Molekulární a buněčná biologie nádorů Prof. RNDr. Jana Šmardová, CSc. Ústav experimentální biologie Přírodovědecká fakulta MU Brno 2020 Bi9910 pondělí 16.00 – 18.00 A11 – č. 305 Mgr. Jana Koptíková, Ph.D. Institut biostatistiky a analýz LF MU Brno Molekulární a buněčná biologie nádorů 2020 1. Úvodní přednáška základní pojmy, historický přehled, klasifikace nádorů, onkogenní viry Bi9910 pondělí 16.00 – 18.00 A11 – č. 305 Organizační poznámky  Molekulární biologie nádorů Bi9910 • středa 14.00 – 16.00, A11 – učebna 306 • státní svátek • způsob ukončení: ZKOUŠKA – písemná část (25 otevřených otázek, max. 50 - min. 30 bodů) – ústní část • smysl kursu:  Bi7090 Molekulární biologie eukaryot  Bi9915 Speciální seminář z biologie nádorů  Bi1500 Biologie nádorů pro nebiology aneb buněčná filosofie přednášky podklady k přednáškám Studijní materiály Studijní literatura I Robert Allan Weinberg: „The Biology of Cancer“ GS Garland Science, 2013 (2007) Další učebnice nádorové biologie  Lauren Pecorino: „Molecular Biology of Cancer. Mechanisms, Targets, and Therapeutics“ Oxford University Press 2012, ISBN 978-0-19-957717-0  Robin Hesketh: „Introduction to Cancer Biology“ Cambridge University Press 2013, ISBN 978-1-107- 60148-2 Studijní literatura II • Hanahan D. and Weinberg R.A.: Hallmarks of Cancer. Cell (2000) 100: 57-70. • Hanahan D. and Weinberg R.A.: Hallmarks of Cancer: The Next Generation. Cell (2011) 144: 646- 674. „Studijní literatura III“  Robert Allan Weinberg: „Jediná odrodilá buňka. Jak vzniká rakovina.“ Academia 2003, ISBN 80-200-1071-8.  Robert Allan Weinberg: Coming full circle – from endless complexity to simplicity and back again. Cell (2014) 157: 267-271. „Studijní literatura IV“ • Siddhartha Mukherjee: The Emperor of all Maladies. A Biography of Cancer. Scribner 2010 • Vládkyně všech nemocí. Nakladatelství Masarykovy univerzity, 2015 Motto: Alfred G. Knudson (2000) „Všichni pronásledovatelé démona nádoru v minulém století museli být fascinováni předmětem svého pronásledování a zároveň museli cítit frustraci z jeho neuchopitelnosti. Se vstupem do nového milénia máme naději, že démon bude nakonec pochopen a že na základě tohoto pochopení najdeme způsob, jak ho přemoci.“ Historický přehled • 400 p.n.l. Hippocrates popsal rakovinu jako dlouhé výběžky (podobné račím nohám) vybíhajícím do zdravých tkání: – řec: karkinos = rak; onkos = krab – lat: cancer = rak • popisné (epidemiologické) poznatky: – 1848 - zvýšený výskyt rakoviny prsu u jeptišek (souvislost s bezdětností a nekojením) – 1775 - rakovina šourku u kominíků (souvislost s výskytem škodlivin v sazích; souvislost s hygienickými návyky) – 1902 - souvislost RTG paprsků a vzniku rakoviny – poč. 20. stol. - rodinný výskyt nádorů Historický přehled • 1909 – Peyton Rous - infekční přenos nádoru u kuřat studium nádorových virů (onkogen - fragment virových genů způsobujících nádor) (1961 – Nobelova cena; poprvé navržen 1926) Weinberg RA. The Biology of Cancer. Garland Science 2007 Historický přehled: zlomový rok 1971 • 1971 – president Nixon vyhlásil „War on Cancer“, což bylo spojeno s uvolněním velkých dotací ze strany americké vlády a s vírou, že nádory jsou způsobeny viry (výzkum DNA onkogenních virů se „svezl“ spolu) • 1976 – Bishop, Varmus – objeven c-src (protoonkogeny): souvislost s mitogenní signální dráhou v souvislosti se studiem akutně transformujících virů rozpoznáno asi 30 různých onkogenů • pomalu transformující viry (inserční mutageneze): postupně rozpoznáno 25 různých protoonkogenů • 1982 – objeven onkogen ras a zjištěno, že rozdíl mezi vonkogenem a c-protoonkogenem může být v jediné bázi!! Historický přehled • lidské nádory vyvolané retroviry ale objeveny nebyly! • (později znalost retrovirů umožnila rychlý objev příčiny AIDS) • 1969 - Henry Harris (fúze buněk) - nádorové supresory – recesivní geny (brzdy) • 1971 – Alfred Knudson – retinoblastom – „two hits hypothesis“ • 1989 – Bert Vogelstein – specifické mutace v konkrétních genech (onkogenech i nádorových supresorech) jsou spojeny s konkrétními stádii vývoje kolorektálního karcinomu • přenosy DNA (transformace, transfekce)… Historický přehled • biochemie: studium onkoproteinů, jejich lokalizace, interakcí • molekulární biologie: izolace, charakterizace a cílená exprese eukaryotických genů • buněčná biologie: studium molekulárních mechanismů řídících růst buněk, buněčné dělení • genetika somatických buněk a virů: funkční testy jednotlivých genů • epigenetika p21: WAF1 - „wild type p53-activated fragment“ cip1 - „Cdk-interacting protein 1“ sdi1 - „senescent cell-derived inhibitor 1“ gen: CDKN1A (6p21.2) Historický přehled • éra „omik“: genomika, transkriptomika, proteomika, epigenomika, kinomika, metylomika, glykomika,…  …Robert Allan Weinberg: Coming full circle – from endless complexity to simplicity and back again. Cell (2014) 157: 267-271. Historický přehled II Greaves M. Nat Rev Cancer. 16: 163-172, 2016  milníky ve výzkumu leukémie, které dláždily cestu k výzkumným, biologickým i klinickým onkologickým objevům Nádor, tumor, neoplazma, novotvar - je nová a abnormální tkáň v mnohobuněčném organismu, která v tomto organismu nemá fyziologickou funkci a roste neregulovaným způsobem - je geneticky podmíněný abnormální přírůstek buněčné tkáňové hmoty klonálního charakteru; jeho růst není v koordinaci s růstem okolních tkání a rovnovážným stavem organismu Základní pojmy Základní pojmy Zhoubný nádor nebo rakovina? „Pane doktore, tak co jsem to tam měla?“… „Měla jste tam malý zhoubný nádor!“ „No tak to jsem si oddechla, zaplať pánbůh, že to nebyla rakovina…“ • Zhoubný nádor a rakovina znamenají v češtině prakticky totéž. • Malý zhoubný nádor je jistě nepříjemnost, ale nezabíjí. Zabíjí rakovina, čili pokročilý nádor šířící se dále do organismu. • Někteří jazykoví fundamentalisté: termín rakovina je lidový, nepřesný, nesprávný, měl by být nahrazen termínem: zhoubný nádor Žaloudík J. Vyhněte se rakovině. Grada, 2008 Klasifikace nádorů I: podle schopnosti infiltrovat se do jiné tkáně • benigní (nezhoubné): zůstávají v místě svého vzniku, nemigrují, neinvadují jiné tkáně • maligní (zhoubné): pronikají do okolních tkání a prostřednictvím krevního a lymfatického systému do celého těla, v nových tkáních vyvolávají tvorbu sekundárních nádorů (metastází) • z tohoto pohledu lze klasifikovat nádory na primární a sekundární (pozor: sekundární – (i) therapy-related; (ii) vývoj z jiného méně závažného stavu pozor: maligní, tj. zhoubný, tj. smrtelný může být i nemetastázující nádor) Normální  maligní tkáň • hyperplasie - buňky nezměněné, ale zmnožené • metaplasie – přechodná změna fenotypu buněk - v důsledku vnějších signálů; buňky lokalizované na nesprávném místě, často v místě, kde se setkávají dva typy epitelu: děložní čípek – děloha; jícen – žaludek - tzv. Barrettův jícen: premaligní, metaplasie – dlaždicobuněčné buňky nahrazeny sekretorickými obvykle se nacházejícími v žaludku: ~ 30x zvýšené riziko vývoje karcinomu jícnu • dysplasie – obsahují již cytologicky abnormální buňky (velikost, tvar, barvitelnost jádra, poměr jádro/cytoplazma, změněná mitotická aktivita) a abnormální poměr buněčných typů Barrettův jícen • Stav, kdy dochází ve sliznici jícnu k intestinální metaplazii z důvodu refluxní esofagitidy. Normální sliznice jícnu (dlaždicobuněčný epitel) není odolná vůči kyselým šťávám žaludku, vzniká zde zánět a při dlouhodobém dráždění (kvůli nedostatečné funkci dolního jícnového svěrače, či jiné anomálii) dochází k přestavbě v cylindrický epitel, který je vůči agresivnímu prostředí odolnější. Obvykle bývá v dolní části jícnu na přechodu do žaludku. Tato intestinální metaplazie patří mezi prekancerózy, zvyšuje riziko vzniku adenokarcinomu jícnu. • Kromě potíží spojených s refluxní chorobou, jako je pálení žáhy, se nemusí nijak projevovat. • Refluxní choroba jícnu je onemocnění způsobené patologickým gastroezofageálním refluxem. Její nejčastější komplikací je poškození sliznice jícnu (refluxní ezofagitida). • Gastroezofageální reflux (GER) je proniknutí žaludečního obsahu do jícnu. K epizodám krátkodobého GER dochází běžně. Patologickým se stává, pokud vyvolává obtíže a/nebo zánětlivé změny sliznice jícnu • polypy, papilomy, warty – útvary již viditelné okem, obsahují buňky jako normální tkáň, ale expandují a tvoří makroskopickou masu; jsou dysplastické, nepenetrují bazální membránu, jsou benigní • invadující nádory – překračují/prostupují bazální membránu, jsou tedy již maligní • metastazující nádory – zakládají sekundární ložiska, jsou nejenom invadující, ale mají navíc schopnost adaptace na nové prostředí (+ motilita) Normální  maligní tkáň Klasifikace nádorů II: podle typu buněk (tkání), ze kterých vznikají • karcinomy – nádory epiteliálních buněk (asi 80-90% lidských nádorů) • sarkomy – pevné nádory pojivových tkání – svalů, kostí, chrupavky • leukémie a lymfomy - odvozené z hematopoietických buněk a buněk imunitního systému • neuroektodermální nádory – odvozené z nervové tkáně • germinální nádory – odvozené z totipotentní zárodečné buňky • smíšené nádory Karcinomy Odvozeny z epiteliálních tkání: Epiteliální buňky (Ep) tvoří vrstvu buněk, které tvoří výstelku tělních dutin a kanálů, povrch těla. Nacházejí se na jedné straně bazální membrány (BM), pod BM jsou stromální buňky a kolagenová vlákna (C), která spojují BM s extracelulární matrix (ECM). Weinberg RA: The Biology of Cancer. GS, 2007 Karcinomy  tvoří asi 80-90% nádorů • spinocelulární / dlaždicobuněčné / skvamózní – odvozeny z buněk, které tvoří ochrannou vrstvu • adenokarcinomy – odvozeny ze specializovaných buněk secernujících do dutin a kanálů nejrůznější látky, jejichž účelem je ochrana epiteliálních buněk před obsahem dutin,.. • smíšené – oba typy koexistují Sarkomy / mesenchymální nádory  tvoří asi 1% nádorů  nádory odvozené z pojivových tkání, z mesenchymálních buněk: • fibrosarkomy - odvozeny z fibroblastů, buněk secernujících kolagen • liposarkomy - z adipocytů, buněk, které ukládají v cytoplasmě tuky • osteosarkomy - z osteoblastů, buněk, které sestavují kalcium fosfátové krystaly v kolagenu – tvoří kosti • leiomysorkomy a rhabdomyosarkomy - z myocytů,které tvoří svaly • angiosarkomy – vznikají z prekurzorů endoteliálních buněk Leukémie a lymfomy  nádory odvozené z hematopoietických buněk a buněk imunitního systému • leukémie – z buněk, které se volně pohybují cirkulací • lymfomy – (z B a T lymfocytů) agregují a tvoří solidní nádory, často v lymfatických uzlinách Neuroektodermální nádory  nádory odvozené z různých buněk centrálního a periferního nervového systému • gliomy • glioblastomy • neuroblastomy • schwannomy • meduloblastomy  tvoří asi 1,3% diagnostikovaných nádorů, ale představují asi 2,5% úmrtí spojených s nádory Další nádory  některé nádory nezapadají do uvedené klasifikace: • melanomy - odvozeny z melanocytů, buněk, které secernují pigment • malobuněčné karcinomy plic – obsahují buňky se znaky neurosekrečních buněk  transdiferenciace – přepnutí/změna tkáňové linie, získání nových diferenciačních znaků  dediferenciace – nelze vystopovat typ tkáně, z níž je nádor odvozen: anaplastické nádory (1 až 2% nádorů) Klasifikace nádorů III: podle postiženého orgánu nebo tkáně • karcinom plic • kolorektální karcinom • karcinom prsu • akutní myeloidní leukémie • a mnoho dalších Vsuvka: Klasifikace solidních nádorů v praxi Co všechno stanovuje patolog? • typing • grading • staging • rating „Typing“ Přesný typ nádorového procesu. Vychází ze závazných klasifikací, obvykle doporučených WHO. Každá jednotka má přidělen svůj unikátní číselný kód ICDO (International Classification of Diseases for Oncology) Např. kód 8850/0 je lipom. První číslo za lomítkem označuje biologické vlastnosti: 0: benigní 1: nejisté chování 2: karcinom in situ 3: maligní 6: metastáza Např. kód 8850/3 je liposarkom. „Grading“ Stupeň diferenciace (jak moc se nádorové buňky podobají normálním buňkám) G1: dobře diferencovaný nádor s dobrou prognózou G2: středně diferencovaný nádor s prostřední prognózou G3: málo diferencovaný nádor se špatnou prognózou Příklad: karcinom močového měchýře Grade 1 Grade 2 Grade 3 dobře diferencované středně diferencované málo diferencované „Staging“ mucosa lamina propria vnitřní svalová vrstva vnější svalová vrstva Anatomický rozsah choroby (jak dalece je nádor rozšířen) podle světově unifikovaných systémů. Každá topika má svůj vlastní systém. Kategorizace podle velikosti a anatomických bariér, které nádor svým růstem překonal. Příklad: karcinom močového měchýře T1: malý lokalizovaný nádor T2: větší, ale ohraničený uvnitř orgánu T3: nádor na hranici orgánu T4: nádor, který se lokálně rozšířil do dalších orgánů „Rating“ Změny detekovatelné na molekulární úrovni. • Některé jsou přímo diagnostické pro danou nosologickou jednotku (např. specifické chromozomální translokace u lymfomů či některých sarkomů, specifický imunofenotyp u lymfomů či leukémií). • Jiné mají vysokou prognostickou váhu a tím bezprostřední vliv na volbu terapie (např. amplifikace genu N-myc u neuroblastomu, amplifikace HER2/neu u karcinomu prsu). • Další molekuly jsou cílem protinádorových léčiv a jejich přítomnost/stav v buňce predikují účinnost této léčby (např. Herceptin, Rituximab, Glivec,..). Kancerogeneze  proces vzniku a vývoje nádoru • je vícestupňový proces • podstatou kancerogeneze je postupné hromadění genetických (a epigenetických) změn Neoplastická transformace  přeměna somatické buňky v buňku nádorovou Podstatou kancerogeneze je postupné hromadění genetických změn Koptíková Jana, 2016 Vícestupňová kancerogeneze spojená s kroky klonální expanze Weinberg RA. The Biology of Cancer. Garland Science 2007 Klonální model vývoje nádoru: selekce, klonální expanze normální buňky soutěžící subklony buněk maligní klon ROKY Jsou nádory monoklonální nebo polyklonální? Weinberg RA. The Biology of Cancer. Garland Science 2007 Nádor je komplexní tkáň V nádorové tkáni se vyskytují nejenom transformované nádorové buňky (a), ale také normální „nepozměněné“ buňky, které „spolupracují“ při vývoji nádoru (b). kancerogeneze vs. buněčná transformace Nádor je komplexní tkáň V nádorové tkáni se vyskytují nejenom transformované nádorové buňky, ale také normální „nepozměněné“ buňky, které „spolupracují“ při vývoji nádoru. kancerogeneze vs. buněčná transformace Histologická skladba nádoru 1. Nádorový parenchym • vlastní nádorově transformovaný parenchym/buňky 2. Nádorové stroma • mezenchymální tkáňové složky: cévní komponenty, podpůrné mezenchymální tkáně, lymfocyty, makrofágy,.. • slouží hlavně k výživě parenchymu a jako kostra pro uspořádání parenchymu • transportní úloha (přenos signálů, rezervoár růstových faktorů…) • klíčová úloha při nádorové angiogenezi a metastázování GIT vs. GIST vs. lymfomy… Klasifikace nádorů IV: podle histologické skladby 1. Nádory organoidní dobře patrné rozdíly mezi stromatem a parenchymem 2. Nádory histoidní při vysoké proliferační aktivitě transformovaných i netransformovaných buněk v nádoru a odchylkách v jejich diferenciaci může docházet k setření cytomorfologických rozdílů mezi parenchymem a stromatem Nádor je komplexní tkáň! Kolik a které geny jsou změněny během kancerogeneze? • Kdyby k vývoji nádoru stačila jediná změna, byla by pravděpodobnost onemocnění rakovinou stejná v každém věku člověka - křivka závislosti by byla lineární. • Pravděpodobnost prudce roste s věkem. Křivky závislosti odpovídají složitým procesům, kdy jednotlivé na sobě nezávislé události nastávají postupně jedna za druhou. Weinberg A.R.: Jediná odrodilá buňka. Academia 2003 Carl O. Nordling  1953: byla poprvé vyslovena myšlenka, že k přeměně normální zdravé buňky v buňku nádorovou nedochází v jediném kroku  architekt Carl O. Nordling studoval frekvence úmrtí na různé typy nádorů u lidí ve věku od 25 do 74 let a zjistil, že u nich pravděpodobnost smrti z důvodu nádorového onemocnění roste se šestou mocninou věku  z toho vyvodil předpoklad, že k vývoji nádorové buňky je nezbytných alespoň šest genetických změn Nordling CO. A new theory on cancer–inducing mechanism. Br.J.Cancer 7: 93-112, 1953 Carl O. Nordling Nordling CO. A new theory on cancer–inducing mechanism. Br.J.Cancer 7: 93-112, 1953 Carl O. Nordling Nordling CO. A new theory on cancer–inducing mechanism. Br.J.Cancer 7: 93-112, 1953 Nordling CO. A new theory on cancer–inducing mechanism. Br.J.Cancer 7: 93-112, 1953 Carl O. Nordling Carl O. Nordling (1919-2007)  architekt, urbanista, amatérský historik • narodil se ve Finsku (1919), kde vystudoval architekturu (1939) • 1944: emigroval do Švédska • publikoval v odborných historických časopisech články o Holokaustu (1990, 1991), o Stalinovi (2006) • Jako statistik aplikoval statistické metody na řadu vědeckých problémů a publikoval mnoho článků, především ve švédštině. Je nejznámější svými pracemi ve vědeckých disciplínách mimo svůj obor • 1953: publikoval „A new theory on cancer–inducing mechanism“ v British Journal of Cancer • později psal především o tématech z nordické a germánské historie a mimo jiné přispěl i do debaty o identitě Shakespeara První odrodilá buňka • Co je to za buňku?? GIT vs. GIST vs. lymfomy… První odrodilá buňka • Co je to za buňku?? kmenová buňka?? progenitorová buňka?? diferencovaná buňka?? Nádorové kmenové buňky  jak normální, tak nádorová tkáň obsahuje subpopulaci kmenových buněk  nádorové kmenové buňky (CSCs): • mají potenciál dát vzniknout novému nádoru, včetně jeho heterogenity, po implantaci do vhodného hostitele • podíl CSCs v nádorové tkáni koresponduje s prognózou nádoru  existují dva modely vysvětlující vznik CSCs Chaffer CL a Weinberg RA: How does multistep tumorigenesis really proceed? Cancer Discov. 5(1): 22-24, 2015 Kmenové buňky  schopnost sebeobnovy i produkce buněk podstupujících diferenciaci  relativně vzácné  klidové (quiscentní)  rezistentní k toxinům a chemikáliím  intenzivní oprava DNA Nádorové kmenové buňky: model A  CSCs vznikají transformací normálních kmenových buněk Chaffer CL a Weinberg RA: How does multistep tumorigenesis really proceed? Cancer Discov. 5(1): 22-24, 2015 Nádorové kmenové buňky: model A Co nesedí: 1.malá pravděpodobnost, že se vzácné, nahodilé, zvýhodňující mutace objeví, když potenciální cílová skupina buněk je tak malá 2.většina mutací se objevuje mnohem častěji v rychle se dělících buňkách než v buňkách, které se dělí pomalu (populace epiteliálních SC se dělí mnohem pomaleji než jejich bezprostřední potomci – progenitorové buňky, které jsou odpovědné za exponenciální expanzi a mají vysokou mitotickou aktivitu) 3.klonální expanze buněčných variant závisí na zvýhodňujícím fenotypu; nediferencované SCs mají mnohem menší šanci, že budou vykazovat takový fenotyp, než jejich potomci, u kterých je již zahájen diferenciační program Chaffer CL a Weinberg RA: How does multistep tumorigenesis really proceed? Cancer Discov. 5(1): 22-24, 2015 Nádorové kmenové buňky: model A  Model, podle kterého normální epiteliální SCs jsou buňkami, kterými začíná vývoj karcinomů, je matematicky i biologicky málo pravděpodobný! Chaffer CL a Weinberg RA: How does multistep tumorigenesis really proceed? Cancer Discov. 5(1): 22-24, 2015 Nádorové kmenové buňky: model B  Ke genetickým (a epigenetickým) změnám (zásahům) dochází v progenitorových buňkách, které se transformují a také dediferencují v SCs (CSCs). Chaffer CL a Weinberg RA: How does multistep tumorigenesis really proceed? Cancer Discov. 5(1): 22-24, 2015 Nádorové kmenové buňky: „model A/B“  onkogenní mutace v různých „původních“ („odrodilých“) buňkách mohou vést k vývoji stejných typů nádorů (konvergence)  některé řídící mutace jsou v určování buněčného osudu tak silné, že překonávají transkripční kontext a původ buněk Chffer CL a Weinberg RA: How does multistep tumorigenesis really proceed? Cancer Discov. 5(1): 22-24, 2015Lytle NK et al: Stem cell fate in cancer growth, progression and therapy resistance. Nat Rev Cancer. 18: 669-680, 2018 Nádorové kmenové buňky: „model A/B“  onkogenní mutace mohou vést k vývoji různých typů nádorů (divergence) v závislosti na typu výchozí („odrodilé“) buňky, tj. v závislosti na transkripčním a epigenetickém profilu Chffer CL a Weinberg RA: How does multistep tumorigenesis really proceed? Cancer Discov. 5(1): 22-24, 2015Lytle NK et al: Stem cell fate in cancer growth, progression and therapy resistance. Nat Rev Cancer. 18: 669-680, 2018 Kolik a které geny jsou změněny během kancerogeneze? • nádor není monogenní onemocnění • odhaduje se, že pro vývoj nádoru je nezbytných 4-7 událostí (zásahů) • konkrétních genů, které mohou být během kancerogeneze změněny, jsou desítky, stovky…. Cancer Genome Atlas consortium • stanovení sekvence genomu nádorů • 2009: dokončeno sekvenování genomů nádorů vaječníků, slinivky, melanomu, rakoviny plic a několika forem leukémie • tak se podařilo získat úplný katalog mutací u těchto nádorů Mukherjee S: Vládkyně všech nemocí. Nakladatelství MU 2015 Wood LD et al. Science 318: 1108-1113, 2007 Cancer Genome Atlas consortium • u jednotlivých vzorků nádorů prsu a střeva bylo mutováno 50 - 80 genů; u nádorů slinivky 50 – 60 mutací • dokonce u nádorů mozku, které se často vyvíjejí v mladším věku, a proto by se dalo čekat, že se v nich nahromadí mutací méně, bylo nalezeno 40 - 50 mutovaných genů • u jednoho vzorku rakoviny prsu 43leté ženy bylo mutováno 127 genů • pouze několik typů nádorů, které nesou v genomu jen pár mutací, se z tohoto pravidla vymyká; například akutní lymfoblastická leukémie (ALL): nalezeno „jen“ 5-10 změn Mukherjee S: Vládkyně všech nemocí. Nakladatelství MU 2015 Wood LD et al. Science 318: 1108-1113, 2007 • v rámci jednoho typu nádoru existuje „skličující“ (Bert Vogelstein) mutační heterogenita • při srovnání dvou vzorků nádoru prsu není soubor mutovaných genů zdaleka stejný • sekvenování genomu nádorů potvrzuje stovky let klinických pozorování: rakovina každého pacienta je jedinečná, protože každý nádorový genom je jedinečný!! Cancer Genome Atlas consortium Mukherjee S: Vládkyně všech nemocí. Nakladatelství MU 2015 Wood LD et al. Science 318: 1108-1113, 2007 Genomic landscapes of human cancers Bert Vogelstein: mutace v nádorech jsou dvou typů: • (1) pasivní: jak se rakovinné buňky dělí, hromadí se v nich mutace v důsledku nehod při kopírování DNA, ale tyto mutace na biologii rakoviny nemají žádný vliv; jsou s genomem spojené a pasivně se při buněčném dělení přenáší dále; jsou identifikovatelné, ale bezvýznamné; jsou to „přihlížející“ mutace nebo mutace, „které se vezou“ • (2) „driver“: řídí, tj. přímo stimulují růst a biologické chování nádorových buněk; hrají rozhodující úlohu v biologii rakovinné buňky • „přihlížející“ mutace se objevují náhodně, jsou rovněž v genomu náhodně umístěny; „řídící“ mutace zasahují klíčové onkogeny a nádorové supresory a takových genů je v genomu omezený počet Mukherjee S: Vládkyně všech nemocí. Nakladatelství MU 2015 Wood LD et al. Science 318: 1108-1113, 2007 • „přihlížející“ mutace se objevují náhodně, jsou rovněž v genomu náhodně umístěny • „řídící“ mutace zasahují klíčové onkogeny a nádorové supresory a takových genů je v genomu omezený počet; takové mutace (např. v genech jako ras, myc a RB) se ve vzorcích objevují opakovaně; na „Vogelsteinově mapě“ vyčnívají jako vysoké hory, zatímco mutace „přihlížející“ zde typicky představují údolí Genomic landscapes of human cancers Mukherjee S: Vládkyně všech nemocí. Nakladatelství MU 2015 Wood LD et al. Science 318: 1108-1113, 2007 • „hory“ rakovinného genomu – tj. nejčastěji mutované geny u určitého typu nádoru - mohou být sestaveny do signálních drah (např. Ras-Mek-Erk) • Kolik drah je u nádorových buněk obvykle deregulováno? Vogelstein zjistil, že typicky mezi 11 a 15, v průměru 13 Genomic landscapes of human cancers Mukherjee S: Vládkyně všech nemocí. Nakladatelství MU 2015 Wood LD et al. Science 318: 1108-1113, 2007 Kolik a které geny jsou změněny během kancerogeneze? • nádor není monogenní onemocnění • odhaduje se, že pro vývoj nádoru je nezbytných 4-7 událostí (zásahů) • konkrétních genů, které mohou být během kancerogeneze změněny, jsou desítky, stovky Konkrétních genů, které mohou být během kancerogeneze změněny, jsou stovky • Catalogue of Somatic Mutations in Cancer (COSMIC) Cancer Gene Census (CGC) • verze 86, srpen 2018: 719 „cancer-driving“ genů: onkogeny + nádorové supresory (554 genů), fúzní geny Sondka Z et al. Nat Rev Cancer 18: 696-705, 2018; Tate JG et al. Nucl Acid Res 47: D941-D947, 2019 • úroveň 1 (574 genů): jasná funkce a jasný dopad na transformaci • úroveň 2: (i) méně jasný mechanismus transformace + (ii) partnerské geny ve fúzích s nejasnou funkcí, s prokázaným onkogenním dopadem partnerského genu Konkrétních genů, které mohou být během kancerogeneze změněny, jsou desítky, stovky • Catalogue of Somatic Mutations in Cancer (COSMIC) Cancer Gene Census (CGC) • 719 „cancer-driving“ genů (onkogeny, nádorové supresory, fúzní geny) + 145 expanding genes from more recent cancer studies that show supportive but less detailed indications of a role in cancer Sondka Z et al. Nat Rev Cancer 18: 696-705, 2018; Tate JG et al. Nucl Acid Res 47: D941-D947, 2019 Kolik a které geny jsou změněny během kancerogeneze? • nádor není monogenní onemocnění • odhaduje se, že pro vývoj nádoru je nezbytných 4-7 událostí (zásahů) • konkrétních genů, které mohou být během kancerogeneze změněny, jsou desítky, stovky • obecně existuje šest (sedm? jedenáct?) základních vlastností plně maligního nádoru: Šest získaných vlastností maligního nádoru soběstačnost v produkci růstových signálů aktivace H-ras necitlivost k signálům zastavujícím b.c. ztráta RB poškození apoptózy produkce IGF neomezený replikační potenciál aktivace telomerázy posílení angiogeneze produkce VEGF tvorba metastáz inaktivace E-kadherinu získaná schopnost příklad Nestabilita genomu jako podmínka akumulace všech nutných změn. Hanahan D and Weinberg RA. Cell 100: 57-70, 2000 Sedm typických znaků nádorových buněk Hanahan D. and Weinberg R.A., Cell 100 (2000) 57-70 Jedenáct typických znaků nádorových buněk Hanahan D. and Weinberg R.A., Cell 144 (2011) 646-674 (1) produkce vlastních proliferačních signálů (2) necitlivost k signálům zastavujícím buněčné dělení (3) odolnost k buněčné smrti (4) neomezený replikační potenciál (5) indukce angiogenese (6) aktivace invazivity a metastazování (7) genetická nestabilita a mutace (8) přítomnost zánětu podporující nádor (9) přeprogramování energetického metabolismu (10) schopnost vyhnout se destrukci imunitním systémem (11) změny mikroprostředí nádoru Získané vlastnosti maligního nádoru Hanahan D. and Weinberg R.A., Cell 144 (2011) 646-674 Konkrétních genů, které mohou být během kancerogeneze změněny, jsou desítky, stovky • Catalogue of Somatic Mutations in Cancer (COSMIC) Cancer Gene Census (CGC) Sondka Z et al. Nat Rev Cancer 18: 696-705, 2018; Tate JG et al. Nucl Acid Res 47: D941-D947, 2019 Kancerogeneze má obecné rysy Kancerogeneze má individuální průběh Individuální je - pořadí zásahů - počet zásahů - konkrétní zasažené geny Hanahan D and Weinberg RA. Cell 100: 57-70, 2000 Onkogeny Protoonkogen je strukturní gen eukaryotické buňky, který se svým translačním produktem podílí do značné míry na regulaci (stimulaci) dělení buněk a jejich diferenciace. Onkogen je protoonkogen pozměněný nebo aktivovaný tak, že vyvolává neoplastickou transformaci buňky. Aktivace protoonkogenu je přeměna protoonkogenu na onkogen. Mutace protoonkogenů jsou: - aktivující - dominantní - vyskytují se v somatických buňkách a jen výjimečně v zárodečných buňkách Nádorové supresory Produkty genů pro nádorové supresory („antionkogeny“) v normálních buňkách nevyvolávají proliferaci, ale naopak ji potlačují a udržují buňky ve stadiu klidu (G0). Jejich ztráta se projevuje neregulovanou proliferací. Mutace nádorových supresorů jsou: - inaktivující - recesivní (spojeno s LOH) („recesivní onkogeny“) - vyskytují se v somatických a také v zárodečných buňkách Jedenáct získaných vlastností maligního nádoru  vícestupňová kancerogeneze  modely Modely vícestupňové kancerogeneze 1. vývoj kolorektálního karcinomu 1. vývoj kolorektálního karcinomu 2. vývoj lymfomů Modely vícestupňové kancerogeneze 1. vývoj kolorektálního karcinomu 3. „transformace onkogenními DNA viry“ Modely vícestupňové kancerogeneze Onkogenní (nádorové) viry • Retroviry (RNA viry): obsahují ve svém genomu onkogen (akutně transformující viry) nebo aktivují protoonkogen, vedle kterého se integrovaly (inserční mutageneze; pomalu transformující) • DNA nádorové viry používají jinou strategii transformace: kódují proteiny (virové onkoproteiny), které interagují s nádorovými supresory (RB, p53, p300/CBP) hostitelské buňky a tak hostitelskou buňku tlačí do S fáze: SV40: velký T antigen různými doménami interaguje s p53, RB, p300/CBP adenoviry: E1A interaguje s RB a p300/CBP; E1B interaguje s p53 papilomaviry HPV-16, HPV-18: E6 interaguje s p53, p300/CBP; E7 interaguje s RB Některé způsoby inaktivace p53 virovými onkoproteiny  inaktivace p53 patří ke klíčovým událostem při transformaci buňky DNA viry • LT (SV40) - váže se do DNA vazebné domény p53 a znemožňuje vazbu p53 na DNA • E1B (adenovirů) - váže se do transaktivační domény p53 a znemožňuje transaktivaci cílových genů • E4orf6 (adenovirů) - způsobuje degradaci p53 • HBV X (viru hepatitidy B) - zadržuje p53 v cytoplasmě • E6 (papilomavirů) - indukuje degradaci p53 užitím ubikvitin ligázy E6AP; E6 dále inhibuje i přímo transaktivační schopnost p53 Podíl proteinů E6 a E7 papilomavirů na transformaci buňky virové onkoproteiny: stimulují proliferaci, inhibují apoptózu, zvyšují replikační potenciál, mění morfologii buněk, indukují maligní fenotyp Mantovani F a Banks L, Oncogene 20: 7874-7887, 2001 Podíl proteinů E6 a E7 papilomavirů na transformaci buňky E6 - inaktivuje p53 (blok G1, dep. apoptóza, gen. stabilita) - interaguje s p300/CBP (narušení homeostáze) - aktivuje expresi hTERT (aktivace telomerázy) - inaktivuje p16ink (narušení udržování klidového stádia) - interaguje s Bak (inhibice apoptózy) - interaguje s E6BP/ERC-55 (inhibice terminální diferenciace) - indukuje degradaci hDlg (a další interakce s proteiny obsahujícími vazebný motiv PDZ) (změna morfologie, získání invazivního charakteru) E7 - váže se na RB (uvolnění TF E2F) - inaktivace p21Cip a p27Kip (rozpojení: diferenciace - proliferace) - ruší inhibiční působení TGF- na růst buněk - způsobuje tvorbu násobných centrozómů Mantovani F a Banks L, Oncogene 20: 7874-7887, 2001 Klinický význam papilomavirů • popsáno více než 100 odlišných typů papilomavirů • dělí se na „high-risk“ a „low-risk“ typy podle prognózy, s níž jsou spojeny; „low-risk“ viry vyvolávají tvorbu benigních nádorů, „highrisk“ viry jsou spojeny s maligní progresí • asi 30 typů HPV preferenčně infikuje anogenitální oblasti, infekce „high-risk“ viry je spojena téměř se všemi nádory děložního čípku • asi 20% všech nádorů ústní dutiny, které nejsou spojeny s historií kouření a alkoholismu, je spojeno s infekcí HPV 2008: Nobelova cena - Harald zur Hausen Onkogenní viry a lidské nádory DNA viry: • virus Epstein-Barrové (EBV) - Burkittův lymfom (BL), Hodgkinův lymfom (HD), další lymfomy, nazofaryngální karcinomy (NPC) • virus hepatitidy B (HBV) - hepatocelulární karcinom (HCC) • (virus hepatitidy C (HCV) – HCC a lymfomy; RNA virus!) • lidské papilomaviry (HPV 16, 18,..) - anogenitální nádory, nádory ústní dutiny, bradavice • lidský herpesvirus typu 8 (HHV8) - Kaposiho sarkom (KS) • polyomavirus merkelových buněk (MCV) – karcinomy Merkelových buněk (neuroendokrinní karcinomy kůže) Onkogenní viry a lidské nádory RNA viry: Obecně: nepotvrdila se myšlenka, že retroviry způsobují mnoho různých nádorů, ale jejich studium přineslo mnoho vhledů do podstaty kancerogeneze (1) akutně transformující, (2) pomalu a transformující a (3) lidský lymfotropní virus typu I (HTLV-1) - T-leukémie (lymfom) dospělých (ATTL). • infikováno asi 1% obyvatel Kyushu (jižní ostrov Japonska) a méně někteří obyvatelé Karibiku • infekce se přenáší z matky na dítě (asi mlékem) a představuje asi 3-4% celoživotní riziko vývoje T-buněčné leukémie. • určitě se neuplatňuje mechanismus inserční mutageneze; virový gen tax je odpovědný za aktivaci transkripce provirových DNA sekvencí a pravděpodobně aktivuje také 2 buněčné geny: IL-2 (interleukin2) a GM-CSF („granulocyte macrophage colonystimulating factor“); pravděpodobně stimulace těmito faktory stojí na počátku neoplasie T buněk. (4) HIV-1 a HIV-2 – nezpůsobují přímo nádory, ale nepřímo – navozením imunodeficience – zvyšují jejich výskyt Onkogenní viry a lidské nádory Moore PS a Chang Y, Nat Rev Cancer 10: 878-889, 2010 Úloha infekčních agens v kancerogenezi Infekční agens souvisí asi s 1/5 všech úmrtí způsobených nádorem: • 6% - světová mortalita na hepatom: spojeno s chronickou hepatitidou B a C (HBV, HCV) • 5% - světová mortalita na ca děložního čípku: spojeno s infekcí HPV • 9% - světová mortalita na ca žaludku: spojeno s dlouhodobou infekcí Helicobacter pylori Úloha infekčních agens v kancerogenezi Infekční agens souvisí asi s 1/5 všech úmrtí způsobených nádorem: • 5% - světová mortalita na ca děložního čípku: spojeno s infekcí HPV • 6% - světová mortalita na hepatom: spojeno s chronickou hepatitidou B a C (HBV, HCV) • 9% - světová mortalita na ca žaludku: spojeno s dlouhodobou infekcí Helicobacter pylori  asi 15-20% všech nádorů souvisí se specifickou bakteriální infekcí (v rozvojových zemích až 40%) Greaves M. Nat Rev Cancer. 16: 163-172, 2016 Helicobacter pylori • spirální, mikroaerofilní, gramnegativní bakterie • objeven 1982 • kolonizuje žaludeční sliznici • prevalence v naší populaci se odhaduje na 30-55%; s věkem se navyšuje (u 90-95% pacientů s duodenálním vředem, u 60-80% pacientů s žaludečním vředem; kauzální vztah k peptidickému vředu gastroduodena) • tvoří bílkovinu stimulující tvorbu gastrinu, který zvyšuje sekreci HCl; produkuje proteázy a fosfolipázy narušující hlenovou vrstvu; mají enzym katalázu, která narušuje lokální schopnost fagocytózy buněk imunitního systému • za objev, že záněty žaludku i žaludeční vředy způsobuje infekce, kterou vyvolává Helicobacter pylori: Barry Marshall a Robin Warren – 2005 – Nobelova cena za fyziologii a lékařství Závěrečné poznámky „Úvodu“  geny nemají výlučnou funkci v jediném procesu v buňce (buněčný cyklus vs. apoptóza vs. genomová stabilita vs. …)  jenom omezený počet signálních drah je inaktivován téměř univerzálně u většiny nádorů (RB, p53)  jednotlivé signální dráhy jsou většinou postižené v jediné své složce  tzv. princip exkluzivity   tzv. princip „just right“  jen velmi málo genů ovlivňuje pouze jediný znak nádorů; mnoho genů má dopad na více znaků (hallmarks) nádorů  odlišné mutace téhož genu mohou mít odlišný dopad  rozdělení na onkogeny a nádorové supresory není ostré, jednoznačné  tkáňově specifický dopad  dopad v závislosti na stadiu vývoje nádorů Sondka Z et al. Nat Rev Cancer 18: 696-705, 2018; Tate JG et al. Nucl Acid Res 47: D941-D947, 2019 Závěrečné poznámky „Úvodu“ (COSMIC) Program kursu Bi9910 • Úvod - základní pojmy, historický přehled, klasifikace nádorů, onkogenní viry (1) • Některé signální dráhy (protoonkogeny): regulace buněčného cyklu, mitogenní a antimitogenní signalizace (2, 3) • Vrozené dispozice k nádorům (nádorové supresory): základní přehled syndromů spojených se zvýšeným výskytem nádorů (4, 5) • Genetická nestabilita nádorů (6) • Apoptóza (7) • Telomery a telomeráza (8) • Angiogeneze (9) • Tvorba metastáz (10) • Nádory a imunitní systém (11) • Epigenetika nádorů (12)