Bi8920 Fluorescenční mikroskopie doc. RNDr. Jakub Neradil, Ph.D. Ústav experimentální biologie PřF MU Principy a postupy imunofluorescenčního značení buněk Bi8920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 03 / 12.3. • imunocytochemie • typy protilátek a jejich výroba • postup imunofluorescenčního barvení Program přednášky: Bi8920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 03 / 12.3. Nevlastní (vnější) fluorescence Přímá vazba fluorochromu na molekuly nebo buněčné struktury - sondy DNA, buněčná stěna, plazmatická membrána… mitochondriální aktivita - respirační vzplanutí, pH indikátory, membránový potenciál. Nepřímá vazba fluorochromu – značky navázání na imunoglobulin (protilátku) nebo úsek nukleové kyseliny, annexin V, phalloidin.. Bi8920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 03 / 12.3. Imunocytochemie (ICC) • soubor metod, které umožňují detekci antigenu v tkáni nebo buňce (in situ) • pomocí značených protilátek Bi8920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 03 / 12.3. Albert Hewett Coons, M.D. (1912 - 1978) • zakladatel imunofluorescence • použití fluorochromem značené protilátky Bi8920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 03 / 12.3. Protilátky • patří do skupiny imunoglobulinů • třídy: IgA, IgD, IgE, IgG, IgM (u savců) • složení: 2x těžký řetězec (H), 2x lehký řetězec (L) • H řetězce: různé dle antigenních a strukturálních vlastností Ig -> podtypy (alfa, delta, epsilon, gama, mí) • L řetězce: lambda nebo kapa – různě, v závislosti na typu Ig • H a L – spojení disulfidickými vazbami, podíl na terciární struktuře, udržuje stabilitu Ig • nejčastěji pro imunofluorescenci IgG a IgM Bi8920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 03 / 12.3. Bi8920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 03 / 12.3. Bi8920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 03 / 12.3. IgG obecný vzorec: gama2 lambda2 nebo gama2 kapa2 průměrná Mr = 150kDa, H = 50kDa, L = 25kDa domény - variabilní (V) a konstantní (C), velikost 80-120AA na N-koncích : L řetězec: 1x VL doména H řetězec: 1x VH doména na C-koncích : L řetězec: 1x CL doména H řetězec: 3x - CH1, CH2, CH3 Bi8920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 03 / 12.3. VL a VH tvoří vazebné místo antigenu, v této části hypervariabilní oblasti – tyto se během reakce s antigenem dostávají nejblíže (0,2 - 0,3 nm) Struktura vazebného místa, která je unikátně charakteristická pro danou protilátku, se nazývá idiotyp -> každý klon protilátky má jiný idiotyp Bi8920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 03 / 12.3. Struktura – odvozena od enzymatického štěpení • papain- štěpí v pantové oblasti H řetězce vznik:  2x monovaletních Fab (Fragment antigen binding)  1x Fc (Fragment crystallizable) • pepsin – štěpí v C-koncové oblasti H řetězce vznik:  1x bivalentní F(ab´)2  zbytek Fc fragmentu je degradován 2 x Bi8920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 03 / 12.3. Bi8920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 03 / 12.3. IgM • pentamer, Mr=900kDa, 5x podjednotka po 180kDa • obecný vzorec (mí2 kapa2)5 nebo (mí2 lambda2)5 • struktura spojena řetězcem „J“ (15kDa) • stejné štěpení proteinázami jako IgG, vznik 10x Fab a Fc; 5x F(ab)2 • Fc - cyklický pentamer (340kDa) Bi8920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 03 / 12.3. Imunitní odpověď • imunizace antigenem - vyrovnání koncentrace mezi intra a extravaskulárním prostorem • zachytávání antigenu v uzlinách • latentní (indukční) fáze – asi týden • první tvorba IgM – primární odpověď • později nebo po další imunizaci (booster)– převážně tvorba IgG – sekundární odpověď • různá délka poločasu - IgM = 4-6 dní, IgG = 3 týdny Bi8920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 03 / 12.3. Polyklonální protilátky pro ICC • produkce různými klony B- lymfocytů • reakce s různými epitopy daného antigenu • nejčastější producent – králík (New Zeeland White rabbit) , koza, prase, ovce... Bi8920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 03 / 12.3. Bi8920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 03 / 12.3. Příprava polyklonálních protilátek • navržení a syntéza peptidu (antigen) • ověření čistoty hmotnostní spektrometrií a chromatografií • coupling – vazba s KLH glykoproteinem • KLH – Keyhole limpet hemocyanin • měkkýš (Megathura crenulata) • produkce vysoce imunogenního glykoproteinu KLH • dodá imunogenitu i peptidu Bi8920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 03 / 12.3. Příprava polyklonálních protilátek • imunizace – kontrola specificity vůči antigenu • získání séra Bi8920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 03 / 12.3. Příprava polyklonálních protilátek • imunizace Bi8920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 03 / 12.3. Ověřování afinity protilátky k antigenu metoda: dot-blot 1) na membránu nanesen antigen 2) kapka různě ředěné protilátky 3) detekce anti-králičí protilátkou konjugovanou s chromogenem Bi8920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 03 / 12.3. Monoklonální protilátky pro ICC • produkovány pouze jedním klonem B-lymfocytů • všechny molekuly imunoglobulinu jsou totožné • reagují pouze s jedním specifickým epitopem na antigenu • nejčastěji myší • příprava pomocí hybridomů: fůze B-lymfocytu a myelomové b. Bi8920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 03 / 12.3. Tvorba monoklonalních protilátek http://sites.sinauer.com/cooper7e/ani mation0413.html Bi8920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 03 / 12.3. První monoklonální protilátka (1975) • myší monoklonální protilátka – klon Sp1 (IgM) • proti SRBC (sheep red blood cells) • fůze myších buněk z myelomu a sleziny Bi8920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 03 / 12.3. Konjugace protilátky s fluorochromem vazba přes aminoskupinu, vznik amidu Bi8920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 03 / 12.3. • vazba přes thiolovou skupinu (-SH) • nutné v redukujícím prostředí – porušení disulfidických vazeb • vyšší senzitivita konjugátu – specifičtější místo značení Konjugace protilátky s fluorochromem Bi8920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 03 / 12.3. Přímá vs. nepřímá imunofluorescence • přímá imunofluorescence – původní metoda (1942) • přímá vazba protilátky s fluorochromem na antigen • rychlá, méně univerzální, nižší intenzita signálu • využití pro flow-cytometrii fluorochrom imunoglobulin epitop antigenu Bi8920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 03 / 12.3. Přímá imunofluorescence a) značená protilátka od dodavatele b) vlastní označení zvolené protilátky vybraným fluorochromem Innova Biosciences, Lightning-Link® Bi8920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 03 / 12.3. Nepřímá imunofluorescence dvoukroková 1) primární protilátka x antigenu 2) sekundární značená protilátka x primární protilátce • univerzální, více primárních protilátek z jednoho organismu lze kombinovat s jednou sekundární protilátkou • vyšší citlivost - na I. Ab více rozeznatelných epitopů, více navázaných molekul II. Ab Bi8920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 03 / 12.3. Základní postup imunofluorescenčního barvení buněčných kultur 1) fixace 2) permeabilizace 3) blokování nespecifických vazeb 4) inkubace s protilátkou / protilátkami 5) counterstaining (detekce DNA) 6) montování Bi8920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 03 / 12.3. Základní postup imunofluorescenčního barvení tkáňových řezů 1) parafínové řezy (±4 mm) na podložním skle 2) deparafinizace – xylen 3) rehydratace – sestupná alkoholová řada 4) reaktivace antigenů (antigen retrieval) v tlakové komoře při vyšší teplotě (97°C) 5) blokování nespecifických vazeb 6) inkubace s protilátkou/-ami (chromogen – platí jen pro IHC) 5) counterstaining 6) montování Bi8920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 03 / 12.3. Fixativa požadavky • rychle proniká do buňky/tkáně • fixuje b. struktury a zabraňuje reakci buňky a tím vzniku strukturálních artefaktů • zamezí ztrátě rozpustných proteinů • nesmí vykazovat autofluorescenci • rozdíly v závislosti na detekované struktuře • chemická fixativa • mrazová substituce • mikrovlnná fixace Bi8920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 03 / 12.3. Chemická fixativa koagulační chemická fixativa • MetOH - nejčastěji/-20°C, bez permeabilizace • EtOH • aceton výhody • rychlá fixace, díky dehydrataci • proteiny jsou koagulovány nebo extrahovány • zachovává rozpoznání antigenu nevýhody • výrazné smrštění vzorku (až o 50%) • zkreslení morfologie a velikosti Bi8920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 03 / 12.3. Crosslinkující chemická fixativa vytváří metylenové vazby -CH2- (crosslinks) mezi různými skupinami makromolekul • formaldehyd • glutaraldehyd.. nejčastěji paraformaldehyd (4% PFA) • reaktivní skupiny: amidová, guanidinová, thiolová, fenolová, imidazolová a indolylová • crosslinky i v nukleových kyselinách (ne však v lipidech) • pomalejší vytváření crosslinků, ale rychlejší průnik do buňky (než glutaraldehyd) • toxický, potenciální karcinogen Bi8920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 03 / 12.3. Permeabilizace • použití v závislosti na umístění detekované molekuly • na externí straně pl. membrány – netřeba • po fixaci aldehydy, nutnost permeabilizovat membránu, aby mohly být detekovány intracelulární molekuly • použití organických rozpouštědel nebo detergentů nejčastěji: • TRITON X-100 (0,1-1%), • Tween 20 • NP-40 (= Igepal) • Brij… Bi8920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 03 / 12.3. Blokování nespecifických vazeb nutnost vyvázání: • nespecifických vazebných míst, na která by mohla nasednout protilátka • nevymytého fixativa • polárních nebo velmi hydrofobních struktur • zvyšuje specificitu protilátky • snižuje signál z pozadí nejčastěji používané: • bovinní sérový albumin (BSA): 1-10%, • sérum (ze stejného zvířete jako II. Ab, nebo jiné než I. a II. Ab) • želatina Bi8920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 03 / 12.3. Přímá a nepřímá imunofluorescence Bi8920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 03 / 12.3. http://www.youtube.com/watch?v=OH2GFeaGV6w Dvojité značení nepřímá imunofluorescence http://www.youtube.com/watch?v=pteO6FRWo3g Celkový postup nepřímá imunofluorescence Bi8920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 03 / 12.3. Negativní kontrola • nutné pro vyloučení falešných výsledků • vícenásobné značení – kontroly pro jednotlivé fluorochromy • použití isotypové kontroly – stejný typ protilátky s fluorochromem bez specificity • použití neznačených buněk – vyloučení autofluorescence isotypová kontrola pozitivní značení Bi8920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 03 / 12.3. Pozitivní kontrola • detekce „ověřeného“ proteinu (tubulin, aktin) • linie s ověřenou expresí daného proteinu • transfekovaná linie s over-expresí daného proteinu HeLa: a-tubulin A431: EGFR Bi8920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 03 / 12.3. Montování = uzavírání • uchování preparátu na delší dobu • bez přístupu vzduchu • v prostředí bránícím vyhasínání fluorescence • mohou současně označovat nukleové kyseliny (+DAPI, aj.) tuhnoucí vs. netuhnoucí montovací média • na bázi polyvinyl alkoholu (např. Mowiol) – tuhne • na bázi glycerolu (např. Vectashield) – potřeba zarámovat sklo – gel, parafín, lak na nehty.. Bi8920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 03 / 12.3. Celkový postup nepřímého imunofluorescenčního značení – 1. část Bi8920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 03 / 12.3. Celkový postup nepřímého imunofluorescenčního značení – 2. část Bi8920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 03 / 12.3. Nepřímá vazba fluorochromu – značky navázání na imunoglobulin (protilátku) nebo úsek nukleové kyseliny, phalloidin.. Phalloidin • mykotoxin - obsažen v některých jedovatých druzích muchomůrek • Amanita phalloides - muchomůrka zelená (obsah přibližně 0,01 %) • inhibice depolymerizace aktinových filament • vazba na F-aktin • konjugace s fluorochromy Alexa Fluor 488 phalloidin Bi8920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 03 / 12.3. Annexin V + fluorochrom detekce fosfatidylserinu („eat me“ signal) v apoptóze Annexin V - TRITC kaspáza-3 (FITC) Bi8920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 03 / 12.3. Interaktivní materiály •http://www.proteinatlas.org/ •http://www.sigmaaldrich.com/czech-republic.html •http://www.abcam.com/ •https://www.scbt.com/scbt/home/ •http://www.cellsignal.com/index.jsp •http://www.agilent.com/en/dako-products •http://www.thermofisher.com/cz/en/home/brands/molecular-probes.html •http://www.protilatky.cz/