BÍ8920 Pokročilé mikroskopické metody Fluorescenční mikroskop doc. RNDr. Jakub Neradil, Ph.D. Ústav experimentální biologie PřF MU Program přednášky • konstrukce a princip fluorescenčního mikroskopu • objektivy • zdroje světla • filtry BÍS920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 02 / 5.3. Otto Heimstaedta Heinrich Lehmann (1911-1913) • sestrojili první fluorescenční mikroskop s UV excitací • autofluorescence bakterií, protozoí, rostlinných a živočišných buněk • organické makromolekuly - albumin, elastin, keratin Stanislav von Prowazek (1914) • pozorování ve fluorescenčním mikroskopu vazbu fluoroforů na živé buňky odhalení původce tyfu -Ricketsía prowazekii BÍS920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 02 / 5.3. Fluorescenční mikroskop • je mikroskopem světelným • lze pozorovat i v procházejícím „bílém" světle Základní princip fluorescenční mikroskopie Principle of Excitation and Emission — Ultraviolet (UV) ^ 3 BÍS920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 02 / 5.3. Transmisní fluorescenční mikroskop (Transmition light fluorescence microscope) Transmisní fluorescenční mikroskop • výhodnější použití kondenzoru pro temné pole • excitační světlo nemíří do objektivu • oddělené filtry Epifluorescenční mikroskop (Reflected light fluorescence microscope) kostra zdroj bílého světla kondenzor stolek objektivy tubus okuláry ovládací prvky: makro+mikrošroub ovládání světla filtry, clony... ILUMINÁTOR zdroj světla kostky clony, filtry Peltier Cooled CCD Camera Eyepieces Vertical (Episcoplc) (illuminator Filter Optical Block Turret Fluorescence Microscope Arc-Discharge Lamphouse Breathshield (UV Shield) Figure 1 Mercury (HBO) Lamp Objective Stage-, Condenser-Turret Field Lens Microscope Frame Lamp — Intensity Control ^Tungsten Halogen Lamphouse Transmitted Light Filters RSI* BÍS920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 02 / 5.3. Invertovaný fluorescenční mikroskop • práce s vysokým vzorkem (kultivační nádoby) Fluorescenční nástavec (iluminátor) (UV Shield) M BÍ8920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 02 / 5.3. M NA ^ Kôhlerovo osvětlení pro odražené světlo (1893-4) uspořádání optické soustavy pro ideální osvětlení výsledek: světlo vyplní celý otvor objektivu a) maximální osvětlení zvýšení intenzity díky kolektorové čočce, zdroj světla blízko ohniska V V I cocky b) stejnoměrné osvětlení filtry k redukci „hot-spots" (místa s nadměrnou intenzitou) nebo difuzní fitr Reflected Light Microscopy Illuminator Collector .. Lens-Neutral Density Filter Be A m-Splitter/ Mirror Tungsten Halogen Lamp Field Diaphragm Condenser Aperture Diaphragm Figure 1 BÍS920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 02 / 5.3. Osvětlení Köhler Illumination in Reflected Light Fluorescence * osvětlení je tvořeno 3 konjugovanými (stejně zaostřenými) rovinami A) rovinou zdroje světla B) rovinou aperturní clony fluorescenčního iluminátoru C) zadní ohniskovou rovinou objektivu • vypadává přítomnost kondenzoru Collecto Arc Lamp Plasma Ball I Field Controls Field Diameter Field Len* • osvětlení přichází z objektivu a je jím také odváděno • intenzita a kontrast osvětlení jsou regulovány jen aperturní clonou • nemění se tím velikost osvětleného pole Arc Image at Condenser Apertuře Diaphragm Figure 5 Excitation Fitter Condenser and Objective Specimen— Image Plane Emission (Barrier) Fitter Dichromatic — Mirror -Objective Focal Plane BÍS920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 02 / 5.3. Zobrazení zobrazení je tvořeno 3 konjugovanými rovinami A) rovinou polní clony B) rovinou zobrazovaného objektu C) střední rovinou obrazu obraz zdroje světla je mimo rovinu zaostření -> stejnoměrné osvětlení polní clona reguluje změnu velikosti osvětlení pole nemění se tím intenzita osvětlení nastavení co nejmenší, ale aby nebyla vidět (x photobleaching) Köhler Illumination in Reflected Light Fluorescence Field Dia phragrn Controls Field Collector Diameter Field Arc Lamp Le,ns Lena Plasma Ball Arc Image at Condenser / rmer Aperture / / Diaphragm / Condenser and Objective Figure 5 ^ Specimen— r Image \ Plane -Emission (Barrier) Filter Dichromatic — Mirror -Objective Rear Focal Plane B BÍS920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 02 / 5.3. •f ■J-. Objektivy pro fluorescenční mikroskopii intenzita fluorescence (jas) * počet fotonů na jednotku plochy za čas * u FM snímajících odražené světlo (z preparátu), závisí na numeric apertuře objektivu (NA) a zvětšení (M) * Intenzita ~ NA4/M2 použití objektivů * plan-fluoritových a plan-apochromatických objektivů * NA =1,3-1,4 pro olejovou ímerzi * musí propouštět UV a VIS světlo * sklo musí mít minimální autofluorescenci * antireflexní vrstvy BÍS920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 02 / 5.3. Typy objektivů • Achromáty - jednoduché, složené ze 2 až 6 čoček; je u nich korigovaná chromatická vada, červená a modrá je zaostřena stejně • Apochromáty - korekce barevné vady pro tři základní barvy spektra, vyšší numerická apertura a lepší rozlišení detailů • Planachromáty - barevně korigovány jako achromáty a korigováno i vyklenutí zorného pole (mikrofotografie) • Planapochromáty - zcela odstraněno vyklenutí zorného pole i chromatická vada, patří k nejlepším a nejdražším objektivům • Fluoritové objektivy - z fluoritového skla (vynikající optické vlastnosti), dobře propouští UV záření, vhodné pro fluorescenci, ale i pro pozorování ve světlém poli BÍS920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 02 / 5.3. Axial Chromatic Aberration Blur = Q.30 mm i A ch no mat Doublet Figure 1 — I-----Ii l~ rL ui üuni NORMAL LENS FLUORITE LENS ■|| 1 onowuic WEBHATCJHLMCf OflWIAHC AR nWIITJN 5IWU Numerická apertura NA = n. sin^l (NA = n. sin a/2) vzduch (n = 1) n - index lomu prostředí voda (n= 1.33) |i- polovina tzv. otvorového úhlu imerzníolej (n = 1.51) Změna indexu lomu prostředí ^t^rr http://olvmpus.magnet.f5u.edu/primer/iava/micro5copv/immersion/index.html BÍS920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 02 / 5.3. Rozlišovací schopnost nejmenší vzdálenost dvou bodů, které ještě vnímáme jako oddělené R=A/2NA NA = n. sin|a OBJECTIVE TYPE Pian Achromat Pian Fluorite Pian Apochromat Magnification N.A Resolution (um) N.A Resolution (um) N.A Resolution (pm) 4x 0.10 2.75 0.13 2.12 0.20 1.375 10x 0.25 1.10 0.30 0.92 0.45 0.61 20x 0.40 0.69 0.50 0.55 0.75 0.37 40x 0.65 0.42 0.75 0,37 0.&5 0.20 60x 0.75 0.37 0.85 0.32 0.95 0.29 lOOx 1.25 0.22 1.30 0.21 1.40 0.20 N.A. = Numerical Apertuře pro 550nm - zelená BÍS920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 02 / 5.3. Zdroje světla pro fluorescenční mikroskop Visible Light Spectrum Ultraviolet Infrared t—i—r -r—i—r ■ ■ ' 400 Figure 1 500 600 Wavelength (Nanometers) 700 Wavelength Range (nanometers) Perceived Color 340-400 Near Ultraviolet (UV; Invisible) 400-430 Violet 430-500 Blue 500-570 Green 570-620 Yellow to Orange 620-670 Bright Red 670-750 Dark Red Over 750 Near Infrared (IR; Invisible) BÍS920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 02 / 5.3. Zdroje světla pro světelný mikroskop žárovky - el. proud rozžhaví vlákno wolframová žárovka • 300-1400nm • W vlákno ve vakuu nebo inertní atmosféře (Kr, Xe) • na světlo se spotřebuje 5-10% energie (zbytek na teplo} • vysoká teplota vlákna (až 2500ĎC při 100W) • s časem klesá intenzita světla, černání wolframovo-halogenové žárovky • v ochranné atmosféře přítomnost jódu nebo bromu • vlákno má delší životnost Tungsten Halogen Lam ph o u se Ventilation íl BÍS920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 02 / 5.3 To Microscope Zdroje světla pro fluorescenční mikroskop výbojky * naplněná plynem pod vysokým tlakem (xenon, páry rtuti) * obsahuje elektrody * světlo vzniká ionizací plynu mezi elektrodami * 10x-100x jasnější než žárovky * připOJenO pOČÍtadlO hodin Fluorescence Microscope Are-Discharge Lamp Housing Ventilation Rtuťová výbojka (HBO) • obsahuje rtuťové páry • neposkytuje souvislé spektrum • emituje v několika úzkých pásmech • UV, fialová, modrá, zelená, žlutá, oranžová • životnost 200-400h Xenónová výbojka (XBO) • obsahuje xenón • stejná intenzita ve viditelném spektru • v UV nízká emise • v IR vysoká emise -> přehřívání • životnost 400-1200h Xenon Arc Lamp Emission Spectrum * * * ■ -1-1 i 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 Wavelength {Nanometers) BÍS920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 02 / 5.3. Zdroje světla pro fluorescenční mikroskop LASER -Light Amplification by the Stimulated Emission of Radiation • emituje paprsek světla o určité vlnové délce (nebo několika délek) • světlo je koherentní - má stejnou frekvenci, směr kmitání, fázi • vlnová délka je specifická v závislosti na typu kostrukce a materiálu Common Laser System Configurations Konstrukce laseru: 1. aktivní prostředí v rezonátoru (různé skupenství - pevné, plyn, kapalina, plazma) 2. zdroj záření (elektrický proud, výbojka, chemické reakce..) 3. odrazné zrcadlo 4. polopropustné zrcadlo 5. laserový paprsek Princip laseru • zdroj energie vybudí elektrony aktivního prostředí ze základní energetické hladiny do vyšší energetické hladiny -> excitace postupná excitace většiny elektronů aktivního prostředí při přestupu elektronu na nižší hladinu dojde k emisi fotonů fotony interagujís dalšími excitovanými elektrony, spouštějí stimulovanou emisi fotonů ^«1™ emitované fotony mají stejnou frekvenci a fázi Spontaneous and Stimulated Processes Before After 1 r Spontaneous Emission or Decay Upper Level Lower Level Photon U|i|jer, Level Lower Level One Photon (a) Two Photons • mezi zrcadly (v rezonátoru) dochází k odrazu paprsku fotonů a jeho opětovnému průchodu prostředím -> zesilování toku fotonů • paprsek opouští tělo laseru průchodem skrze polopropustné zrcadlo .^Tiil^ BÍS920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 02 / 5.3. •f ■J-. Stimulovaná emise Stimulated Emission in a Mirrored Laser Cavity Figure 1 http://olvmpus.magnet.fsu.edu/primer/iava/lasers/heliumneonlaser/index.html BÍS920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 02 / 5.3. Nejčastěji používané lasery využití - konfokální mikroskopie Kryptonový laser emituje v UV i VIS (647 nm) Argonový laser emituje v UV i VIS (488 a 514 nm) He-Ne, He-Cd ... Ai yon kxiLdser Cool*nl Retům Magncl Electrode Browser Window Mirror Oulpul Len* tJ'r.vM-- Wlndom Cathode Bore Copper Astembly Segments Cup Laser Illumination Source Emission Spectra 0. h <- -o ™ ^» 0(S" ^ * <02 «"» g " c>« * i - <* 3 a. O 5 í L oj DE Krypton Emission Spectrum >lr I IT. L 5 - Argon Emission Spectrum 9 E"? ■T7 _ -L kl Figure 5 300 400 500 600 700 Wavelength (Nanometers) 800 m m. mrn'i BÍ8920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 02 / 5.3. Output Wavelengths of Common Lasers Laser Type Wavelength(s) (Spectral Region) (Nanometers) Argon Fluoride Ejtcimer{UV) Krypton Chlorid* Excimer (UV) Krypton Fluorid* Excimer (UV) Xenon Chloride Excimer (UV) Xenon Fluoride Excimer (UV) 193 222 248 306 351 Helium Cadmium (UV. Visible) 325.442 Min fiflůn l\ JU'i in Krypton (Visible) 476. 526 563.647 Argon (Visible) 468.514 Copper Vapor (Visible) 510.573 Nd:YAG Frequency Doubled (Visible) 532 Helium Neon (Visible, Near IR) 5-13. 5S4. G12. 633,1150, 3390 Cold Vapor (Visible) 623 Rhodamine 6$ Dy* (Visible, Tunable) 370-650 Ruby (Visible) 694 Diod* Semiconductor (Visible, Near IR) 630-1600 TI:Sapphir« (Visible - Near IR) 660-1130 Nd:YAG (Near IR) 1064 Erbium (Near IR) 1540 Hydrogen Fluoride (NearlR) 2600-3000 Carbon Dioxide (FarlR) 5600. 10600 Další užívané lasery ve fluorescenční mikroskopii Laser vs. fluorochrom Fluorophore Laser Excitation Efficiency 100 ti u L. i. 4B8 nm S6É nm FITC Excitation^ / 1 f L AF 646 J — E neitation 1 / Figure 1 - / AF 646 . Excitation . y L FITC 1 Alexa Fluor 1 546 400 500 600 Wavelength (Nanometers) BÍS920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 02 / 5.3. Filtry ve fluorescenční mikroskopii EUCITATIOH 'ILTFR tdOrim Hgure 1.6. ľAporimontiil sťhciMtic fbťdíieciion oí thť Slokťs shifi. excitační filtr - propouští takové světlo, které je schopno vyvolat excitaci s následnou emisí u daného fluoroforu emisní (bariérový ) filtr - propouští světlo, které je emitováno fluoroforem BÍS920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 02 / 5.3. FM obsahuje 3 typy filtrů v optické dráze uloženy v bloku (kostce) - důležitá orientace • excitační filtr • dichromatické (dichroické) zrcátko (= beamsplitter) • emisní filtr Fluorescence Emission Fluorescence Filter Spectral Profiles Funkce dichromatického zrcátka • u mikroskopů s odrazem fluorescence • odráží excitační záření • propouští emisní záření • sklon 45° k excitačnímu i emisnímu filtru Dichromatic Mirror Function in Reflected Light Fluorescence Illumination Emission Emission Illumination Illumination Emission BÍS920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 02 / 5.3. rozdělení filtrů dle šířky propouštěného spektra • short pass - propouští kratší vlnové délky než je určitá hodnota * long pass - propouští delší vlnové délky než je určitá hodnota * wide band pass - omezen z obou stran spektra • narrow band pass - omezen na úzké rozmezí vlnové délky Short Pass Filter Long Pass Filter Dichromatic Beam Splitter 100r I E UV Block IR UV 100 b Wide Band Pass Fitter Narrow Band Pass Filter s.^rt ?.ass1?nd>ong^SDS Filter Combination 5P-LP rm \ II UV w IR UV III Block Block P<1SS (to) IR UV BÍS920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 02 / 5.3. Zá kladní typy kostek - Olympus Excitation Cube Excitation Filteren m) Dicliioic Mmol (nm) I! ill 1 i-i mm U II MW1I 330-385 400 420- U U-MNU 360-37Ů 400 420-- II U-MNUBP 360-370 400 420-460 V IP MNV 400-410 455 455- BV U-MWBV 400-440 455 475-- BV U-MNBV 420-440 455 475-- B U-MWB 450-480 500 515- e U-MW1B 460-490 505 5 I Sil ■ e U-MNIB 470-490 505 515IF- e U-MNIBBP 470-490 505 515-550 B U-MWIBBP 460-490 505 515-550 c U-MSWG 480-550 570 590- G U HWG 510-550 570 590- G U-MNG 530-550 570 590- IG U-MNIG 520-550 565 580lf ľY u Hwrr 545 5W0 600 61 Off-- BÍS920 Pokročilé mikroskopické metody-jaro Filter Color Codes Code FiHei Tyi>e U Uhi.ivioleT V Violet BV Blue Violet B Blue B lirferfei ence Blue Filtei G Gieen IG limniiiio Gold Staininu Method ft Bi iulmleld, Phnise C oi it List. aid DIC only - 02/5.3. Kombinace excitačního a emisního filtru OLYMPUS http://olvmpus.magnet.fsu.edu/primer/iava/fluorescence/optical paths/index.html Kombinace fluoroforu s blokem NIKON http://www.microscopYU.com/tutorials/flash/spectralprofiles/ind ex. html Filtry pro vícenásobné značení • double band • triple band for DAPI/FITC/TRITC U-DM-DA/FI/TŘr3] 100.0 375.0400.0 500.0 G00 0 700.0 Wavelength (nm) Excitation filter Emission filter Dichromatic mirror BÍS920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 02 / 5.3. Excitační balancer • při použití vícepásmových kostek • změna intenzity excitačních vlnových délek • dvojice short pass a long pass filtrů Excitation Illumination Balancer Filter Configuration and Spectral Profiles 100 100 300 400 500 €00 Wavelength (Nanometers) 700 Thin-Film Rectangular Interference Fill er Excitation Balancer UV-Absorbing Fluorophore (DAPli Blue-Absorbing Fluorophore ' (FlfCj Green-Absorbing Fluorophore (Texas Red) Figure 1 http://vAW.microscopvu.com/tutorials/java/fluorescence/6xcitationbalancer BÍS920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 02 / 5.3. Filtry a zdroje světla pro fluorescenční mikroskopii http://mediajnvitrogenxom.edge5uite.net/tutorials/3Light So urces Filters/player.html m. m m > -f BÍS920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 02 / 5.3. %ľ