emission maximum 500 600 Wavelength of light (nm) BÍS920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2020 - 01 / 27.2. Emisní spektrum určitého fluorochromu • je nezávislé na vlnové délce excitace • emise z nejnižšího excitovaného stavu (S^ • mění se pouze intenzita fluorescence • intenzita emisního spektra odpovídá amplitudě excitace c o » _ B Ö X OJ QJ O c (]} o (A LL EX 3 Excitation spectrum Jablonski Energy Diagram Wavelength Figure 2. Excitation of a fluorophore at three different wavelengths (EX I. EX 2, EX 3) does not change the emission profile but does produce variations in fluorescence emission intensity (EM I, EM 2, EM 3) that correspond to the amplitude of the excitation spectrum BÍS920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2020 - 01 / 27.2. Excitation (Absorption) 10~1S Second* Internal Conversion and Vibrational Relaxation (KT1*-10*" Sec) Excited Singlet States ' ~| Vibrational >7 2~*i-- k Energy States Internal 1 Conversion Delayed Fluorescence Fluorescence (10"'-10"7 Sec) Intersystem Crossing Quenching Non-Radiative g J3 Relaxation © ' I Excited \ Tnpiet I Stale Non-Radiative Relaxation (Triplet I Ground State Phosphorescene c {10~J-10* See) Figure 1 Symetrie mezi absorpčním a emisním spektrem • struktura vibračních hladin základního i excitovaných stavů je stejná • absorpce (excitace) a emise do odpovídajících hladin nastává se stejnou pravděpodobností • absorpční a emisní spektra zrcadlově symetrická Electronic Absorption and Emission Bands Photon Energy (Electron-Volts) Excitační a emisní spektrum http://media.invitrogen.com.edgesuite.net/tutorials /2Spectra/player.html Molární extinkční koeficient (molární absorptivita) • vyjadřuje míru schopnosti látky absorbovat světlo Lambert-Beerův zákon A = E ■ c -1 • A - absorbance (bez jednotek) • e - molární extinkční koeficient (l-mol^-cnv1) • c - molární koncentrace (mol-ľ1) • I - dráha (cm) 4 > _ -r BÍS920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2020 - 01 / 27.2. ^ Kvantový výtěžek fluorescence (Qantum Yield = QY) QY = počet emitovaných fotonů počet absorbovaných fotonů • vyjadřuje míru schopnosti excitačního vlnění vyvolat fluorescenci • maximálně = 1 (teoreticky; energetické ztráty) BÍS920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2020 - 01 / 27.2. Standardy pro určení kvantového výtěžku fluorescence Oiiiiitum Yield [O.Y,] $tan- CO Table 2: fluorescent properties of some amino acids amino acid Lifetime (Nanoseconds) Excitation Emission Wavelength Molar absorptivity Wavelength Quantum yield Tryptophan 26 2SQ 5,600 348 0.20 Tyrosine 3.6 274 1,101 303 0.14 Phenylalanine 6.4 157 ?

3 400 ^00 600 TOO Wavelength (nm) 600 emisní spektra skupiny TOTO • H- směs živých a mrtvých bakterií, DNA, SYTOX® Blue linie MRC-5, RNA SYTO® RNASelect™ lidský neutrofil, DNA, SÝTO® 13 BÍS920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2020 - 01 / 27.2.