Molekulární a buněčná biologie nádorů Prof. RNDr. Jana Šmardová, CSc. Ústav experimentální biologie Přírodovědecká fakulta MU Brno 2020 Bi9910 středa 14.00 – 16.00 A11 – č. 306 10. Tvorba metastáz Molekulární a buněčná biologie nádorů 2020 Metastázy - nejčastější příčina smrti  metastázy jsou nejzhoubnějším jevem při nádorovém onemocnění a jsou příčinou asi 90 % úmrtí pacientů s nádorovým onemocněním  méně častou příčinou je bezprostřední působení primárního nádoru; většina primárních nádorů vzniká jako benigní a jsou relativně neškodné, leda, že narůstající masa utlačuje vitální orgány (nádory mozku) nebo uvolňuje nebezpečné množství hormonů • langerhansovy ostrůvky - nadprodukce inzulínu - hypoglykemie – smrt • thyroidní adenomy (premaligní epiteliální růst) mohou způsobit uvolnění nadměrného množství thyroidního hormonu, což vede k hyperthyroidismu • adenomy hypofýzy mohou uvolňovat do oběhu nadměrné množství růstového hormonu  akromegalismus • leukémie, lymfomy Špatné zprávy o metastázách  více než 70 % pacientů s invazivním nádorem má zjevné nebo skryté metastázy v době stanovení diagnózy  získání invazivního a metastatického charakteru je časná událost během progrese nádoru  milióny nádorových buněk se denně dostávají do krevního řečiště  angiogeneze je obecným znakem kancerogeneze, je také časnou událostí a potencuje metastatickou diseminaci nádoru Tvorba metastáz je časná událost ve vývoji nádoru Velikost primárního nádoru a riziko metastáz čím je velikost diagnostikovaného primárního nádoru prsu větší, tím je vyšší pravděpodobnost výskytu metastáz: % žen s primárním nádorem dané velikosti, u kterých se vytvořily metastázy Weinberg RA: The Biology of Cancer. GS, 2007 „Dobré“ zprávy o metastázách  metastazování je málo efektivní: méně než 0.01 % cirkulujících nádorových buněk úspěšně založí metastatické ohnisko  cirkulující nádorové buňky jsou zachytitelné dříve než se u pacienta vyvine zjevná metastáza  k potírání metastáz může být použito stejné terapie jako k léčbě primárního nádoru, ze kterého jsou odvozené: chirurgické odstranění, radioterapie, chemoterapie, imunoterapie, hormonální terapie nebo jejich kombinace  výsledky DNA čipů: podobnost primárních nádorů a metastáz na úrovni exprese genů!! (naopak mohou být velké rozdíly v expresních profilech mezi různými nádory téhož typu) Lineární a paralelní metastazování Marusyk A. et al., Nature Rev. 2012 1. uvolnění nádorové buňky z primárního nádoru - lokální invaze 2. prostoupení ECM a bazální membrány, vstup do cirkulačního systému - intravazace 3. migrace cirkulačním systémem 4. extravazace 5. vznik (dormantních) mikrometastáz 6. kolonizace Metastatická kaskáda Cirkulující nádorové buňky Lambert AW et al: Cell, 168 (4), 2017: 670-691 • cirkulující nádorové buňky (CTC) mohou být individuální nebo ve shlucích; shluky CTC se zdají být při kolonizaci efektivnější než jednotlivé buňky • významná je interakce CTC s krevními destičkami: ty je chrání a podporují, ovlivňují i endoteliální buňky, jejich interakci s CTC a propustnost pro CTC • také neutrofily spíše CTC podporují a stimulují extravazaci Karcinomy a bazální membrána • Karcinomy in situ: jsou na „epiteliální“ straně bazální membrány. I tak mohou stimulovat angiogenezi na „stromální“ straně – uvolňováním angiogenních faktorů přes (porézní/propustnou) bazální membránu. • Ovšem porušení bazální membrány (invaze) je pro nádor obrovská výhoda pro následující kroky metastazování: přímý přístup ke krevním/lymfatickým kapilárám, které jsou normálně pouze na stromální straně BM. Weinberg RA: The Biology of Cancer. GS, 2007 Má tvorba metastáz fyziologickou podstatu?  nádorová invaze může být deregulovanou formou fyziologických invazivních procesů, které se uplatňují například: • při prorůstání neurálních výběžků během vývoje mozku • při remodelaci tkání • při tvorbě cévního systému (a také při nádorové angiogenezi) • při hojení • a další Mechanismus invaze nádorových buněk  invazi lze chápat jako pohyb buněk spojený s regulovanou adhezí a uvolňováním adheze (od ECM, mezi buňkami navzájem) a proteolýzou ECM; průnik buněčných pseudopodií (výběžků) - související s tvorbou aktinových polymerů, složek cytoskeletonu - zřejmě vyžaduje souhru enzymů degradujících povrchové proteiny buněk a dalších enzymů - receptorů a aktivátorů  při remodelaci ECM musí existovat souhra mezi degradací (ECM) a procesem, který inhibuje proteolytické enzymy, aby byla umožněna postupná adheze Mechanismus invaze nádorových buněk Liotta LA and Clair T. Nature 405 (2000) 287-288 Epiteliální mezenchymální tranzice - EMT • vývojový program, který umožňuje polarizovaným epiteliálním buňkám, které normálně interagují s bazální membránou, získat fenotyp mezenchymálních buněk s větší pohyblivostí, invazivitou, zvýšenou rezistencí k apoptóze a zvýšenou schopností degradovat komponenty ECM • dokončení EMT se projevuje degradací bazální membrány a vznikem mezenchymálních buněk, které migrují z epiteliální vrstvy, kde vznikly • tento vývojový program transdiferenciace je využíván během embryogeneze, ale i v dospělosti, například v souvislosti s hojením/reparací epiteliálních tkání • „zneužíván“ nádorovými buňkami karcinomů během maligního vývoje  poprvé popsán Elisabeth Hay v roce 1982 Typické epitelium • vrstva, plocha („sheet“) buněk, často o tloušťce právě jedné buňky s jednotlivými buňkami sousedícími jedna s druhou uniformním způsobem • uniformní vzdálenosti mezi sousedními buňkami a mezi nimi buněčné spoje („cell junctions“) a adheze, které je drží pevně pohromadě a inhibují pohyb jednotlivých buněk mimo vrstvu • vnitřní adhezivita umožňuje buněčné ploše vytvářet trojrozměrné prostorové struktury, které mají velkou mechanickou pevnost • plocha buněk je polarizovaná ve směru apikální – bazální, což je někdy vizuálně patrné • vrstva buněk může adherovat k různým substrátům a má různé funkce Typické epitelium Typické mezenchymální buňky • obecně nevytváří přesně uspořádané („regimented“) struktury a nemají pevné mezibuněčné adheze • tvoří struktury nepravidelných tvarů a bez pravidelné struktury a hustoty • adheze mezi mezenchymálními buňkami jsou mnohem méně pevné a umožňují mnohem větší migraci buněk • mezenchymální buňky mají více protažené podlouhlé tvary a mají předo-zadní polaritu • nepravidelná struktura neumožňuje rigidní topologickou specializaci • migrace mezenchymálních buněk je mechanisticky odlišná od migrace epiteliálních buněk: EB se pohybují jako celek, MB se pohybují individuálně, mohou opustit oblast ostatních MB Epiteliální-mezenchymální tranzice (EMT) • tranzice/přepnutí epiteliální buňky v buňku mezenchymální vyžaduje změnu morfologie, buněčné architektury, adheze a migrační kapacity Fenotypické znaky • zvýšená migrační kapacita • trojrozměrná invaze • rezistence k anoikis, k apoptóze Molekulární znaky • zvýšená exprese N-kadherinu a vimentinu • zvýšená exprese transkripčních faktorů jako SNAIL, TWIST, ZEB1, SLUG • jaderná lokalizace ß-kateninu • inhibice exprese E-kadherinu Epiteliální-mezenchymální tranzice • EMT zahrnuje funkční tranzici polarizovaných epiteliálních buněk v pohyblivé mezenchymální buňky, které produkují komponenty ECM Kalluri R and Weinberg RA. J Clin Invest 119 (2009) 1420-1428 EMT typu 1 • souvisí s implantací embrya a gastrulací; vede ke vzniku mezodermu a endodermu a k pohyblivým buňkám neurální lišty • nezpůsobuje fibrózu (zmnožení vaziva), neindukuje invazivní fenotyp • generuje mezenchymální buňky, které mohou následně prodělat MET a vytvářet sekundární epitel Kalluri R and Weinberg RA. J Clin Invest 119 (2009) 1420-1428 EMT typu 2 • souvisí s hojením ran, regenerací tkání a fibrózou • program EMT začíná jako součást reparace tkání, generuje fibroblasty, které jsou nutné k rekonstrukci tkání • fibróza je důsledkem přetrvávajícího zánětu, je to vlastně neustálý, nekončící proces hojení Kalluri R and Weinberg RA. J Clin Invest 119 (2009) 1420-1428 EMT typu 3 • objevuje se u neoplastických buněk, které prodělaly genetické a epigenetické změny, a to hlavně v genech, které upřednostňují klonální růst a vývoj lokalizovaných nádorů • buňky karcinomů prodělávajících EMT typu 3 mohou invadovat a metastázovat Kalluri R and Weinberg RA. J Clin Invest 119 (2009) 1420-1428 Přínos EMT k progresi nádorů epiteliální buňky ztrácejí polaritu, uvolňuje se jejich vazba na bazální membránu  EMT a angiogenní zapnutí  vstup nádorových buněk do cirkulace  opuštění krevního řečiště a vytvoření mikro- a následně makro- metastázy, což může zahrnovat MET a návrat k epiteliálnímu fenotypu Kalluri R and Weinberg RA. J Clin Invest 119 (2009) 1420-1428 Spojení extracelulárních signálů a EMT transkripčních faktorů Tam WL a Weinberg RA: The epigenetics of epithelial-mesenchymal plasticity in cancer. Nat Med 19 (11) 2013, 1438-1449 • fyziologická aktivace programu EMT závisí na souběhu mnoha signálů ze stroma (TGF-, WNT, PDGFs, IL-6) • primární reakcí buňky je exprese/aktivace EMT-TFs („EMTinducing transcription factors“: TWIST, SNAIL, SLUG, ZEB1) • EMT-TFs reprimují (ovlivňují) expresi svých cílových genů v součinnosti s epigenetickými mechanismy (acetylace, methylace histonů,…) Díky epiteliální-mesenchymální plasticitě se nádorové buňky adaptují během metastazování • vlivem EMT-indukujících signálů subpopulace epiteliálních buněk ztrácí epiteliální charakter a uvolněním z primárního nádoru se mezenchymální charakter prohlubuje, což posiluje potenci k intravazaci, průchodu cévním/ lymfatickým systémem… • v cílovém místě jsou buňky vystaveny odlišným signálům mikroprostředí a podle toho buď podstupují dormanci nebo MET a následnou tvorbu sekundárního nádoru, který je obvykle opět tvořen převážně epiteliálními buňkami Tam WL a Weinberg RA: The epigenetics of epithelial-mesenchymal plasticity in cancer. Nat Med 19 (11) 2013, 1438-1449 • invaze z primárního nádoru je spíše kolektivní: migruje spíše větší soudržná skupina (shluk) buněk než jednotlivé buňky; soudržnost zajišťuje E- kadherin EMT: metastazující buňky Lambert AW et al: Cell, 168 (4), 2017: 670-691 • invadující skupina buněk tak představuje komplex různých buněk: na čelní/invadující hraně skupiny jsou buňky zajišťující postup vpřed, tj. nabývající výrazněji mezenchymální charakter, zatímco uvnitř komplexu si buňky více ponechávají epiteliální charakter EMT - pleiotropní dopad na průběh metastatické kaskády  EMT představuje dynamický a plastický program, vede k indukci rozmanitých fenotypických stavů: od plně epiteliálního k mezenchymálnímu stavu  EMT přispívá (epigenetickými mechanismy) k fenotypické heterogenitě nádorů  indukce EMT zároveň jako by buňku posouvala ke „kmenovosti“; v obou procesech se uplatňují podobné/ překrývající se programy, například TFs a podobně (přinejmenším v kontextu některých tkání)  EMT zvyšuje rezistenci k buněčné smrti a rezistenci k terapii, včetně imunoterapie a také k působení imunitního dohledu vlastního mikroprostředí Zhang Y and Weinberg RA. Front Med 12 (4) (2018) 361-373 Degradace ECM  na degradaci ECM (a bazální membrány) se mohou podílet čtyři třídy proteolytických enzymů: cysteinové proteázy, aspartátové proteázy, serinové proteázy a metaloproteinázy  především metaloproteinázy ECM (MMPs) hrají klíčovou roli při remodelaci ECM: • za fyziologických podmínek při vývoji tkání plodu • postnatálně při opravách tkání • jejich deregulovaná aktivita je podstatou mnoha patologií (artritida, astma, atheroskleróza, chronická tvorba vředů,…) • a je také součástí procesu tvorby metastáz Regulace aktivity MMPs • většina MMPs není in vivo konstitutivně v buňkách exprimována • exprese MMPs je regulována především na úrovni transkripce • exprese většiny MMPs (-1, -3, -7, -9, -10, -12, -13 a -19) je indukována růstovými faktory, cytokiny, onkogeny, hormony a kontaktem s ECM Regulace exprese MMPs na úrovni transkripce Overall CM and Lopez-Otin C. Nat Rev Cancer 2 (2002) 657-671 Regulace aktivity MMPs • většinou jsou MMPs secernovány jako latentní prekurzory (zymogeny); proteolytická aktivita MMPs je uvolněna proteolytickým štěpením v extracelulárním prostoru • aktivita MMPs v pericelulárním prostředí je přísně regulována nespecifickými proteinázovými inhibitory a • specifickými tkáňovými inhibitory TIMPs („tissue inhibitors of metalloproteinases“); TIMPs jsou exprimovány různými buněčnými typy MMPs a tvorba metastáz • existuje pozitivní korelace mezi expresí MMP a metastatickým potenciálem maligních nádorů příklady: • exprese MMP-1 asociuje se špatnou prognózou u kolorektálních nádorů a nádorů jícnu • MMP-13, MMP-7 a MTI-MMP jsou specifické pro metastazující nádory odvozené z keratinocytů • MMP-2 je markerem maligní transformace epiteliálních buněk děložního čípku MMPs a tvorba metastáz  u maligních nádorů je většina MMPs produkována stromálními buňkami spíš než samotnými nádorovými buňkami • nádorové buňky mohou secernovat faktory (např. MMP induktor EMMPRIN), které potencují expresi MMP-1, -2 a -3 fibroblastů • také další cytokiny a růstové faktory secernované zánětovými buňkami, které infiltrují nádor, ale i nádorovými a stromálními buňkami, mohou modulovat expresi MMPs  při invazi maligního nádoru kooperují nádorové buňky, stromální buňky a zánětové buňky Různé buňky produkují různé MMPs + - aktivace latentní MMP LC - lymphocyte PMN - polymorphonuclear leukocyte MC - monocyte Johansson N et al. CMLS 57 (2000) 5-15 Při remodelaci ECM kooperují různé buňky nádor je komplexní tkáň Úloha adhezivních komplexů při tvorbě metastáz • každý krok při tvorbě metastáz zahrnuje zrušení stávajících a ustavení nových adhezivních interakcí • adhezivní interakce jsou funkcí buněčných receptorů, jejichž exprese a funkce je přísně regulována  nádorové buňky jsou obecně méně adhezivní než buňky normální a vytvářejí méně extracelulární matrix Zánětová kaskáda - A Může sloužit jako mechanistické paradigma pro model metastatické kaskády. Volně cirkulující neutrofil, žádná interakce s endoteliálními buňkami. Buck CA. Zánětová kaskáda - B Následkem infekce nebo poranění, působením histaminů, cytokinů,… začnou endoteliální buňky exprimovat specifické receptory - selektiny ty interagují se specifickými receptory na povrchu neutrofila a zpomalují ho. Buck CA. Zánětová kaskáda - C Dochází k expresi specifických receptorů - integrinů - na povrchu neutrofila, a také specifických receptorů - členů imunoglobulinové nadrodiny - na povrchu endoteliálních buněk, dojde k vzájemné adhezi. Přestávají se exprimovat selektiny. Buck CA. Zánětová kaskáda - D Pohyb neutrofila skrz endoteliální buňky je spojen s expresí další sady specifických receptorů - např. CD44. Buck CA. Obecná struktura adhezivního komplexu  Klíčovou strukturou adhezivního komplexu je receptor. • extracelulární doména interaguje s příslušným ligandem: signální molekulou nebo specifickou strukturou ECM nebo sousední buňky • hydrofobní transmembránová doména • cytoplazmatická doména má regulační elementy zajišťující transdukci signálu z extracelulárního prostředí do buňky (proteinkinázy, fosfatázy, proteiny G, fosfolipázy) a/nebo interaguje s některými složkami cytoskeletonu Obecná struktura adhezivního komplexu Buck CA. Hlavní skupiny adhezivních receptorů • kadheriny • integriny • imunoglobulinová nadrodina • selektiny • další adhezivní receptory (CD44) Kadheriny  nadrodina jednořetězcových transmembránových glykoproteinů, které zprostředkovávají homotypické adherence buňka-buňka, a to svými N-koncovými extracelulárními doménami a kalcium dependentně  hrají klíčovou roli v rozpoznávání buněk a jejich třídění během vývoje  jsou exprimovány ve vysokých hladinách ve všech pevných tkáních  existuje mnoho různých kadherinů, nejlépe prostudovány a popsány jsou „epiteliální“ E-kadheriny Obecná struktura kadherinů N-koncová část kadherinů zprostředkovává homofilní interakce. Intracelulární C-koncová část interaguje s -kateniny a -kateniny, ty asociují s -kateniny a společně zprostředkovávají vazbu kadherinů na aktinové složky cytoskeletonu. Buck CA. E-kadherin a nádory • Hlavní adhezivní molekula epiteliálních (E) buněk. • Během morfogeneze je exprese kadherinů modulována: buňky se pohybují z jedné buněčné vrstvy do druhé, a to je vždy spojeno se ztrátou exprese původního kadherinu a s indukcí exprese jiného kadherinu. • Ztráta exprese E-kadherinu je často detekována u epiteliálních nádorů. Ztráta exprese nebo funkce E-kadherinu výrazně koreluje s invazivitou a tvorbou metastáz nádorů - často koinciduje s „přepnutím“ benigního nádoru na invazivní typ. Dědičný difúzní nádor žaludku HDGC • „Hereditary Diffuse Gastric Cancer“ • Autozomálně dominantní syndrom související s vrozenými mutacemi genu CDH1 (16q22.1), který kóduje E-kadherin. • Především histologicky difúzní, málo diferencované nádory žaludku, ale také zvýšené riziko kolorektálních nádorů a nádorů prsu. • Mutace CDH1 časté (9/16) také u sporadických difúzních nádorů žaludku (50%) a u lobulárního karcinomu prsu (až 60%). • Poměrně vzácně (1/9/16) se vyskytuje „LOH“ CDH1; častá (9/16) metylace promotoru CDH1 jako „druhý zásah“. • Agresivní nádory - zřejmě souvisí se zvýšenou ochotou metastázovat. • Mutace CDH1 se ale zřejmě uplatňuje i v iniciačních stádiích kancerogeneze - zřejmě souvislost s regulací dráhy WNT/-katenin: funkční E-kadherin inhibuje progresi buněčného cyklu pravděpodobně downregulací cytoplazmatického -kateninu, a to nezávisle na zprostředkování buněčných adhezí Integriny  heterodimerické receptory složené z 1  a 1  podjednotky  popsáno 18 různých  a 8 různých  podjednotek; ty kovalentně asociují a tvoří 24 různých integrinů  mají velkou extracelulární doménu, krátkou transmembránovou a relativně malou intracelulární doménu  nejvýznamnější skupina molekul odpovědná za adhezi buňkaECM, ale také buňka-buňka: 18 různých integrinů se váže na proteiny ECM (RGD*, kolagen, laminin), další integriny na proteiny na povrchu jiných buněk (leukocyty), některé integriny zprostředkovávají oba typy interakcí * historicky první specifické místo rozpoznávané integriny byla sekvence RGD (Arg-Gly-Asp) nalezená u fibronektinu, postupně nalezená i u dalších proteinů ECM, virových proteinů, toxinů a růstových faktorů; většina integrinů ale tuto sekvenci nerozpoznává Struktura integrinů Buck CA. Funkce integrinů Integriny jsou univerzální receptory: transdukují signály: • z vnějšku buňky dovnitř - regulují pohyb, morfologii, proliferaci a genovou expresi • zevnitř buňky směrem ven - podle vnitřních okolností může být měněna vazebná specifita integrinů • uvnitř buňky, jsou-li lokalizovány na jiných membránách než cytoplazmatické Intracelulární proteiny interagující s integriny: • komponenty cytoskeletonu: tensin, -actinin, talin, vinculin, Faktin, paxillin, FAK • molekuly různých signálních drah: FAK, Src-like kinázy, Ras, MAP kinázy Funkce integrinů Existuje funkční vztah mezi integriny a metaloproteinázami: • některé integriny ovlivňují expresi některých MMP genů • některé integriny ovlivňují sekreci některých MMPs • některé integriny ovlivňují aktivitu MMPs • některé komponenty ECM aktivují integriny a následkem je specifická degradace ECM: „integrin-guided proteolysis“ FAK - „focal adhesion kinase“ • Nereceptorová tyrozin protein kináza. První, o které se zjistilo, že je aktivovaná po aktivaci integrinů. • Po aktivaci se FAK autofosforyluje na Tyr397 a tím se vytvoří vazebné místo pro SH2 doménu Src nebo Fyn. • Src potom fosforyluje další substráty včetně cytoskeletálních komponent, především paxillinu a tensinu. • FAK hraje klíčovou roli při přenosu signálů přežití z ECM (anoikis) - pravděpodobně inaktivací proapoptotických proteinů Bad a prokaspázy-9. Struktura FAK kinázy N-koncová doména: interakce s integriny, růstovými faktory centrální doména: katalytická C-koncová doména: interakce protein-protein Parsons JT et al. Oncogene 19 (2000) 5606-5613 Integriny a nádory • Změny exprese nebo funkce integrinů popsány během proměny nádorů v metastazující invazivní formy. • Změny exprese nebo funkce integrinů způsobují „anchorageindependence“: za normálních okolností právě integriny spouštějí anoikis (apoptózu v důsledku ztráty adheze). • Vztah ECM-integriny se výrazně uplatňuje také během angiogeneze nádorů: přežití angiogenních endoteliálních buněk nádorových cévek je závislé na integrinech v. Pohyb nádorových buněk vaskulárním systémem • Během tvorby metastáz nádorové buňky nejdříve uvolní své vazby s ostatními buňkami v nádoru (E-kadheriny) a prostoupí ECM směrem ke krevnímu systému (integriny). • Pro vstup do vaskulatury („intravasation“) musí prostoupit také vaskulárním endoteliem a v této fázi se uplatňují především selektiny a členové imunoglobulinové nadrodiny (včetně VCAM- 1, ICAM-1, -2 a -3 a dalších), integriny, CD44, glykoproteiny nalezené u lymfocytů a orgánově specifické endoteliální adhezívní molekuly jako např. Lu-ECAM-1 („lung-endotelial cell adhesion molecule“). Selektiny • Fungují prostřednictvím terminální kalcium-dependentní lektinové domény a jsou především zodpovědné za heterotypické adheze buňka-buňka, a to především mezi endoteliálními a krevními buňkami. • V klidu jsou buňky schopny adherovat prostřednictvím celé řady ligandů. Ale cirkulující buňka může být zpomalena (a získat tak možnost interagovat s dalšími ligandy) pouze interakcí selektinů s endoteliem.  Selektiny hrají roli v adhezi metastatických buněk k endoteliu. Receptory imunoglobulinové nadrodiny • Zprostředkovávají homotypické a heterotypické adheze buňka-buňka. • Po zpomalení nádorových buněk selektiny a CD44 nádorové buňky pravděpodobně pevněji interagují s endoteliálními buňkami a následně vstupují do stroma cílového orgánu. V této fázi se zřejmě výrazněji uplatňují právě receptory imunoglobulinové nadrodiny. Imunoglobulinové receptory a nádory  velmi divergentní skupina receptorů  při metastazování nádorů se nejvíce uplatňují receptory odpovědné za interakce s endoteliálními buňkami - např. ICAMs (např. melanomy: korelace exprese ICAM-1 s metastatickým potenciálem) a VCAM-1 • CEA - historicky prominentní receptor - spojen s progresí kolorektálních karcinomů • NCAM - spojen s progresí některých neuroendokrinních nádorů, Wilmsova nádoru, malobuněčných nádorů plic, feochromocytomů,... • EpCAM – marker epiteliálních buněk Orgánově specifické metastazování • nádory prsu často metastazují do kostí a plic a méně často do jater a mozku • nádory prostaty preferenčně metastazují do kostí • pacienti s kolorektálními nádory mají často metastázy v játrech • melanomy mají tendenci metastazovat do jater • neuroblastomy, karcinomy štítné žlázy, prostaty, ledvin metastazují nejčastěji do kostí • nádory ledvin, trávicího traktu a plic často metastazují do mozku 1. Metastazování je ovlivněno tokem krve • počáteční osud nádorových buněk uvolněných z primárního nádoru ovlivňují mechanické faktory • tok krve ovlivní, do kterého orgánu jako prvního dorazí nádorové buňky uvolněné z primárního nádoru Způsoby šíření nádoru () • hematogenní - šíření cévním systémem • lymfogenní - šíření lymfatickým systémem (posléze může vstoupit do žilního systému) • porogenní - šíření tělními dutinami Tok krve ovlivňuje metastazování • Krev z většiny orgánů je vedena žilním systémem (B) přímo do srdce a míří do plic. Potom se vrací do srdce a je rozváděna tepnami (Č) do celého těla. • Ale například krev ze střev vede nejdříve do jater (R) než vstoupí do žilního systému. • V celém těle je nadbytek extrabuněčné tekutiny veden do lymfatických cév (O) a přes lymfatické uzliny do žilního systému. () Chambers AF et al. Nat Rev Cancer 2 (2002) 563-572 • Například nádorové buňky uvolněné z primárního nádoru prsu jsou vedeny do srdce, a dále do kapilárního systému plic. Některé buňky projdou tímto systémem a jsou dále transportovány cévním systémem do vzdálených orgánů, jako například do kostí. Jiné buňky mohou tvořit metastázy v plicích. • Naproti tomu nádorové buňky uvolněné z nádoru střeva jsou vedeny nejdříve do jater. Tok krve ovlivňuje metastazování Chambers AF et al. Nat Rev Cancer 2 (2002) 563-572 • relativní velikost nádorových buněk a kapilár ovlivní efektivitu, s jakou budou buňky zachytávány na daném místě • jsou-li buňky zachyceny v orgánu, rozhodnou o schopnosti v daném místě přežít /a proliferovat molekulární interakce mezi buňkami a mikroprostředím  2. Tok krve ovlivňuje metastazování Chambers AF et al. Nat Rev Cancer 2 (2002) 563-572 2. Hypotéza „seed and soil“ • 1889 - Stephen Paget (anglický chirurg): Záleží na kompatibilitě „semen“ (nádorových buněk) a správné „půdy“ (faktory v potenciálním místě nové metastázy).  Molekulární faktory přítomné ve specifickém orgánu významně ovlivní to, zda v tomto orgánu porostou nádorové buňky určitého typu. Tak jsou například nádorové buňky uvolněné z nádoru prsu nebo prostaty, které se dostanou do kostí, zde adekvátně stimulovány k růstu, zatímco buňky jiného typu zde nemohou růst, protože nemají adekvátní stimulaci k růstu. Pre-metastatická nika • podle tohoto konceptu jsou primární nádory schopné ovlivňovat místa sekundárního výskytu takovým způsobem, aby byla vhodnější, přizpůsobenější pro osídlení nádorovými buňkami ještě před jejich příchodem  „primární“ nádorové buňky vysílají signály, kterými aktivují normální hostitelské buňky k tomu, aby začaly remodelovat ECM budoucích sekundárních ohnisek, tak aby se vytvořily permisivní niky - v nepřítomnosti nádorových buněk – které by usnadnily jejich následující kolonizaci  PMN: mikroprostředí ve specifických orgánech připravené ke kolonizaci a diseminaci pro cirkulující nádorové buňky Kaplan RN et al. Nature 438 (2005) 820-827 Guo Y et al. Mol Cancer (2019) doi.org/10.1186/s12943-019-0995-1 Pre-metastatická nika  nádorové buňky secernují během progrese primárního nádoru faktory, které působí systemicky na vzdálená sekundární místa, modifikují lokální mikroprostředí a vtahují imunitní hostitelské buňky k dalšímu přizpůsobení těchto míst pro úspěšnou kolonizaci nádorovými buňkami Cox TR et al. BoneKEy Reports 80 (2012); doi:10.1038/bonekey.2012.80 Nádor jako systémové onemocnění  progrese nádorů ovlivněna vedle genetických změn nádorových buněk a parakrinních interakcí v jejich mikroprostředí také  systémovou odpovědí organismu na nádor  nádor je systémové onemocnění • primární nádor ovlivňuje například kostní dřeň: z té jsou uvolňovány buňky do nádorového mikroprostředí, kde nádor stimulují (například některé aktivované BMC uvolňují faktory přeměňující fibroblasty v mikroprostředí nádorů na CAFs, které exprimují prozánětlivé faktory a faktory remodelující ECM) • dále například slezinu, pre-metastatické niky, … • některé agresivní primární nádory utlumují protinádorovou imunitu organismu a tím vytvářejí tumor-permisivní systémové prostředí McAllister SS a Weinberg RA. Nat Cell Biol 16 (2014) 717-727 Nádor jako systémové onemocnění  kromě rozpustných cytokinů jsou uvolňovány také  exosomy (obsahující lipidy, proteiny, mRNAs, miRNAs), které potom v celém těle mohou ovlivňovat pro-metastatické progenitory, pro-angiogenní buňky, atd. … obecně nejrůznější hostitelské buňky, a to i ve vzdálených tkáních, které následně mohou stimulovat (ale také suprimovat) další růst a vývoj primárních nádorů i metastáz – obecně tzv. systémové podněcování (systemic instigation)  krevní destičky fungují jako doručovatelé „informací“ na dlouhé vzdálenosti mezi agresivně rostoucím nádorem a indolentními nádorovými buňkami (dopad může být jako pro-angiogenní, tak anti- angiogenní) McAllister SS a Weinberg RA. Nat Cell Biol 16 (2014) 717-727 Nádor jako systémové onemocnění  vedle samotného nádoru mohou být možná i další systémové způsoby podněcování nádorů, například:  obezita, o níž epidemiologické studie prokázaly, že zvyšuje incidenci některých nádorů,  těhotenství, které pravděpodobně může stimulovat rozvoj počínajících nádorů prsu,  chirurgické zákroky obecně, které zatím neznámým mechanismem zřejmě mohou stimulovat rozvoj dormantních metastáz McAllister SS a Weinberg RA. Nat Cell Biol 16 (2014) 717-727 Nádor jako systémové onemocnění McAllister SS a Weinberg RA. Nat Cell Biol 16 (2014) 717-727 Nádor je komplexní tkáň  Nádor je systémové onemocnění 3. Hypotéza pozičního kódu • Podle této starší představy nese buňka na svém povrchu jakýsi systém adres (soubor molekul, který může být rozpoznán molekulami jiných buněk), který určuje, kam která buňka patří („homing“). • Tyto adresy jsou „zapsány“ formou konfigurace exprimovaných adhezivních receptorů. Orgánově specifické metastázování • Vaskulatura jednotlivých tkání je vysoce specializovaná - tkáňově specifická. Endoteliální buňky nesou „homing peptides“ specifické pro dané tkáně - potenciálně využitelné pro „adresnost“ terapie! • Orgánově specifického metastázovaní se nějak účastní vaskulární endotelium: metastatické buňky adherují ke kapilárním endoteliálním buňkám, ale ne k endoteliu velkých cév ( mikrometastázy se vždy nacházejí v kapilárních stěnách!). Ruoslahti E and Rajotte D. Annu Rev Immunol 18 (2002) 813-827 • Zdá se, že neexistují přímo konkrétní receptory restriktivně exprimované na endoteliu konkrétní tkáně. Spíš je to záležitost kvantitativní: různá množství různých kombinací (konfigurace) více receptorů exprimovaných v endoteliálních buňkách. Příklad odlišně uspořádané vaskulatury Kim et al. Cancer Res Treat 49 (1): 1-9, 2017  součástí všech krevních cévek jsou endoteliální buňky (ECs), ale ty stejné ECs mohou spoluvytvářet zcela odlišné krevní cévy • krevní mozková bariéra (BBB): musí striktně blokovat průchod toxických látek do mozku – nejtěsnější mezibuněčné spoje mezi ECs vznikající za účasti astrocytů • jaterní sinusoidy: v jaterní tkáni, která zajišťuje detoxifikaci, musí být umožněna aktivní výměna materiálu mezi hepatocyty a krevními vlásečnicemi; ve vlásečnicích se proto tvoří otvory (tzv. sinusoidy) tuto výměnu umožňující Příklad odlišně uspořádané vaskulatury Kim et al. Cancer Res Treat 49 (1): 1-9, 2017 Nádor jako systémové onemocnění  cancer genomic studies: analyzují genomické mutace během procesu karcenogeneze; ty jsou časté (a dobře známé) během nemetastatických fází vývoje nádorů; ale nejsou známé mutace ve fázi přechodu do metastatické fáze  zde se pravděpodobně mnohem více uplatňují změny v mezibuněčné kooperaci mezi nádorovými a nenádorovými buňkami – což zřejmě reprezentuje přeměnu lokálního onemocnění v systémové   cell network study Kim et al. Cancer Res Treat 49 (1): 1-9, 2017 Nádor jako systémové onemocnění nejsou známé mutace související s přechodem do metastatické fáze genomické mutace provázející proces karcenogeneze jsou časté (a dobře známé) během ne-metastatických fází vývoje nádorů Kim et al. Cancer Res Treat 49 (1): 1-9, 2017 Efektivita metastázování • celý proces tvorby metastáz je málo efektivní; první fáze metastatické kaskády jsou efektivnější, pozdnější fáze (kolonizace) mohou být extrémně málo efektivní • odhaduje se, že uspěje asi 0,01% buněk; většina diseminovaných buněk (DTCs) je buď eliminována, nebo vstoupí do dormantního stavu (na týdny, měsíce i roky)  metastázy se mohou objevit roky po „vyléčení“ primárního nádoru • dormance (definice): klinicky asymptomatický stav, kdy diseminované nádorové buňky zůstávají nedetekovatelné po dobu 5- 7 let po zdánlivě úspěšné léčbě primárního nádoru • dormantní buňky často unikají terapii, protože ta je často namířena na dělící se buňky Dormantní mikrometastázy 1. mikrometastázy, kterým chybí některá klíčová vlastnost, např. schopnost indukovat angiogenezi 2. výživová deprivace může indukovat intenzivní autofagii, která způsobí, že se nádorové buňky zmenší, stáhnou a přetrvávají ve stavu reverzibilní dormance 3. dormance vyvolaná anti-růstovými signály normálního ECM v novém mikroprostředí 4. aktivní suprimující vliv imunitního systému