BÍ8920 Fluorescenční mikroskopie Principy a postupy imunofluorescenčního značení buněk doc. RNDr. Jakub Neradil, Ph.D. Ústav experimentální biologie PřF MU Program přednášky imunocytochemie typy protilátek a jejich výroba postup imunofluorescenčního barvení Nevlastní (vnější) fluorescence Přímá vazba fluorochromu na molekuly nebo buněčné struktury - sondy DNAy buněčná stěna, plazmatická membrána... mitochondriální aktivita - respirační vzplanutí, pH indikátory, membránový potenciál. Nepřímá vazba fluorochromu - značky navázání na imunoglobulin (protilátku) nebo úsek nukleové kyseliny, annexin V, phalloidin.. BÍS920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 03 / 12.3. Imunocytochemie (ICC) • soubor metod, které umožňují detekci antigenu v tkáni nebo buňce [in situ) • pomocí značených protilátek Albert Hewett Coons, M.D. (1912- 1978) zakladatel imunofluorescence * použití fluorochromem značené protilátky Coons, A. H,, Creech, H.J. and Jones, R. N. (1941). 'Immunological properties of an antibody containing a fluorescent group.' Proc. Soc. exp. BioL {N.T.)y 47\ 200. LOCALIZATION OF ANTIGEN IN TISSUE CELLS IL Improvements in a Method for the Detection of Antigen by Means of Fluorescent Antibody*- % By ALBERT H. COONS, M.D.f and MELVTN H. KAPLANJ {From the Department oj Bacteriology and Immunology, Harvard Medical School, Boston) (Received for publication, August 6, 1949) BÍS920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 03 / 12.3. NA** Protilátky • patří do skupiny imunoglobulinů • třídy: IgA, IgD, IgE, IgG, IgM (u savců) • složení: 2x těžký řetězec (H), 2x lehký řetězec (L) • H řetězce: různé dle antigenních a strukturálních vlastností Ig -> podtypy (alfa, delta, epsilon, gama, mí) • L řetězce: lambda nebo kapa - různě, v závislosti na typu Ig • H a L - spojení disulfidickými vazbami, podíl na terciární struktuře, udržuje stabilitu Ig • nejčastěji pro imunofluorescenci IgG a IgM BÍS920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 03 / 12.3. Name Heavy Chain Description Antibody Complexes lgAl.2 a Found i n mucosal areas, such as the gut. respiratory tract and urogenital tract, where it prevents colonization by pathogens. Also round in saliva, tears.and breast milk. IgD A Functions mainly as an antigen receptor on B cells that have not been exposed to antigens. It has also been shown to activate basophils and mast cells to produce antimicrobial factors. IgE Binds to allergens and triggers histamine release from mast cells and basophils, and is involved in allergy. Also protects against parasitic worms. IgG 1,2,3,4 V In its four forms, provides the majority of antibody-based immunity against invading pathogens. The only antibody capable of crossing the placenta to give passive immunity to the fetus. IgM Expressed on the surface of B cells asa monomer, and in a secreted form as a pentamer with very high avidity. Eliminates pathogens in the early stages of B cell mediated (humoral) immunity before there is sufficient IgG, Monomer: IgO, IgE, IgG Dimer: IgA Pentamer: IgM BÍS920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 03 / 12.3. Antibody Human and Mouse Human Mouse IgO Light Subtype Heavy Light Subtype Heavy Chain Chain Chain Cham k or A IgGi Yi k or A IgGi yi k or A IgG? Y2 k or A lgG2a Y2a k or A lgG3 Y3 K or * l9^2D Y2b k or A lgG4 Y4 k or A lgG3 Y3 BÍS920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 03 / 12.3. IgG obecný vzorec: gama2 lambda2 nebo gama2 kapa2 průměrná Mr = 150kDa, H = 50kDa, L = 25kDa domény - variabilní (V) a konstantní (C), velikost 80-120AA na N-koncích : L řetězec: lx VL doména H řetězec: lx VH doména na C-koncích : L řetězec: lx CL doména H řetězec: 3x - CHly CH2, CH3 BÍS920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 03 / 12.3. VL a VH tvoří vazebné místo antigénu, v této části hypervariabilní oblasti - tyto se během reakce s antigenem dostávají nejblíže (0,2-0,3 nm) Struktura vazebného místa, která je unikátně charakteristická pro danou protilátku, se nazývá idiotyp -> každý klon protilátky má jiný idiotyp cwilBfit ťTvrtuogtobuiin wuM •mmuogtabultfi i: r-., i dorrmn Struktura -odvozena od enzymatického štěpení papain- štěpí v pantové oblasti H řetězce vznik: > 2x nn on ova letních Fab (Fragment antigen binding) > lx Fc (Fragment crystallizable) pepsin - štěpí v C-koncové oblasti H řetězce vznik: > lx bivalentní F(ab')2 > zbytek Fc fragmentu je degradován BÍS920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 03 / 12.3. IgM pentamer, Mr=900kDa, 5x podjednotka po ISOkDa obecný vzorec (mí2 kapa2)5 nebo (mí2 lambda2)5 struktura spojena řetězcem „J" (15kDa) stejné štěpení proteinázami jako IgG, vznik lOx Fab a Fc; 5x F(ab}2 Fc - cyklický pentamer (340kDa) "SM (S Pentamer Imunitní odpověď • imunizace antigenem - vyrovnání koncentrace mezi intra a extravaskulárním prostorem • zachytávání antigénu v uzlinách • latentní (indukční) fáze - asi týden • první tvorba IgM - primární odpověď • později nebo po další imunizaci (booster)- převážně tvorba IgG -sekundární odpověď • různá délka poločasu - IgM = 4-6 dní, IgG = 3 týdny . P mi "ľ- J- ,-.-vj VjŕCLňAtlQň Dost Polyklonální protilátky pro ICC * produkce různými klony B- lymfocytů * reakce s různými epitopy daného antigénu * nejčastější producent - králík (New Zeeland White rabbit), koza, prase, ovce... RAISING ANTIBODIES IN ANIMALS Antibodies can be made in the laboratory by injecting an animal (usually a mouse, rabbit, sheep, or 90a!) with antigen A. i njecl ant i ij*n A 1mit+ív Ilr,|.n ., - WU^il ^ 1 ldF.HllIrr-lll Nllh .IlUĽFlfÚ-.^-l llldjlU J|J-|L- 1 _i_ □ _ J_ J □ _j. — 1 Mil......I il-.....L. Iq .-..11.11..11. n-.. .11r 11 M.-..I, LVLl|H I lunriiaiHJE «tiri«i whiirni inB^hli Ivulnl BÍS920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 03 / 12.3. ■y Dvojité značení nepřímá imunofluorescence http://www.youtube.com/watch?v=QH2GFeaGV6w Celkový postup nepřímá imunofluorescence http://www.youtube.com/watch ?v=pte06FRWo3g BÍS920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 03 / 12.3. Negativní kontrola * nutné pro vyloučení falešných výsledků * vícenásobné značení - kontroly pro jednotlivé fluorochromy * použití isotypové kontroly - stejný typ protilátky s fluorochromem bez specificity * použití neznačených buněk - vyloučení autof luorescence Pozitivní kontrola * detekce „ověřeného" proteinu (tubulin, aktin) * linie s ověřenou expresí daného proteinu * transfekovaná linie s over-expresí daného proteinu HeLa: a-tubulin A431: EGFR BÍS920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 03 / 12.3. Montovaní = uzavírání • uchování preparátu na delší dobu • bez přístupu vzduchu • v prostředí bránícím vyhasínání fluorescence • mohou současně označovat nukleové kyseliny (+DAPI, aj.) tuhnoucí vs. netuhnoucí montovací média * na bázi polyvinyl alkoholu (např. Mowiol) - tuhne • na bázi glycerolu (např. Vectashield) - potřeba zarámovat sklo -gel, parafín, lak na nehty.. Celkový postup nepřímého imunofluorescenčního značení - 1. část Zi-h .in hj-.vitedb. nlxPBS - poly l tfinr i*d»» 3HH mafciW kiDi <- MnUnl a* membráne FcnEMiHl <- WvAn*4v tím? ■ ::.\*-n. \.r-,-\'\ BÍS920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 03 / 12.3. Celkový postup nepřímého imunofluorescenčního značení - 2. část l-i k || pQfc | Pivniry Mifeuty v OAPI (orotwCHMKHh 1 + 1/ BÍ8920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 03 / 12.3. Nepřímá vazba fluorochromu - značky navázání na imunoglobulin (protilátku) nebo úsek nukleové kyseliny, phalloidin.. Phalloidin • mykotoxin - obsažen v některých jedovatých druzích muchomůrek • Amanita phaíioides - muchomůrka zelená (obsah přibližně 0,01 %) • inhibice depolymerizace aktinových filament • vazba na F-aktin BÍS920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 03 / 12.3. Annexin V + fluorochrom detekce fosfatidylserinu („eat me" signál) v apoptóze I Phosphatidylserine "Flip" Apcp'OS.1 InHi rcr Annexin V Conjugates / Apúptotic Cell Q m> Annexin V »> Annexin V EGFP BÍS920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 03 / 12.3. Interaktivní materiály 'http://www.proteinatlas.org/ *http://www.5igmaald rich.com/czech-republic.html 'http://www.abcam.com/ 'https://www.scbt.com/scbt/home/ 'http://wwwxell5ignal.com/index.jsp 'http://www.agilent.com/en/dako-products *http://www.thermofisherxom/cz/en/home/brands/molecu lar-probes.html 'http://www.protilatky.cz/ BÍS920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 03 / 12.3.