Bi8920 Pokročilé mikroskopické metody doc. RNDr. Jakub Neradil, Ph.D. Ústav experimentální biologie PřF MU Fluorescenční zobrazení živých buněk [USEMAP] Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2020 - 04 •GFP a fluorescenční proteiny •tracking metody •fluorescence v reálném čase •mikroskopování živých buněk • Program přednášky: [USEMAP] Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2020 - 04 The Nobel Prize in Chemistry 2008 "for the discovery and development of the green fluorescent protein, GFP". [USEMAP] Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2020 - 04 https://youtu.be/90wpvSp4l_0 Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2020 - 04 O. Shimomura 60. -70. léta: izolace fluoreskujících proteinů z medůzy Aequorea victoria, kolem klobouku bioluminiscenční orgány [USEMAP] Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2020 - 04 Princip luminiscence Aequorea victoria •za přítomnosti Ca+2, bioluminiscence aequorinu (apoaequorin = enzym + luciferin = kofaktor) -> modré světlo -> excitace GFP -> zelené světlo •přenos energie na principu rezonančního transferu (FRET) [USEMAP] Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2020 - 04 struktura GFP: b-barel (11 antiparalelních řetězců) , uvnitř α-helix s chromoforem, 238 AMK, 27kDa, aktivní místo: Ser65-Tyr66-Gly67 přestavba a vznik fluoroforu [USEMAP] Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2020 - 04 imidazolinový kruh [USEMAP] Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2020 - 04 http://zeiss-campus.magnet.fsu.edu/tutorials/fluorescentproteins/egfpchroma/indexflash.html Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2020 - 04 Excitace: 390-470 nm – wtGFP dva píky redukovaná forma – ex. 390 nm oxidovaná forma – ex. 470 nm Emise: cca 509 nm Využití: označení genů, vznik fúzního proteinu, lokalizace a dynamika proteinu v živých buňkách bez nutnosti fixace, možnost užití inducibilních promotorů a tedy indukovat tvorbu fúzních proteinů jen v určitém čase [USEMAP] Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2020 - 04 možnost umístění fluorescenčního proteinu v plasmidu Exprese : •přechodná z plazmidu (vysoká hladina proteinu) •stabilně - integrace do chromozomové DNA [USEMAP] Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2020 - 04 Výhody GFP •relativně malý protein (27kDa) – snadná difuze •funkční jako monomer •není třeba kofaktoru •stabilní, vysoký kvantový výtěžek (0,8) •v živých organismech / buňkách – dědičná exprese •neinvazivní vizualizace •„neinterferuje“ s buněčnými procesy nevýhody wtGFP •pomalejší proces fluorescence in vivo •horší funkčnost při 37°C •renaturace fluoroforu, redukce (2-4 hodiny) •méně stabilní při nízkém pH (lysozomy) •původně dvoukrokový proces [USEMAP] Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2020 - 04 mutace GFP •zesílení signálu •delší životnost •posun emisního spektra • deriváty GFP •EGFP - enhanced green FP •EBFP – enhaced blue FP •ECFP – enhanced cyan FP •EYFP – enhanced yellow FP • Wt: Ser65-Tyr66-Gly67 [USEMAP] Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2020 - 04 Ds Red fluorescenční protein a jeho deriváty •snaha o získání FP s delší excitační vlnovou délkou •izolovány z korálu Discoma striata •tetramerický protein •vylepšený derivát, snížená Mr (monomer) •další mutanty – mFruits proteiny [USEMAP] Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2020 - 04 Ds Red fluorescenční protein a jeho deriváty wt Ds Red: podobná struktura proteinu jako GFP b-barel (11 antiparalelních řetězců) , uvnitř α-helix s chromoforem excitace: 558 nm emise: 583 nm [USEMAP] Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2020 - 04 Ds Red fluorescenční protein a jeho deriváty [USEMAP] Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2020 - 04 Speciální vlastnosti fluorescenčních proteinů [USEMAP] Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2020 - 04 Zavedení fúzního genu do buňky ve formě plazmidu Mikroinjekce – přímý přenos mikrojehlou do cytoplasmy nebo jádra pomocí mikromanipulátoru, není vhodný pro velké množství b. linií, ideální pro protoplasty, lze si vybírat jednotlivé b. Lipofectaminová transfekce – jednoduchá a nejčastější metoda u živočišných buněk, není toxický, komplex lipidů a DNA fúzuje s plasmatickou membránou, lze i do jádra Precipitace fosforečnanem vápenatým – fosforečnan vápenatý společně s DNA precipituje, poté je fagocytován do buněk, jednoduchá metoda, část DNA i do jádra Elektroporace – elektrický puls vyvolá tvorbu pórů v plasmatické membráně, přechod do buňky Gene Gun – mechanický přenos DNA vázané na kovové mikroprojektily do buněk pomocí tlaku plynů nebo mikroexploze (např. u rostlinných buněk) [USEMAP] Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2020 - 04 Zavedení fúzního genu do buňky [USEMAP] Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2020 - 04 Mikroinjekce [USEMAP] Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2020 - 04 Lipofectaminová transfekce [USEMAP] Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2020 - 04 Elektroporace Cíle: •b. kultura •tkáně •orgány •embryo •embryo in utero [USEMAP] Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2020 - 04 GFP exprese v rybím embryu zebřička (Danio rerio) [USEMAP] Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2020 - 04 GFP transfekce „in utero“ např. hlodavci - mozek [USEMAP] Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2020 - 04 •Fluorescenční indikátory změna fluorescence (spektra nebo intenzity) v závislosti na určité látce – prvek, pH, ROS... Iontové indikátory: kationty: H+, Ca2+, Li+, K+, Mg2+, Zn2+, Pb2+, ... anionty: Cl-, PO42-, citrát, ATP... měření: změna intenzity nebo posun emisního/excitačního spektra v závislosti na koncentraci [USEMAP] Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2020 - 04 Indikátory Ca2+ FURA-2 excitace při dvou vl. délkách měření poměru 340/380nm při konstantní emisní vlnové délce 510nm CalciumGreen-5N měření intenzity fluorescence při konstantní excitační vlnové délce 488nm [USEMAP] Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2020 - 04 kombinace indikátorů Ca2+ •dva indikátory s neměnící se vl. délkou emise •jeden snižuje fluorescenci (Fura Red) •druhý zvyšuje fluorescenci (Fluo-3) v závislosti na Ca2+ •měření poměru fluorescence v jednotlivých emisních maximech [USEMAP] Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2020 - 04 Organelové sondy - próby označení specifické membránové organely: •mitochondrie •Golgiho aparát •endoplasmatické retikulum •lysosomy složení: fluorochrom + vazebná doména (zajišťuje specificitu vazby) •schopnost průniku přes pl. membránu bez poškození •navázání na cílovou organelu studium: transport, buněčná respirace, mitóza, apoptóza, degradace proteinů, sekreční dráhy rozdělení: na stálé a nestálé [USEMAP] Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2020 - 04 Mitochondrie •studium buněčné respirace dříve Rhodamin 123 (po fixáži slábne) •nyní MitoTracker, Mito Fluor (lze fixovat) •JC-1 indikátor membránového potenciálu - v aktivních mitochondriích mění emisi ze zelené na červenou Confocal images of cardiac myocytes Neonatální kardiomyocyty : rhodamin123, (A) kontrola, (B) ovlivněno mitochondriálním uncouplerem [USEMAP] Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2020 - 04 mitochondrie – bovinní endotel : MitoTracker® Deep Red FM dye mitochondrie/DNA - býčí spermie: MitoTracker® Green FM Hoechst 33342 mitochondrie – fibroblasty norka : JC-1 / JC-1 vysoký membránový potenciál – červená nízký membránový potenciál - zelená [USEMAP] Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2020 - 04 Golgiho aparát •CellLight™ Golgi-GFP , enzym specifický pro GA, fúzovaný s GFP ve vektoru •konjugované lektiny – vazba na glykosylované proteiny GA GA a mitochondrie / DNA – linie lidské hladké svaloviny: CellLight Golgi-GFP, CellLight Mitochondria-RFP, DAPI [USEMAP] Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2020 - 04 Endoplasmatické retikulum •prostupují přes membránu, selektivní pro ER, dříve DiOC6,- není tak specifický, vykazuje fotodynamickou toxicitu •nyní ER-Tracker + Blue-White, Red , Green - menší toxicita, lze i fixovat ER - bovinní endotel : ER-Tracker Blue-White DPX [USEMAP] Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2020 - 04 Lysozómy •LysoTracker, LysoSensor obsahují ve struktuře heterocyklické dusíkaté skupiny, které napomáhají transportu do lysozomů živých buněk, vysoká senzitivita pro organely s nízkým pH, možnost fixace (LysoTracker) •pouze živé b. (LysoSensor) – vzrůstá intenzita fluorescence v nízkém pH funkce jako pH indikátor lysozómy a mitochondrie / DNA – bovinní endotel : LysoTracker® Red dihydrorhodamine 123 Hoechst 33258 [USEMAP] Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2020 - 04 BacMam Reagents •připravené virové konstrukty •baculovirus – hmyzí, aktivně neinfikují savčí buňky, nereplikují se • konstrukt: 1)savčí promotor: zaručuje expresi v savčích buňkách 2)funkční část: protein nebo peptid cílený na strukturu (cytoskelet, organely aj.) nebo funkci (buněčný cyklus, autofagie, tok Ca2+) 3)fluorescenční protein: CFP, GFP, RFP; na C- nebo N- konci peptidu • • •jednoduchá aplikace •lze sledovat v reálném čase •lze koexprimovat více prób •lze fixovat [USEMAP] Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2020 - 04 Principle of BacMam Reagents Princip metody •vstup do b. endocytózou •přechod DNA do jádra •exprese genů jen se savčím promotorem •virové geny se nereplikují a nepůsobí buněčnou smrt •reálná exprese po 4-6 h •maximum signálu 24-48 h •vyhasnutí 4 dny až 2 týdny v závislosti na proliferační aktivitě [USEMAP] Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2020 - 04 Sledování fází buněčného cyklu •FUCCI- fluorescence ubiquitination cell cycle indicator •Geminin-GFP -> S/G2/M •Cdt1-RFP -> G1 •regulace ubiquitin-ligázami, exprimovanými v určitých fázích cyklu •lze spojit s BacMam systémem transfekce (LifeTechnologies) Sakaue-Sawano et al . Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression. Cell. 2008 Feb 8;132(3):487-98. [USEMAP] Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2020 - 04 https://youtu.be/S-1HryiIV1k Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2020 - 04 Testování viability / cytotoxicity / buněčné smrti měření podílu živých a mrtvých buněk na základě rozdílných vlastností 1.fluorogenní substráty esteráz • pronikají do buněk, zde metabolizovány - vznik aktivního fluoroforu • ověření soudržnosti membrány – fluorofor zadržován v cytoplasmě • fluoresceindiacetát (FDA), calcein AM (CAM) 1. 2.sondy pro nukleové kyseliny • neprostupují přes membránu živých buněk • EtBr, PI, ethidium homodimer, SYTOX Green... lze společně kombinovat [USEMAP] Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2020 - 04 linie krysích buněk: živé: substrát esterázy calcein AM® zelené mrtvé: ethidium homodimer-1® červené býčí spermie : živé : SYBR® 14 ® zelené mrtvé: propidium iodide ® červené Micrococcus luteus a Bacillus cereus: živé: zelené mrtvé: červené Princip obarvení mrtvých buněk membránu neprostupující DNA sondou [USEMAP] Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2020 - 04 Annexin V + PI: detekce buněčné smrti [USEMAP] Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2020 - 04 FRAP – Fluorescence Recovery after Photobleaching •studium mobility a molekulární dynamiky proteinů v živých b. • •narušení rovnoměrné fluorescence preparátu vysvícením (photobleaching) daného regionu •použití excitačního laseru o vyšší intenzitě –trvalé poškození fluoroforu •v místě postupné zvyšování intenzity fluorescence – přesun fluorescenčních a odbarvených molekul •různé metody v závislosti na velikosti odbarveného regionu, počtu odbarvovacích procesů a způsobu analýzy fluorescence [USEMAP] Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2020 - 04 Princip FRAP [USEMAP] Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2020 - 04 FRAP- malý region 1x odbarvení obnovení signálu, informace o mobilitě molekul FLIP – fluorescence loss in photobleaching – opakované odbarvení stejného regionu, informace o propojení mezi různými kompartmenty, studium migrace molekul iFRAP (inverzní) – celý preparát kromě 1 regionu odbarven – postupné vymizení fluorescence fotoaktivace – analýza rychlých difúzních procesů [USEMAP] Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2020 - 04 [USEMAP] Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2020 - 04 FRET: Förster (Fluorescence) Resonance Energy Transfer •studium interakce fluorescenčně značených molekul •měření nanometrových vzdáleností a jejich změn mezi molekulami (1-10nm) •2 fluorofory: donorový + akceptorový •podmínky: a) překryv emisní spektra donoru s excitačním spektrem akceptoru, b) vzdálenost do 10nm, c) orientace [USEMAP] Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2020 - 04 Princip přenosu energie mezi fluorofory File:FRET Jabolinski Diagram.svg [USEMAP] Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2020 - 04 [USEMAP] Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2020 - 04 Princip FRET interakce receptor-ligand [USEMAP] Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2020 - 04 http://www.olympusmicro.com/primer/techniques/fluorescence/fret/images/fretintrofigure11.jpg Další aplikace FRET [USEMAP] Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2020 - 04 aplikace FRET biosenzory- měření koncentrace vápníku [USEMAP] Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2020 - 04 http://www.microscopyu.com/tutorials/flash/spectralimaging/fretbiosensors/index.html Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2020 - 04 Podmínky pro mikroskopii živých buněk [USEMAP] Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2020 - 04 Mikroskopie živých buněk http://zeiss-campus.magnet.fsu.edu/articles/livecellimaging/images/imagingsystemsfigure1.jpg [USEMAP] Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2020 - 04 Mikroskopie živých buněk [USEMAP] Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2020 - 04 http://www.microscopyu.com/articles/livecellimaging/images/chambersfigure11.jpg Inkubační (perfúzní) komůrka Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2020 - 04 Anti-Fas-induced apoptotic L929 cells Morphology, PS exposure & PI uptake overlay https://youtu.be/Nrwu0YhGx5o [USEMAP]