Bi8920 Pokročilé mikroskopické metody
doc. RNDr. Jakub Neradil, Ph.D.
Ústav experimentální biologie PřF MU
Fluorescenční mikroskop
Bi8920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 02 / 5.3.
• konstrukce a princip fluorescenčního
mikroskopu
• objektivy
• zdroje světla
• filtry
Program přednášky:
Bi8920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 02 / 5.3.
Otto Heimstaedt a Heinrich Lehmann (1911-1913)
• sestrojili první fluorescenční mikroskop s UV excitací
• autofluorescence bakterií, protozoí, rostlinných a živočišných buněk
• organické makromolekuly - albumin, elastin, keratin
Stanislav von Prowazek (1914)
• pozorování ve fluorescenčním
mikroskopu vazbu fluoroforů
na živé buňky
• odhalení původce tyfu –
Ricketsia prowazekii
Bi8920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 02 / 5.3.
Fluorescenční mikroskop
• je mikroskopem světelným
• lze pozorovat i v procházejícím „bílém“ světle
Bi8920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 02 / 5.3.
Základní princip fluorescenční mikroskopie
Bi8920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 02 / 5.3.
Transmisní fluorescenční mikroskop
(Transmition light fluorescence microscope)
excitační filtr
emisní filtr
vzorek
Bi8920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 02 / 5.3.
Transmisní fluorescenční mikroskop
• výhodnější použití kondenzoru pro temné pole
• excitační světlo nemíří do objektivu
• oddělené filtry
Bi8920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 02 / 5.3.
• kostra
• zdroj bílého světla
• kondenzor
• stolek
• objektivy
• tubus
• okuláry
• ovládací prvky:
• makro+mikrošroub
• ovládání světla
• filtry, clony...
ILUMINÁTOR
• zdroj světla
• kostky
• clony, filtry
Epifluorescenční mikroskop
(Reflected light fluorescence microscope)
Bi8920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 02 / 5.3.
Invertovaný fluorescenční mikroskop
• práce s vysokým vzorkem (kultivační nádoby)
Bi8920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 02 / 5.3.
Fluorescenční nástavec (iluminátor)
Bi8920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 02 / 5.3.
Köhlerovo osvětlení pro odražené světlo (1893-4)
• uspořádání optické soustavy pro ideální osvětlení
• výsledek: světlo vyplní celý otvor objektivu
a) maximální osvětlení
zvýšení intenzity díky kolektorové
čočce, zdroj světla blízko ohniska
čočky
b) stejnoměrné osvětlení
filtry k redukci „hot-spots“
(místa s nadměrnou intenzitou)
nebo difuzní fitr
Bi8920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 02 / 5.3.
Osvětlení
• osvětlení je tvořeno 3 konjugovanými (stejně zaostřenými) rovinami
A) rovinou zdroje světla
B) rovinou aperturní clony
fluorescenčního iluminátoru
C) zadní ohniskovou
rovinou objektivu
• vypadává přítomnost kondenzoru
• osvětlení přichází z objektivu a je
jím také odváděno
• intenzita a kontrast osvětlení jsou
regulovány jen aperturní clonou
• nemění se tím velikost osvětleného pole
A
B
C
Bi8920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 02 / 5.3.
Zobrazení
• zobrazení je tvořeno 3 konjugovanými rovinami
A) rovinou polní clony
B) rovinou zobrazovaného objektu
C) střední rovinou obrazu
• obraz zdroje světla je mimo rovinu
zaostření -> stejnoměrné osvětlení
• polní clona reguluje změnu
velikosti osvětlení pole
• nemění se tím intenzita osvětlení
• nastavení co nejmenší, ale aby
nebyla vidět (x photobleaching)
A B
C
Bi8920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 02 / 5.3.
Objektivy pro fluorescenční mikroskopii
intenzita fluorescence (jas)
• počet fotonů na jednotku plochy za čas
• u FM snímajících odražené světlo (z preparátu), závisí na numerické
apertuře objektivu (NA) a zvětšení (M)
• Intenzita  NA4/M2
použití objektivů
• plan-fluoritových a plan-apochromatických objektivů
• NA =1,3-1,4 pro olejovou imerzi
• musí propouštět UV a VIS světlo
• sklo musí mít minimální autofluorescenci
• antireflexní vrstvy
Bi8920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 02 / 5.3.
Typy objektivů
• Achromáty - jednoduché, složené ze 2 až 6 čoček;
je u nich korigovaná chromatická vada, červená
a modrá je zaostřena stejně
• Apochromáty - korekce barevné vady pro tři
základní barvy spektra, vyšší numerická apertura
a lepší rozlišení detailů
• Planachromáty - barevně korigovány jako achromáty
a korigováno i vyklenutí zorného pole (mikrofotografie)
• Planapochromáty - zcela odstraněno vyklenutí
zorného pole i chromatická vada, patří k nejlepším a
nejdražším objektivům
• Fluoritové objektivy - z fluoritového skla (vynikající
optické vlastnosti), dobře propouští UV záření, vhodné
pro fluorescenci, ale i pro pozorování ve světlém poli
Bi8920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 02 / 5.3.
Numerická apertura
NA = n. sinµ (NA = n. sin a/2)
vzduch (n = 1)
n - index lomu prostředí voda (n= 1.33)
µ - polovina tzv. otvorového úhlu imerzní olej (n = 1.51)
Změna indexu lomu prostředí
http://olympus.magnet.fsu.edu/primer/java/microscopy/immersion/index.html
Bi8920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 02 / 5.3.
Rozlišovací schopnost
• nejmenší vzdálenost dvou bodů, které ještě vnímáme jako
oddělené
R=/2NA
NA = n. sinµ
pro 550nm - zelená
Bi8920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 02 / 5.3.
Zdroje světla pro fluorescenční mikroskop
Bi8920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 02 / 5.3.
Zdroje světla pro světelný mikroskop
žárovky - el. proud rozžhaví vlákno
wolframová žárovka
• 300-1400nm
• W vlákno ve vakuu nebo inertní atmosféře (Kr, Xe)
• na světlo se spotřebuje 5-10% energie (zbytek na teplo)
• vysoká teplota vlákna (až 2500°C při 100W)
• s časem klesá intenzita světla, černání
wolframovo-halogenové žárovky
• v ochranné atmosféře přítomnost jódu
nebo bromu
• vlákno má delší životnost
Bi8920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 02 / 5.3.
Zdroje světla pro fluorescenční mikroskop
výbojky
• naplněná plynem pod vysokým tlakem (xenon, páry rtuti)
• obsahuje elektrody
• světlo vzniká ionizací plynu mezi elektrodami
• 10x-100x jasnější než žárovky
• připojeno počítadlo hodin
Bi8920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 02 / 5.3.
Rtuťová výbojka (HBO)
• obsahuje rtuťové páry
• neposkytuje souvislé spektrum
• emituje v několika úzkých pásmech
• UV, fialová, modrá, zelená, žlutá, oranžová
• životnost 200-400h
Bi8920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 02 / 5.3.
Xenonová výbojka (XBO)
• obsahuje xenon
• stejná intenzita ve viditelném spektru
• v UV nízká emise
• v IR vysoká emise -> přehřívání
• životnost 400-1200h
Bi8920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 02 / 5.3.
Zdroje světla pro fluorescenční mikroskop
LASER -Light Amplification by the Stimulated Emission of Radiation
• emituje paprsek světla o určité vlnové délce (nebo několika délek)
• světlo je koherentní – má stejnou frekvenci, směr kmitání, fázi
• vlnová délka je specifická v závislosti na typu kostrukce a materiálu
Bi8920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 02 / 5.3.
1. aktivní prostředí v rezonátoru (různé skupenství - pevné,
plyn, kapalina, plazma)
2. zdroj záření (elektrický proud, výbojka, chemické reakce..)
3. odrazné zrcadlo
4. polopropustné zrcadlo
5. laserový paprsek
Konstrukce laseru:
Bi8920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 02 / 5.3.
Princip laseru
• zdroj energie vybudí elektrony aktivního prostředí ze základní energetické
hladiny do vyšší energetické hladiny -> excitace
• postupná excitace většiny elektronů aktivního prostředí
• při přestupu elektronu na nižší hladinu dojde
k emisi fotonů
• fotony interagují s dalšími excitovanými
elektrony, spouštějí stimulovanou emisi fotonů
• emitované fotony mají stejnou frekvenci a fázi
• mezi zrcadly (v rezonátoru) dochází k odrazu paprsku fotonů a jeho
opětovnému průchodu prostředím -> zesilování toku fotonů
• paprsek opouští tělo laseru průchodem skrze polopropustné zrcadlo
Bi8920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 02 / 5.3.
Stimulovaná emise
http://olympus.magnet.fsu.edu/primer/java/lasers/heliumneonlaser/index.html
Bi8920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 02 / 5.3.
Nejčastěji používané lasery
využití - konfokální mikroskopie
Kryptonový laser
emituje v UV i VIS (647 nm)
Argonový laser
emituje v UV i VIS (488 a 514 nm)
He-Ne, He-Cd ...
Bi8920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 02 / 5.3.
Další užívané lasery
ve fluorescenční
mikroskopii
Laser vs. fluorochrom
Bi8920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 02 / 5.3.
Filtry ve fluorescenční mikroskopii
excitační filtr – propouští takové světlo, které je schopno vyvolat
excitaci s následnou emisí u daného fluoroforu
emisní (bariérový ) filtr – propouští světlo, které je emitováno
fluoroforem
Bi8920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 02 / 5.3.
FM obsahuje 3 typy filtrů v optické dráze
uloženy v bloku (kostce) – důležitá orientace
• excitační filtr
• dichromatické (dichroické) zrcátko (= beamsplitter)
• emisní filtr
Bi8920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 02 / 5.3.
Funkce dichromatického zrcátka
• u mikroskopů s odrazem fluorescence
• odráží excitační záření
• propouští emisní žáření
• sklon 45° k excitačnímu i emisnímu filtru
Bi8920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 02 / 5.3.
rozdělení filtrů dle šířky propouštěného spektra
• short pass – propouští kratší vlnové délky než je určitá hodnota
• long pass – propouští delší vlnové délky než je určitá hodnota
• wide band pass – omezen z obou stran spektra
• narrow band pass – omezen na úzké rozmezí vlnové délky
Bi8920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 02 / 5.3.
Základní typy kostek - Olympus
Bi8920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 02 / 5.3.
Kombinace excitačního a emisního filtru
OLYMPUS
http://olympus.magnet.fsu.edu/primer/java/fluorescence/optical
paths/index.html
Kombinace fluoroforu s blokem
NIKON
http://www.microscopyu.com/tutorials/flash/spectralprofiles/ind
ex.html
Bi8920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 02 / 5.3.
Filtry pro vícenásobné značení
• double band
• triple band
Bi8920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 02 / 5.3.
http://www.microscopyu.com/tutorials/java/fluorescence/excitationbalancer
Excitační balancer
• při použití vícepásmových kostek
• změna intenzity excitačních vlnových délek
• dvojice short pass a long pass filtrů
Bi8920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 02 / 5.3.
Filtry a zdroje světla
pro fluorescenční mikroskopii
http://media.invitrogen.com.edgesuite.net/tutorials/3Light_So
urces_Filters/player.html