Molekulární a buněčná
biologie nádorů
Prof. RNDr. Jana Šmardová, CSc.
Ústav experimentální biologie
Přírodovědecká fakulta
MU Brno
2020
Bi9910
středa 14.00 – 16.00
A11 – č. 306
12. Epigenetika
nádorů
Molekulární a buněčná
biologie nádorů
2020
nádory byly tradičně vnímány jako
genetická nemoc, ale je jasné, že
součástí procesu jejich vývoje jsou i
změny epigenetické
• epigenetika studuje dědičné změny v
genové expresi, ke kterým dochází
nezávisle na primární sekvenci DNA
Profesor Andrew Feinberg
(ředitel Centra pro epigenetiku v lékařském
ústavu Johna Hopkinse)
„Ke genetickým mutacím u rakovinou zvrhlých
buněk samozřejmě dochází, ale epigenetické změny
je předcházejí.“
Tři fáze vývoje nádoru:
1. epigenetické rozvracení buněk
2. nastartování mutací uvnitř této populace buněk
3. genetická a epigenetická nestabilita
Epigenetické mechanismy
1. metylace DNA
2. posttranslační kovalentní modifikace histonů
3. nekovalentní mechanismy: remodelace nukleozomů a
inkorporace histonových variant
4. nekódující RNA (miRNAs)
 regulují fungování genomu změnou lokální struktury
chromatinu – primárně regulací dostupnosti a kompaktnosti
1. Metylace DNA
• kovalentní modifikace cytosinu v pozici 5´v dinukleotidu CpG
• metylace cytosinu se děje přenosem metylové skupiny z donoru:
S-adenosylmethioninu za účasti DNA metyltransferáz
• DNMT1 – „maintenance“ – 10x vyšší afinita k semimetylované
DNA, mnohem aktivnější než DNMT3a a 3b
• DNMT3a a DNMT3b – de novo – metylují nemetylovanou DNA
• delece DNMT u myší je embryonálně letální
• vzorec metylace DNA je u dospělých buněk relativně stabilní,
významné změny jsou popisovány v souvislosti se stárnutím
2. Posttranslační kovalentní
modifikace histonů
• DNA je uspořádána do chromatinu; základními jednotkami jsou
nukleozomy
• chromatin je velmi stabilní a odolná struktura; (1) ochrana DNA,
ale (2) snížená dostupnost pro DNA vazebné proteiny (transkripce,
replikace, opravy DNA, rekombinace)
• DNA: 146 pb
• oktamer histonů: tetramer (H2A/H2B)2 a dva
dimery H3/H4
• úseky DNA mezi nukleozomy (linker DNA)
různě dlouhé, interagují s histonem H1 a
podílejí se na vytváření vyšších struktur
chromatinu
Uspořádání histonů v
nukleozomu
 C-koncové části histonů tvoří jádro nukleozomu
 N-části vybíhají do stran, tvoří tzv. N-tails a jsou volněji přístupné
různým modifikacím
Hayes JJ, Hansen JC., PNAS 99 (2002) 1752-1754
Mechanismy přestavby
chromatinu
 kovalentní modifikace histonů:
- acetylace ( metylace DNA)
- metylace
- fosforylace
- ubikvitinace
- sumoylace
- ADP ribozylace
 ATP-dependentní chromatin remodelující komplexy
 inkorporace histonových variant
Acetylace histonů
• acetylace zbytků lysinu: celkem 26 různých možností na 1
nukleozom
• rovnováha histon acetyl transferáz (HATs) a histon deacetyláz
(HDACs)
• acetylace/deacetylace histonů i nehistonových proteinů, v jádře i
cytoplazmě
• HATs: (1) GNAT (Gcn5-related N-acetyltransferázy); (2) MYST
(MOZ, Tip60, Ybf2/Sas3,..); (3) CBP/p300
• HDACs: HDAC1 až 3 - homologní s RPD3, HDAC4 až 8 homologní
s HDA1; celkem 18 hHDACs
• retroviry (RNA viry): obsahují ve svém genomu onkogen (akutně
transformující viry) nebo aktivují protoonkogen, vedle kterého se
integrovaly (inserční mutageneze; pomalu transformující)
• DNA nádorové viry používají jinou strategii transformace: kódují
proteiny (virové onkoproteiny), které interagují s nádorovými
supresory (RB, p53, p300/CBP) hostitelské buňky a tak hostitelskou
buňku tlačí do S fáze:
SV40: velký T antigen různými doménami interaguje s p53, RB,
p300/CBP
adenoviry: E1A interaguje s RB a p300/CBP; E1B interaguje s p53
papilomaviry HPV-16, HPV-18: E6 interaguje s p53, p300/CBP; E7
interaguje s RB
Onkogenní (nádorové) viry
Acetylace histonů a regulace
transkripce
• acetylace histonů je spojena se
vznikem tzv. otevřené struktury
chromatinu a s aktivací transkripce
• deacetylce histonů spojena s
uzavíráním struktury chromatinu a s
represí transkripce
• HATs a HDACs jsou přiváděny k
cílovým sekvencím prostřednictvím
sekvenčně specifických
transkripčních faktorů
Metylace DNA a deacetylace
histonů
 CpG metylace DNA souvisí s represí transkripce - s udržováním
stabilnějšího stavu chromatinu
 metylované oblasti DNA jsou rozpoznávány proteinem MeCP2 (jeho
doménou MBD - „methyl-DNA binding domain“) a dále specificky
interagují (doménou TRD -“transcriptional repressor domain“) s
korepresorem Sin3, který přivádí k metylovaným oblastem HDACs
A. přechodná represe B. stabilní represe
Fosforylace histonů
• fosforylovány mohou být serinové zbytky
• mitogenní signály spouštějí kaskádu MAP kináz:
Rsk-2 fosforyluje H3 na serinu 10 - tato fosforylace „otevírá“
strukturu chromatinu a umožňuje aktivaci genů spojených s
buněčným dělením
podle typu stimulace další histon kináza - MSK1
• fosforylace histonů je funkčně provázaná s acetylací
Metylace histonů
• metylovány mohou být lysiny a argininy; H2B, H3 (lys 4, 9, 27, 36) a
H4 (lys 20)
 jaderné receptory aktivují transkripci za účasti koaktivátorů z rodiny
proteinů p160: s nimi interaguje také metyltransferáza CARM1
(„coactivator-associated arginine methyltransferase 1“) - metyluje
zbytky argininu na H3 a potencuje transaktivaci jadernými receptory
• příbuzná metyltransferáza PRMT1 metyluje H4
 metylace lysinu může souviset s aktivací nebo represí transkripce –
v závislosti na pozici metylovaného lysinu a na stupni metylace: např.
trimetylace lysinu 4 na histonu H3 (H3K4met3) je navýšena na
transkripčně aktivních promotorech, zatímco trimetylace H3K9met3 a
H3K27met3 je na transkripčně reprimovaných promotorech
• Suv39H1 metyluje lysin 9 histonu H3 – spojeno s represí
Metylace histonů: EZH2
EZH2 (enhancer of zeste homolog 2)
 histon–lysin–N-metyltransferáza
 účastní se metylace DNA a represe transkripce
 katalyzuje metylaci lysinu (met3) v pozici K27 histonu H3
 je funkční, enzymatickou součástí komplexu PRC2 (polycomb
repressive complex 2), který je odpovědný za zdravý embryonální
vývoj, tím, že epigeneticky ovlivňuje geny odpovědné za regulaci
vývoje a diferenciace
Metylace histonů: EZH2
 EZH2 je integrální součástí PRC2 (polycombe repressive complex
2)
 PRC2 prostřednictvím EZH2 katalyzuje H3K27met3
 PRC1 rozpoznává H3K27met3 a zprostředkuje ubikvitinaci
H2AK119Ub, která pravděpodobně přivádí do oblasti DNMTs a
vede k metylaci DNA a transkripčnímu umlčení
Stahl M. et al., PLOS Genetics DOI:10.1371/journal.pgen.1006193; 2016
Ubikvitinace histonů
• monoubikvitinace, a to na C-konci histonů: lysin 119 histonu
H2A a lysin 123 histonu H2B
• spojeno s transkripčně aktivním nebo naopak reprimovaným
(H2A K119) stavem chromatinu
• polyubikvitinace histonů je také integrální součástí oprav DNA
Hypotéza „histonového kódu“
3. Remodelace nukleozomů a
inkorporace histonových variant
ATP-dependentní chromatin
remodelující komplexy
• multiproteinové komplexy, které mění konformaci histonů a DNA
(v promotorových oblastech), využívají k tomu energii z
hydrolýzy ATP
• substrátem není mononukleozom, spíše řetězec nukleozomů –
mění pozici nukleozomů na DNA a tvoří „nucleosome-free“
oblasti
• SWI/SNF, RSC, NURF, CHRAC, ACF, FACT
• klasifikace podle ATPázové podjednotky:
SWI2/SNF2
ISWI
Mi-2 (+ deacetylázová podjednotka) (CHD komplexy)
• jejich součinnost nutná pro aktivátory i represory
Inkorporace histonových
variant
• inkorporace histonových variant (např. H3.3 a H2A.Z; H2A.1,
H2A.2, H2A.X,…) ovlivňuje stav nukleozomů a tím transkripční
aktivitu (a další aktivity) v oblasti, kde se takto modifikované
nukleozomy nacházejí
• například H3.3 a H2A.Z jsou preferenčně v promotorech
aktivních a reprimovaných genů
4. Nekódující RNA (miRNAs)
• miRNAs: malé (~22 nt; 18-25 nt), nekódující RNA, které regulují
genovou expresi posttranskripčním umlčováním cílových genů
vazbou do 3´netranslatované oblasti cílových mRNAs
• miRNAs jsou exprimovány tkáňově specificky
• jedna miRNA může mít stovky cílových mRNAs
Epigenetické změny u nádorů
rozsáhlá proměna epigenomu u nádorových buněk:
 globální hypometylace DNA, hypermetylace specifických
promotorů
 změněné expresní profily chromatin modifikujících faktorů
 mutace v genech, které kódují chromatin modifikující faktory, a v
genech kódujících histonové varianty
 globální snížení exprese miRNA
 …
 … atd.
Na nádorové transformaci se podílejí
jak genetické, tak epigenetické
aberace
Taby R, Issa J-PJ., Ca Cancer J Clin 60 (2010) 376-392
1. Metylace DNA a nádory
• původní funkce metylace DNA - ochrana genomu: metylace
zabraňuje šíření parazitických elementů (transpozonů)
• tento obranný systém se začal až později využívat i jako metoda
regulace genové exprese
• distribuce („pattern“) metylace genomu se ustavuje během
embryogeneze
• metylovány především parazitické (např. LTR) a repetitivní
sekvence, konstitutivní heterochromatin v pericentrických
oblastech některých chromozomů
Metylace DNA a nádory
distribuce metylace je v genomu nádorových buněk
často pozměněna:
• rozsáhlé hypometylované oblasti
• hypermetylace ve specifických oblastech
Hypometylace DNA u nádorů
• metylace DNA transkripčně inaktivuje, zabraňuje transpozicím a
homologní rekombinaci, a tak přispívá ke genomové stabilitě
• hypometylace genomu byla první epigenetickou aberací
zaznamenanou u nádorů
u různých nádorů je obsah 5´-metylcytosinu snížen v průměru o
10%
• v nádorových buňkách dochází k rozsáhlým demetylacím
repetitivních sekvencí; stupeň hypometylace koreluje s progresí
onemocnění
• hypometylace repetitivních sekvencí může být časnou událostí
kancerogeneze a může predisponovat buňku k přestavbám genomu
mechanismem rekombinace
Hypometylace DNA u nádorů
 dopad i na specifickou genovou expresi, vedoucí k aktivaci genů,
které stimulují proliferaci: R-ras a MASPIN (nádory žaludku), MAGE
(„melanoma-associated antigen“; melanomy), IGF2 (Wilmsovy
nádory)
• reaktivace normálně umlčených genů (růst stimulujících,
regulujících apoptózu,…)
• reaktivace miRNAs ukotvených v kódujících oblastech některých
genů...
Hypometylace DNA u nádorů
 například až u 20% pacientů s AML má heterozygotní bodové
mutace v genu DNMT3A (měnící AA R882), které snižují
metyltransferázovou aktivitu a způsobují lokální hypometylace
• mutace R882 spojeny s horší prognózou pacientů s AML
 u asi 25% AML nalézány somatické mutace demetyláz, napříkald
TET2 (metylcytozin dioxygenáza 2)
• spojeno s horší prognózou
Koschmann C. et al. Cancer Res 77 (2): 227-266, 2017
Hypermetylace DNA u nádorů
• CpG ostrůvky jsou obvykle
v promotorových oblastech
na 5´- konci genů…
• v nádorových buňkách
hypermetylace v
promotorech genů pro
nádorové supresory,
genů účastnících se
mezibuněčných
adhezí, oprav DNA, …
Widschwendter M, Jones PA., Oncogene 21 (2002) 5462-5482
Geny inaktivované během
kancerogeneze metylací DNA
 geny účastnící se regulace buněčného cyklu:
RB, p16INK4A, p15, p14ARF, p73
 geny účastnící se oprav DNA:
MLH1, O6MGMT, GST, BRCA1
 geny účastnící se apoptózy:
DAP-kináza, prokaspáza-8, TMS1
 invaze nádorů a angiogeneze:
E-kadherin, VHL, APC, LKB1, TIMP3, thrombospondin 1
 členové signálních drah:
ER, RAR, androgen receptor, endothelin B receptor, RASSF1A
Hypermetylace DNA u nádorů
 na rozdíl od genetických změn, které se dějí po skocích,
epigenetické změny mohou být postupné: DNA metylace a
acetylace histonů fungují jako tzv. „transkripční reostat“
 souvislost s principem „tak akorát“…
Hypermetylace DNA u nádorů
• na rozdíl od mutací, hypermetylace promotorů je potenciálně
reverzibilní: taková epigenetická plasticita může odrážet dynamiku
některých procesů během kancerogeneze, např. během tvorby
metastáz:
• např. ztráta E-kadherinu se uplatňuje v počáteční fázi tvorby
metastáz při uvolňování buněk z primárního nádoru X schopnost
invadujících buněk tvořit metastatická ohniska může být podmíněna
re-expresí E-kadherinu
• mutace CDH1, které zcela vyřazují funkci E-kadherinu, jsou vzácné,
s výjimkou pacientů s dědičným nádorem žaludku s vrozenou mutací
CDH1 a pacientů s poměrně vzácným lobulárním karcinomem prsu;
tyto nádory jsou silně invazivní, ale výsledné metastázy se tvoří
spíše podél bazálních membrán, neprorůstají do orgánů
LOI – ztráta imprintingu
• imprinting: proces, kterým jsou geny selektivně exprimovány
homologně s maternální nebo paternální linií
• imprinting: komplexnost variability v distribuci metylovaných
cytosinů (asi 50 milionů dinukleotidů CpG v savčím genomu!) je
„diagnostickým snem, ale analytickou noční můrou“
• LOI („loss of imprinting“) je typickým projevem nádorů
• je LOI příčinou nebo následkem při vývoji nádorů?
• u některých nádorů LOI pravděpodobně předchází a možná
„způsobuje“ vznik nádorů (Wilmsův tumor, embryonální nádory u
Beckwith-Wiedemannova syndromu)
• experimentální data na myších modelech:
- kombinace mutace APC a navozené LOI (inaktivace DNMT1) vedla
k asi 2 až 2.5 navýšení rizika vývoje CRC oproti samotné mutaci
APC
- ovlivněny byly především kmenové buňky
- v tomto uspořádání se projevila více hypometylace než
hypermetylace (aktivace onkogenů?)
- indukce iniciace kancerogeneze, ale retardace pozdních stádií
2. Posttranslační kovalentní
modifikace histonů
• globální ztráta acetylace lyzinu 16 histonu H4 (H4K16ac) a
trimetylace lyzinu 20 histonu H4 (H4K20me3), pravděpodobně
zprostředkována HDACs a vede k transkripční represi
• exprese HDACs často u nádorů zvýšena
• specifická ztráta acetylace lyzinu 9 a dimetylace nebo trimetylace
lyzinu 4 histonu H3 a navýšení dimetylace nebo trimetylace lyzinu 9
a trimetylace lyzinu 27 histonu H3 jsou nalézány v promotorech
některých genů a mohou stimulovat kancerogenezi umlčováním
kritických nádorových supresorů
 obecně jsou mutace v genech kódujících chromatin
regulující faktory docela časté, ale mutace v každém
jednom konkrétním genu spíše vzácné
Kovalentní modifikace
histonů
IDH1 - izocitrát dehydrogenáza 1
• u mnoha různých nádorů, především glioblastomů a gliomů
(včetně mutací IDH2) mutace pozměňující aktivní katalytické
místo IDH1:
 vedou ke změně v produkci metabolitů: přednostně vzniká 2hydroxyglutarát
namísto -ketoglutarátu
 to následně blokuje -ketoglutarát–dependentní demetylázu a
zvyšuje metylaci H3K9 a H3K27 (a také DNA metylaci) a blokuje
buněčnou diferenciaci nádorových buněk
Koschmann C. et al. Cancer Res 77 (2): 227-266, 2017
Kovalentní modifikace
histonů
EZH2
• histon metyltransferáza odpovědná za trimetylaci lyzinu 27
histonu H3 (H3K27met3)
• zvýšená exprese stimuluje kancerogenezi in vitro i in vivo:
detekována u melanomů, lymfomů, nádorů prostaty a prsu
• potenciální marker odlišující agresivní nádory prsu a prostaty od
indolentních variant
• aberantní metylace H3K27 může být také důsledkem inaktivace
UTX, specifické H3K27 demetylázy: somaticky mutována např.
u mnohočetného myelomu (spojeno s horší prognózou), u
dlaždicobuněčných karcinomů jícnu a dalších
• u AML mutace EZH2 spojeny s vyšším rizikem progrese a
recidivy
Kovalentní modifikace
histonů
EZH2
 obecně funkce EZH2 (a funkční dopad a typ mutací EZH2)
charakter protoonkogenu nebo nádorového supresoru: záleží na
nádorově-buněčném kontextu
 EZH2 zvažována jako terapeutický cíl
Koschmann C. et al. Cancer Res 77 (2): 227-266, 2017
Rubinstein-Taybiho syndrom
• vrozené vývojové onemocnění spojené s mentální a růstovou
retardací, typickými obličejovými malformacemi, širokými palci u
nohou a rukou
• příčinou je zárodečná mutace jedné alely genu pro histon acetyl
transferázu CBP (chromozom 16 p13.3) a následná snížená
dávka (haploinsuficience) genu
• onemocnění spojeno se zvýšeným rizikem vzniku nádorů
(především nádory nervové soustavy a hlavy - ne leukémií)
• Gen CBP se nachází ve dvou translokacích spojených s
vývojem leukémií: t(8;16) (AML) MOZ/CBP a t(11;16) 
MLL/CBP.
• diferenciace pluripotentní hematopoietické buňky regulována
koordinovanou expresí celých skupin genů
• klíčovou roli hrají sekvenčně specifické TF
• pro úspěšný průběh jsou nezbytné faktory remodelující
chromatin: celá řada z nich může být během leukemogeneze
poškozená
 paradigma PU.1-GATA1 (myeloidní vs. erytroidní)
Chromatin a leukémie
Akutní promyelocytární
leukémie - APL
• jediný typ leukémie, který odpovídá na diferenciační
terapii, a to ATRA
• všichni pacienti s APL mají translokaci v genu RAR:
t(15;17)  PML-RAR
t(11;17)  PLZF-RAR
t(5;17)  NPM-RAR
t(11;17)  NuMA-RAR
• všechny chiméry mají zachovanou tu část molekuly RAR, která
zajišťuje vazbu na DNA, vazbu ligandu, korepresoru, koaktivátoru
 vazba RA na chiméru ji neaktivuje!!
APL: normální funkce
RAR/RXR
 represivní komplex heterodimeru RXR/RAR
aktivovaný nízkými dávkami RA
Romana Králová, 2016
APL
 represivní komplex RXR/PML-RAR - t(15;17) aktivovaný
farmakologickými dávkami RA
Romana Králová, 2016
 represivní komplex heterodimeru RXR/PLZF-RAR - t(11;17) nelze
aktivovat ani farmakologickými dávkami RA
APL
Romana Králová, 2016
 represivní komplex heterodimeru RXR/PLZF-RAR - t(11;17) nelze
aktivovat ani farmakologickými dávkami RA; lze jej aktivovat
kombinací vysoké hladiny RA a inhibitorů histon deacetyláz
APL
Romana Králová, 2016
AML-ETO
• následek translokace t(8;21), vyskytuje se u 10% pacientů s AML
• AML1 je sekvenčně specifický TF nutný pro myeloidní zrání;
interaguje s koaktivátorovým komplexem p300/PCAF
• ETO reprimuje transkripci interakcí s komplexem N-CoR-Sin3-
HDAC1
 AML/ETO se váže na cílové sekvence AML1, ale místo aktivujícího
komplexu váže komplex represivní
MLL-CBP (p300, MOZ, TIF2,…)
t(11;16)
• MLL může být postižen mnoha různými translokacemi - tvoří
reciproké translokace až se 40 partnerskými geny (mezi nimi
CBP a p300)
• MLL reguluje expresi genů HOX (homeobox geny), mimo jiné v
součinnosti s ATP-dependentními chromatin remodelujícími
komplexy
• translokace vedou ke vzniku chimér, které ztratily schopnost
správné součinnosti s faktory, které mění strukturu chromatinu
 deregulace genové exprese během krvetvorby  maligní
transformace
• MLL: Myeloid/Lymphoid Or Mixed-Lineage Leukemia
MLL
• lokalizován na 11q23
• TF a H3K4 histon metyltransferáza
• H3K4 trimetylace je znakem aktivně transkribovaného
chromatinu; H3K4 trimetylace zprostředkovaná MLL je nutná
pro epigenetické udržování aktivace genů HOX
 mutace se vyskytují u 70% ALL a 35% AML kojenců
 translokace MLL (v chiméře N-konec MLL a C-konec
partnerského proteinu) typické pro mnoho forem agresivních de
novo a sekundárních TR leukémií dětí i dospělých)
 prognóza závisí na typu partnerského genu v translokaci
 mutace MLL2 (12q13.12) a MLL3 (7q36.1) se vyskytují u
dětských meduloblastomů
Inhibitory histon deacetyláz HDACIs
- potenciální nádorová
(„chromatinová“) terapie?
TSA - trichostatin A
SPB - sodium phenylbutyrát
SAHA - suberanilohydroxamic acid
depsipeptidy
a další - trapoxin, oxamflatin,…
Inhibitory histon deacetyláz
 účinek HDACIs je obecný, tj. globálně inhibují represivní aktivitu
TF, které využívají jako korepresory HDACs k remodelaci
chromatinu ( mimo jiné bude jejich biologický efekt tkáňově
specifický)
 HDACIs inhibují růst, indukují apoptózu a diferenciaci u různých
nádorových linií bez souvislosti s histologickým typem
 experimentálně: zřetelný a výrazný protinádorový efekt a zároveň
relativně nízká toxicita u netransformovaných buněk (v
koncentracích, které vedou k akumulaci acetylovaných histonů)
 obecně ale neplatí, že podávání HDACI zvrátí maligní fenotyp!
• pokud je inhibice transkripce zprostředkovaná HDACs spojena s
metylací DNA, pak samotné použití HDACIs nefunguje, ale
může být úspěšné v kombinaci s 5-aza-2´-deoxycytidinem
(inhibitor DNA metyltransferáz)
Inhibitory histon deacetyláz
Dva hlavní typy epigenetické
terapie: inhibitory DNA metyltransferáz a
inhibitory histon deacetyláz
Taby R,Issa J-PJ., Ca Cancer J Clin 60 (2010) 376-392
 u některých leukémií a solidních nádorů fungují v
kombinaci s diferenciačními činidly:
 SAHA je účinný při inhibici růstu buněk nádoru prostaty (in vitro
i in vivo)
 kombinace HDACIs a ATRA při terapii APL
 SAHA v kombinaci s ATRA účinný při inhibici růstu
neuroblastomových buněk
 HDACIs zcitlivují AML buňky s translokací AML1-ETO k účinku
ATRA
 a další…
Inhibitory histon deacetyláz
Inhibitory histon deacetyláz
 rizika a komplikace
• dopad na mnoho dalších proteinů v buňce
• velmi závislé na dávce
• ve vysokých dávkách silně toxické (při nízkých dávkách v
monoterapii malá účinnost)
Koschmann C. et al. Cancer Res 77 (2): 227-266, 2017
Chromatinová/epigenetická
terapie
2004: US Food and Drug Administration (FDA) potvrdila 5azacytidine
jako léčbu pro MDS:
• první terapeutikum pro MDS
• první hypometylační terapeutikum
• první „epigenetické“ terapeutikum
druhým epigenetickým terapeutikem: decitabine (5-aza-2´-
deoxycytidine)
• potenciálně léčba MDS, AML, CML
3. Remodelace nukleozomů a
inkorporace histonových variant
ATP-dependentní chromatin
remodelující komplexy
 některý ze členů komplexu SWI/SNF je mutován u více než 30%
lidských nádorů
Koschmann C. et al. Cancer Res 77 (2): 227-266, 2017
Maligní rhabdoidní nádory -
MRT
• gen hSNF5 (INI1 nebo BAF47) (22q11.2) kóduje jednu z
podjednotek ATP-dependentního chromatin remodelujícího
komplexu SWI/SNF
• mutace tohoto genu spojovány s velmi agresivními maligními
rhabdoidními nádory (MRT) u dětí
• zárodečné mutace hSNF5/INI1 predisponují k MRT ledvin a mozku
• somatické mutace hSNF5 se vyskytují u renálních rhabdoidních
nádorů, centrálních primitivních neuroektodermálních nádorů,
meduloblastomů a leukémií
• mutace jsou bialelické, jejich výsledkem je kompletní delece genu,
zkrácený protein nebo posun čtecího rámce
• hSNF5 je nádorový supresor
Funkce hSNF5
ztráta hSNF5 vede k redukci p16INK4A
a tím ke zvýšení míry fosforylace RB
a tedy ke zvýšení funkce E2F
Snf5 null myši: umírají
během časné
embryogeneze
Snf5 haploinsuficientní myši:
normální vývoj, ale u 5-35%
se vyvine rhabdoidní nebo
jiný nádor (obvykle velmi
agresivní a silně
metastatický)
ztráta funkce hSNF5:
 indukce proliferace
 navýšení chromozomální
nestability
Funkce hSNF5 II
• ztráta funkce SNF5 vede ke zvýšené expresi EZH2 a tedy k
následnému zvýšení H3K27me3 a následně ke zvýšené buněčné
proliferaci
Koschmann C. et al. Cancer Res 77 (2): 227-266, 2017
• BRG1 je součást ATP-dependentního chromatin remodelujícího
komplexu SWI/SNF*, který funguje mimo jiné v součinnosti s
pRB; bez funkčního BRG1 není pRB schopen inhibovat růst;
inaktivující mutace BRG1 byly detekovány v některých
nádorových buněčných liniích, které měly zároveň funkční pRB
• BRG1 a BRM (katalytické podjednotky SWI/SNF) jsou umlčeny
asi u 15 až 20% nemalobuněčných karcinomů plic
* komplex SWI/SNF obsahuje asi 10 podjednotek: např. SNF5,
BRM (Brahma), BRG1 („Brahma related gene 1“) a další
ATP-dependentní chromatin
remodelující komplexy a nádory
ATRX kóduje SWI/SNF-like protein
• odpovědný za depozici histonové varianty H3.3 do
pericentrických a telomerických oblastí heterochromatinu
• loss-of-function mutace detekovány u neuroendokrinních tumorů
pankreatu (PanNETs), dětských glioblastomů, dospělých lowgrade
gliomů a u dalších nádorů
• mutace ATRX vysoce korelují s aktivací ALT mechanismů
prodlužování délky telomer a u gliomů se navzájem vylučují s
aktivní telomerázou
• spojeny i s navýšenou genomickou nestabilitou
ATP-dependentní chromatin
remodelující komplexy a nádory
Koschmann C. et al. Cancer Res 77 (2): 227-266, 2017
Histonové varianty a nádory
• exprese histonové varianty H2A.Z zvýšena u některých typů
nádorů a je spojována se stimulací buněčného cyklu
• na druhé straně, také ztráta H2A.Z u nádorů je spojována s
progresí nádorů
Histonové varianty a nádory
HIST1H3A (H3.1) a H3F3A (H3.3)
• bodové mutace v genech pro tyto histonové varianty se
vyskytují u dětských glioblastomů, chondroblastomů a
nediferencovaných sarkomů
 vedou k následným epigenetickým aberacím, které stimulují růst
nádorů
Koschmann C. et al. Cancer Res 77 (2): 227-266, 2017
4. Nekódující RNA (miRNAs)
• některé miRNAs v normálních buňkách negativně regulují expresi
řady onkogenů a nádorových supresorůp; proto je jejich deregulace
důležitým mechanismem, který se uplatňuje při kancerogenezi
• expresní profily miRNA jsou specificky deregulovány u širokého
spektra lidských patologií, včetně nádorů
• jednotlivé typy nádorů mohou vykazovat specifický „miR podpis“
• na rozdíl od jiných markerů jsou miRs v cévním systému (a
podobně také ve formol-parafinových blocích) značně stabilní, proto
jsou robustní a spolehlivé při analýze
miRNAs a nádory
dva typy změn v expresi miRNA u nádorů:
1. globální míra exprese miRNA v nádorech je buď snížena
(nejčastěji) nebo zvýšena
2. specifická:
• mezi suprimované miRNAs patří: let-7, k jejímž cílům patří ras,
c-myc, CDK6, a miR-24, která cílí na c-myc a E2F2
• zvýšená exprese detekována např. u miR-21, která inhibuje
bcl2, PTEN, EGFR, a miR-196a, miR-373 a miR-125b, které
inhibují annexin A1, p53 a další
miRNAs a nádory
• některé transkripty ovlivněny více miRs: např. exprese c-myc
ovlivněna miR-22, -24, -145, -17-19b a let-7; exprese ras
regulována let-7, miR-372 a -373; exprese BRCA1 regulována miR-
24 a -545
• některé onkoproteiny – transkripční faktory - regulují expresi mnoha
miRs: např. p53 aktivuje expresi miR-34a, ale za jiných okolností –
např. při poškození DNA – aktivuje expresi miR-143, -145 a -16-1;
Myc aktivuje expresi miRs v clusteru miR-17-92, ale reprimuje
expresi nejméně 12 jiných miRs
 složitá, komplexní, zamotaná síť vztahů mezi miRs a některými
onkoproteiny, plná zpětnovazebných kliček…
• např. Myc indukuje expresi miRs v clusteru miR-17-92, ale nejméně
dvě miRs z tohoto polycistronu (17-5b a 20a) suprimují expresi
myc; zároveň c-Myc zvyšuje svou vlastní expresi represí miR-34a a
let-7…
miR-34: nádorový supresor
fungující „downstream of p53“
Zimmerman AL, Wu S., Cancer Lett 300 (2011) 10-19
Deng G, Sui G, Int J Mol Sci 14 (2013) 18319-18349
Integrální součástí funkční sítě p53
jsou miRNAs
 p53 reguluje expresi (transkripci) a zrání mnoha miRNAs
 exprese p53 je inhibována řadou miRNAs
Komplikovaná funkční síť vztahů mezi
miRNAs a některými onkoproteiny
např. Myc indukuje
expresi miRs v clusteru
miR-17-92, ale nejméně
dvě miRs z tohoto
polycistronu (17-5b a 20a)
suprimují expresi myc;
zároveň c-Myc zvyšuje
svou vlastní expresi
represí miR-34a a let-7;
avšak simultánní represí
miR125b c-Myc
upreguluje p53, která
následně zvyšuje expresi
inhibitorů c-myc Mir-34a a
-145
miRNAs a leukémie
• jednotlivé kroky
normální hematopoézy
jsou aktivovány
některými miRNAs a
inhibovány jinými
miRNAs (označeno ø)
• deregulace kterékoliv
této miRNA může
pravděpodobně vést k
vývoji nádoru
Zimmerman AL, Wu S., Cancer Lett 300 (2011) 10-19
Klasifikace protoonkogenů
• I. růstové faktory
• II. receptory růstových faktorů
• III. Ras-proteiny
• IV. nereceptorové tyrozin-proteinkinázy
• V. transkripční faktory
• VI. remodelace chromatinu, miRNAs,…  epigenetika
toto rozdělení souvisí se strukturou signální dráhy:
• 1. vazba růstového faktoru na receptor
• 2. aktivace receptorové proteinkinázy
• 3. přenos signálu do jádra kaskádou proteinkináz
• 4. aktivace transkripčního faktoru
• 5. spoluúčast dalších faktorů…
Potenciální praktické využití
miRNAs
• v diagnostice (detekce sérových markerů? korelace s
progresí? markery metastatického potenciálu?)
• prognostické markery?
• cíl terapie
• terapeutikum
Stochastický epigenetický
model vývoje nádorů
 na počátku vývoje nádoru stojí epigenetické změny, především
změny imprintingu – metylace DNA spojené s kovalentními
modifikacemi histonů
 určitá míra spontánní stochastické heterogenity epigenomu je
přirozená a vlastní všem, tedy i zdravým buňkám a je
pravděpodobně zdrojem adaptability a evoluce
 k výraznému navýšení heterogenity epigenomu může docházet
v důsledku stresu, například opakovanými cykly poranění a hojení,
tedy vlivem a působením mikroprostředí nebo i širšího okolí nádoru
Timp W a Feinberg AP. Nat Rev Cancer 13, 2013, 497-510. Feinberg AP. J Int Med 276, 2014, 5-11.
Model spolupráce epigenetických
modifikací a mutací při vývoji
typických znaků nádorů
Feinberg AP. J Int Med 276, 2014, 5-11.
 epigenom funguje na
křižovatce prostředí –
genetických mutací – růstu
nádoru  faktory prostředí
(karcinogeny, dieta, zranění,
zánět,…) způsobují
epigenetické přeprogramování
 důsledkem navýšených
epigenetických změn může být
variabilita genové exprese,
včetně změn v expresi genů,
jejichž produkty se podílejí na
regulaci klíčových buněčných
vlastností a funkcí, které si
spojujeme s vývojem nádorů…
Stahl M. et al., PLOS Genetics DOI:10.1371/journal.pgen.1006193; 2016
Epigenetic dysregulation as a
hallmark of cancer