Molekulární a buněčná biologie nádorů Prof. RNDr. Jana Šmardová, CSc. Ústav experimentální biologie Přírodovědecká fakulta MU Brno 2020 Bi9910 pondělí 16.00 – 18.00 A11 – č. 305 4. Individuální dispozice k nádorům I Molekulární a buněčná biologie nádorů 2020 Bi9910 pondělí 16.00 – 18.00 A11 – č. 305 Komplexní proces kancerogeneze • Nádor vzniká akumulací genetických změn. Některé mohou být vrozené, jiné (somatické) mohou vznikat jako výsledek expozice kancerogenům nebo onkogenním virům. • Častá expozice kancerogenům nemusí okamžitě vést k vývoji nádoru... • Modulátory kancerogeneze zahrnují hormony, dietu, a další faktory hostitele. Dopad expozice kancerogenům stejně jako vliv modulátorů (geneticky) „filtrovány“ individuálními variantami genů, které eliminují, redukují nebo posilují dopad přispěvatelů tohoto procesu. • Přesné pochopení těchto okolností vývoje nádoru vyžaduje podrobnější pochopení interakcí genů a prostředí. Komplexní proces kancerogeneze Individuální dispozice k nádorům 1. Rozdíly v metabolismu kancerogenů („filtry“) (např. cytochrom P-450, CYP2D6, CYP1A1, N-acetyltransferáza - NAT, glutathion-S-transferáza M1 – GSTM1,…) Normální energetický metabolismus buněk uvolňuje jako vedlejší produkt značné množství reaktivních molekul včetně mutagenů / kancerogenů – ty jsou okamžitě neutralizovány a detoxikovány působením detoxikačních enzymů: • kuřáci s nízkou hladinou NAT mají 2,5x vyšší riziko nádoru než kuřáci s vysokou hladinou NAT • nízká hladina GSTM1 3x zvyšuje riziko nádoru plic Funkce glutathion-S-transferázy • GST se váže na řadu karcinogenů glutathion a tím je detoxikuje • řada nádorů má sníženou hladinu GST (např. až 90% adenokarcinomů prostaty) glutathion je neobvyklý tripeptid GST využívá SH skupinu glutathionu k detoxifikaci mnoha karcinogenů dříve než mohou reagovat s DNA Individuální dispozice k nádorům 2.-3. Rozdíly v procesech oprav DNA Mutace nádorových supresorů (a onkogenů) - p53, RB, WT1, BRCA1 a BRCA2,… - RET, c-met, … penetrance: podíl jedinců určitého genotypu, u nichž se daný specifický genotyp fenotypicky projeví (pravděpodobnost výskytu daného nádoru v určitém věku) Dědičné formy nádorů příklady: Li-Fraumeniho syndrom, retinoblastom, medulární nádor štítné žlázy, Wilmsův tumor, dědičná forma nádoru prsu a vaječníků, ... - 5-10% nádorů tohoto typu většinou představuje dědičnou formu (vrozená mutace jedné alely + ztráta heterozygotnosti - LOH), ostatní jsou sporadické - dědičné formy nádorů se objevují spíše v mladším věku než sporadické, často oboustranně nebo jako vícečetná ložiska - sporadické nádory spíše ve vyšším věku a jednostranně Indikace ke genetickému vyšetření 1. Výskyt nádoru v neobvykle časném věku. 2. Multifokální vývoj nádoru v jednom orgánu nebo bilaterální výskyt u párových orgánů. 3. Více primárních nádorů u jednoho jedince. 4. Pozitivní rodinná anamnéza stejného nádoru u blízkých příbuzných. 5. Vysoká incidence nádorů v rodině. 6. Výskyt nádorového onemocnění u jedince z rodiny s kongenitálními anomáliemi. Genetické poradenství 1. Co nejpřesnější rodinná anamnéza (alespoň tři generace, kompletní rodokmen včetně zdravých, ověření diagnóz). 2. Hledání postiženého genu (mutace) u probanda (pacienta s nádorem) (informovaný souhlas). 3. Genetická analýza rodiny, včetně zdravých příbuzných - od 18 let, s informovaným souhlasem. 4. Pozitivní výsledek: lékařský dohled, změna životního stylu, preventivní sledování, preventivní zásahy (profylaktické zákroky, chemoprevence,…). • Psychologické a etické aspekty genetického vyšetření!! Preimplantační genetická diagnostika 1. Moderní nástroje v diagnostice vs. relativně omezené možnosti terapeutické. 2. U nosiček mutací v genech, které způsobují vysoká rizika nádorů prsu a gynekologických nádorů, je důležité zvážit i rizika používaných hormonálních stimulací (ovariální hyperstimulace k vyvolání současného zrání více oocytů) 3. APC, BRCA1, NF1, NF2, TP53, RB „gatekeepers“ a „caretakers“ „gatekeepers“ (strážci) - geny, které přímo regulují (limitují) růst nádorů buď inhibicí jejich růstu nebo indukcí jejich smrti. „caretakers“ (správci) - jejich inaktivace navozuje genetickou nestabilitu a ta pouze nepřímo indukuje růst nádorů zvyšováním mutační rychlosti. APC, p53 - jsou zároveň „gatekeepers“ i „caretakers“ „gatekeepers“ a „caretakers“ u familiálních nádorů „caretakers“ • NER, xeroderma pigmentosa, cockayne syndrom, trichothiodystrofie • ataxia telangiectasia • Bloomův syndrom • Fanconiho anemie • dědičný nepolypozní kolorektální nádor • Wernerův syndrom • Li-Fraumeniho syndrom • nádory prsu „gatekeepers“ • retinoblastom • Li-Fraumeniho syndrom • Wilmsům tumor • neurofibromatóza typu 1 a 2 • renální karcinom • MEN typu 1 a 2 • maligní melanom • Cowdenův syndrom • Gorlinův syndrom • nádor prsu • kolorektální nádor Retinoblastom • vzácné nádorové onemocnění dětí; incidence - 1 na 13.500 - 25.000 narozených dětí • prototypickým příkladem vrozené dispozice k nádorům: na základě studia epidemiologie retinoblastomu byla vyslovena Knudsonova hypotéza  Knudsonův model • RB byl prvním příkladem nádorového supresoru a první naklonovaný gen pro nádorový supresor. • autozomálně dominantní dědičné onemocnění: mutace RB jsou recesivní (na úrovni buňky) a zároveň dominantní (na úrovni celého organismu)!!! • vrozená mutace RB (13q14) predisponuje nositele k vývoji retinoblastomu (maligní tumor, který vzniká ve vyvíjející se retině) v nízkém věku a přináší 500x zvýšené riziko vývoje osteosarkomu během adolescence Knudsonův model dvou zásahů 40% případů: • průměrný věk při diagnóze - 14 měsíců • bilaterálně v obou očích - v průměru 3 nezávislé nádory • v případě časného odstranění retinoblastomu vysoký výskyt osteosarkomů mezi 20. a 30. rokem života • často rodinná anamnéza 60% případů: • bez rodinné anamnézy • průměrný věk při diagnóze - 30 měsíců • unilaterální výskyt Knudson (1971): 1. skupina: 1 mutovaná alela genu RB je zděděná (v zárodečné linii), druhá mutace somatická 2. skupina: nezbytnost dvou nezávislých mutací obou alel RB  jedna hypotéza vysvětlila dva epidemiologicky odlišné typy onemocnění Knudsonův model dvou zásahů Ztráta heterozygotnosti Ztráta heterozygotnosti = LOH („loss of heterozygosity“) 1. Buňky, které nesou jednu mutovanou alelu nádorového supresoru (jsou pro tento gen heterozygotní), ztrácejí jedním z více možných způsobů funkční alelu (ztrácejí heterozygotnost). 2. Buňky, které nesou jednu mutovanou alelu nádorového supresoru, ztrácejí velkou část (delece) chromozomu, který nese funkční alelu. Předpokládá se, že v oblastech s vysokou frekvencí LOH leží geny nádorových supresorů. Knudsonův model dvou zásahů Retinoblastom Pravděpodobnost vývoje dalšího nádoru u člověka v dětství postiženého retinoblastomem: • u unilaterálního onemocnění je zvýšený výskyt dalších nádorů důsledkem léčby zářením • u bilaterálního onemocnění vrozená dispozice Retinoblastom 60% - jednostranné nedědičné 10% - jednostranné dědičné (s anamnézou nebo bez) 5% - oboustranné s anamnézou 25% - oboustranné - nové „germ-line“ 60% - jednostranné nedědičné 15% - jednostranné dědičné 25% - oboustranné a dědičné • Podle matematického modelu se asi u 5% nositelů s vrozenou mutací RB nevyvine retinoblastom (rezistence hostitele?) • Téměř úplná penetrance  (95%). • Mnoho - možná většina - lidí má v retině „one-hit“ klony.  Projekt „reselience“ • reselient – odolný • klasické studie: detekují příčinné mutace u postižených nositelů • komplementární přístup: vyhledat nositele vysoce penetrantních mutací způsobujících onemocnění bez projevů tohoto onemocnění  vyšetření 874 genů (způsobujících 584 závažných dětských onemocnění) v 589 306 genomech: nalezení 13 dospělých s mutací způsobující 8 onemocnění – bez klinických projevů: 13 kandidátských odolných jedinců  první krok na cestě k vyhledávání „ochranných“ genetických variant Chen R. et al: Analysis of 589 306 genomes identifies individuals resilient to severe mendelian childhood diseases. Nat Biotechnology, 34 (5) 531-538, 2016 Odhad mutační rychlosti u retinoblastomu • U pacientů s vrozenou mutací RB průměrně tři nádory. • Embryonální sítnici tvoří v průměru 2 miliony retinoblastů, tj. 4 miliony retinoblastů ve 2 očích. • Průměrná mutační rychlost je 3/(4 x 106) = 7,5 x 10-7 /2 roky, tj. 3,75 x 10-7 /rok. • Nelze očekávat, že sporadický retinoblastom bude bilaterální nebo vícečetný v jednom oku. Snustad D.P., Simmons M.J.: Genetika. MU Brno 2017 Snustad D.P., Simmons M.J.: Genetika. MU Brno 2009 Riziko RB u členů rodiny • Sporadický unilaterální: sourozenci 1%; potomci 2-6% • Sporadický bilaterální: sourozenci 2%; potomci téměř 50% • Dědičný bilaterální: sourozenci téměř 50%; potomci 50% • Dědičný, neúplná penetrance: sourozenci < 40%; potomci < 40% RB: gen a protein • jaderný (85%) protein p110RB (velikost 112 až 114 v proliferujících buňkách) • v nedělících se buňkách je pRB v komplexu s TF E2F; E2F transaktivuje sadu genů, které jsou nutné k S fázi buněčného cyklu; pRB blokuje E2F a tím blokuje buněčný cyklus („brzda buněčného cyklu“) • hladina proteinu pRB se v buňkách během b.c. nemění, ale mění se stupeň fosforylace pRB; na molekule pRB je asi 10 až 12 různých fosforylačních míst (Thr, Ser); hyposforylovaný RB je aktivní a váže E2F, fosforylovaný pRB je neaktivní  pRB jako integrátor signálů Způsoby inaktivace (dráhy) pRB v nádorech • samotný gen RB může být mutován, deletován, může být metylován jeho promotor (retinoblastom, malobuněčný karcinom plic, sarkomy, karcinomy močového měchýře) • vazbou virových proteinů E1A, LT SV40, E7 (karcinom děložního čípku) • amplifikací cyklinu D1 (nádory jícnu, prsu, dlaždicobuněčné karcinomy) nebo zvýšenou expresí cyklinu D1 díky chromozomální translokaci (MCL); potenciálně onkogenní virus Herpesvirus saimiri kóduje svůj vlastní cyklin D • amplifikací Cdk4 (glioblastomy, gliomy) • delecí p15, p16 nebo obou (dlaždicobuněčné karcinomy jícnu, glioblastomy, karcinomy plic, močového měchýře a pankreatu) • ektopická exprese „wild-type“ RB není pro proliferaci inhibující, protože pRB je fosforylován a inaktivován endogenní aktivitou komplexů cyklin/cdk Maligní melanom • Frekvence výskytu MM (9. nejčastější nádorové onemocnění v USA) v západních zemích roste nejrychleji ze všech nádorů. Každých 10 let se počet případů zdvojnásobí. • Melanomy se vyvíjejí transformací melanocytů buněk kůže, které produkují melanin. Melanin je součást ochrany kůže před působením UV. • Počet melanocytů je u lidí se světlou a tmavou kůží stejný, odlišné je množství produkovaného melaninu. Bílá populace má 10x vyšší riziko výskytu melanomu než Černoši, Asiaté, Hispánci. • Vyšší riziko: světlé vlasy, oči a pleť, neschopnost se opálit, tendence ke spálení na slunci; opalování. Maligní melanom • 5-10 % melanomů je familiálních, penetrance se odhaduje asi na 53% ve věku 80 let. • genetická dispozice - několik dědičně podmíněných syndromů:  FAMMM (Familial Atypical Multiple Mole and Melanoma)  syndrom dysplastických névů (Dysplastic Nevus Syndrome DNS; Atypical Mole Syndrome – AMS)  xeroderma pigmentosum Syndrom dysplastických névů/FAMMM • velké množství atypických névů svědčí o dědičné formě  vysoké riziko melanomu • autozomálně dominantní onemocnění • melanocyty mohou na kůži tvořit pigmentovaná znaménka a névy: vysoká hustota névů je příznakem zvýšeného rizika vývoje melanomu Pigmentové névy • nezhoubné kožní útvary různé velikosti vzniklé místním nahromaděním melanocytů (shluk pomnožených melanocytů do tzv. hnízda), které se projevují odchylkou od normální barvy kůže • melanocyty jsou v kůži za normálních okolností uspořádány jednotlivě, jsou od sebe vzdálené maligní melanom Maligní melanom • pro MM typický výskyt komplexních cytologických přestaveb  bylo obtížné najít genetickou příčinu vývoje melanomů • vytipovaná oblast: 9p21-22 (asi 50% postižených rodin) • v této oblasti gen CDKN2A pro p16INK4A: mutace p16 odpovídají asi za 20-40 % dědičných melanomů, nepochybně existují další geny zodpovědné za MM • mutace CDKN2A (p16) u 0,2– 2% sporadických melanomů • protein p16INK4A: 158 AA - tvoří binární komplexy specificky s Cdk4 a Cdk6, inhibuje jejich aktivitu (a tedy fosforylaci RB) (INK4A inhibitor of Cdk4) • v postižených rodinách se vyskytují i jiné typy nádorů, především nádory pankreatu, vzácněji děložního čípku, močového měchýře, prsu, gliomy a některé hematologické malignity V oblasti 9p21 další geny: • p15INK4B - veliká homologie s p16, také inaktivuje Cdk4 a Cdk6: vrozené mutace nedetekovány! • p14ARF - váže MDM2 a zabraňuje ubikvitinaci a degradaci p53; p14ARF je kódovaný stejnou částí jako p16 DNA, ale v jiném čtecím rámci („alternative reading frame“) - lze vyřadit zároveň dvě dráhy klíčové pro kancerogenezi (p53 a RB); neuplatňuje se u vrozených dispozic k MM!! Maligní melanom Geny p16INK4A a p14ARF • sdílejí exon 2 genu p16INK4A • využívají každý „svůj“ (alternativní) transkripční promotor • pro translaci je využíván alternativní čtecí rámec (Alternative Reading Frame) • ? kumulace významných regulačních genů do jednoho lokusu (+ p15): „ekonomika“ vs. bezpečnost ? Weinberg RA. The Biology of Cancer. Garland Science 2007 • přibližně u 1% hereditárních melanomů se nalézá zárodečná mutace v genu CDK4 pro cyklin dependentní kinázu 4 (12q14.1) • záměna cysteinu 24 za arginin: interferuje s vazbou p16 a p15, ale ne s vazbou cyklinu D!!  vzácný případ vrozené mutace protoonkogenu! Maligní melanom Mnohočetná endokrinní neoplazie typ2 (MEN2) (RET) Familiální gastrointestinální stromální nádory (GISTs) (c-kit) Familiální medulární karcinom štítné žlázy (FMTC) (RET) Hereditární papilární karcinom ledviny (c-met) RASopatie (ras/MAPK) Maligní melanom (CDK4) Neurofibromatóza typu 1 - NF1 • autozomálně dominantní dědičnost • u postižených se vyvíjejí násobné benigní neurofibromy, z některých se mohou dále vyvíjet neurofibrosarkomy, zvýšené riziko vývoje AML, a další • inaktivace obou alel NF-1 byly popsány u melanomů a neuroblastomů • gen NF1 lokalizovaný na chromozomu 17q11.2 • produktem NF-1 je protein neurofibromin, který patří do rodiny GTPáza aktivujících proteinů (GAPs; negativní regulace Ras) • patří mezi RASopatie Neurofibromatóza typu 1 kožní skvrny barvy bílé kávy pigmentované hamartomy duhovky, tzv. Lischovy noduly Neurofibromin NF1 je GAP (GTPase activating protein) proteinu Ras. Interakce Ras s NF1 může zvýšit GTPázovou aktivitu Ras více než 1000x. Pro funkci NF1 je kritický arginin R1276, který interaguje s Ras a přispívá k hydrolýze GTP na GDP. Šedivou jsou vyznačena nalezená místa mutací NF1. Neurofibromatóza typu 2 - NF2 • autozomální dominantní onemocnění charakteristické vývojem bilaterálních schwanomů akustického nervu • spojeno s výskytem násobných benigních nádorů intrakraniálních, páteřních a periferních nervů, nádory jsou jen vzácně maligní; Hamartomy sítnice • onemocnění se začíná manifestovat v průměru ve 21 letech, průměrný věk úmrtí je 36 let; velká variabilita • vzácné onemocnění s výskytem 1:40.000 • spojeno s vrozenou mutací genu NF2 na chromozomu 22q12.2; asi polovina vrozených mutací NF2 je de novo • produktem genu je protein merlin (schwanomin) Neurofibromatóza typu 2 • merlin patří do velké rodiny proteinů (merlin - moesin, ezrin, radixin-like protein), které interagují s membránovými proteiny: cytoskeletální protein - především v adhezních pásech; merlin pravděpodobně interaguje s aktinem, a transmembránovým proteinem CD44; exprimován hlavně v nervové tkáni • nepřítomnost funkčního merlinu mění mírně intracelulární signalizaci, vede ke zvýšení proliferace Schwannových buněk Cowdenův syndrom - CS • autosomálně dominantní onemocnění - charakteristické vývojem násobných hamartomů (benigní nádorky, odlišitelné od adenomů - svou histologickou strukturou: buňky normálně diferencované, ale neuspořádané) v mnoha orgánech (kůže, mamární tkáň, štítná žláza, trávicí trakt) a zvýšeným rizikem vývoje nádoru prsu a thyroidních nádorů. • (Cowdenové syndrom; syndrom mnohočetného hamartomu) • první příznaky CS se většinou objeví nejpozději ve 3. dekádě života • převážná většina nádorů (i nádorů prsu a thyroidních nádorů) je benigních, asi u 10% postižených Cowdenovým syndromem se vyvine nemedulární thyroidní karcinom a asi u 30 až 50% postižených žen se vyvine zhoubný nádor prsu Cowdenův syndrom • onemocnění souvisí s vrozenou mutací genu PTEN, který je lokalizován na chromozomu 10q23.3 (mutace PTEN nalezena asi u 80% pacientů s CS) • fenotypické rozdíly mohou souviset s různými mutacemi genu PTEN Úloha proteinu PTEN v buňce • PTEN je protein/lipid fosfatáza. („Phosphatase and Tensin homolog deleted on chromosome TEN“) MMAC1 („mutated in multiple advanced cancers“) • Defosforyluje jak Thr/Ser, tak Tyr, ale pro jeho nádorově supresivní funkci je klíčová schopnost defosforylovat fosfatidylinositol(3,4,5)-trifosfát (PIP-3), který je produkován kinázou PI3K po aktivaci mitogenními signály. (PIP-3 aktivuje Akt, který mimo jiné blokuje apoptózu a přispívá k přežití buňky.) • Úloha PTEN je udržovat hladinu PIP-3 nízkou: inaktivace PTEN způsobuje zvýšení hladiny PIP-3 a hyperaktivaci Akt. Úloha PTEN v řízení buněčné smrti, proliferace a buněčné adheze 1. PTEN vykonává svou funkci nádorového supresoru primárně indukcí bloku buněčného cyklu ve fázi G1, případně umožněním apoptózy tím, že inhibuje signály přežití vyvolané růstovými faktory. 2. Dalším substrátem PTEN je kináza FAK („focal adhesion kinase“): defosforylací FAK tak PTEN inhibuje migraci buněk zprostředkovanou integriny (tato funkce je závislá na schopnosti defosforylovat Tyr). Di Cristofano A and Pandolfi PP, Cell 100 (2000) 387-390 Model funkce proteinu PTEN během kancerogeneze • „LOH“ 10q23 je u primárních nádorů častá - 25 až 50%, ale kompletní ztráta funkce PTEN v časných stádiích kancerogeneze je běžná jen u nádorů dělohy a vaječníků. • U dalších nádorů je kompletní ztráta funkce PTEN spojena až s pozdními stádii kancerogeneze a je spojena s agresivními, metastatickými stádii.  V počátečních stádiích kancerogeneze se PTEN uplatňuje mechanismem „haploinsuficience“, úplná ztráta funkce se objevuje až v pozdějších stádiích. Tuberózní skleróza • autozomálně dominantní nádorový syndrom • Souvisí s vrozenými mutacemi TSC1 (9q34; kóduje hamartin) nebo TSC2 (16p13,3; kóduje tuberin). • Charakterizováno vývojem benigních nádorů hamartomů v mnoha orgánech; vzácně spojeno s vývojem maligních nádorů. • Pro onemocnění typická značná variabilita symptomů, různá závažnost postižení; variabilita souvisí s typem mutace, ale taky s věkem postižených (výskyt mutace druhé alely). • Popsáno přes tisíc mutací (cca 30% v TSC1, 70% v TSC2); 2/3 mutací vznikají de novo. • Tuberin reguluje malé G-proteiny (Rap1a, Rab5, RheB), translaci, buněčnou proliferaci. • Hamartin interaguje s rodinou aktin vázajících proteinů (ezrinradixin-moesin), reguluje buněčný cyklus interakcí s CDK. TSC1 a TSC2 („tuberous sclerosis complex 1 a 2“) Hamartomy - „správná kostka na správném místě, ale špatně otočená“ – odpovídající tkáň, správně diferencovaná a na správném místě, ale chybně fyziologicky zapojená U pacientů s vrozenými mutacemi PTEN se také vyvíjejí hamartomy, ale také maligní nádory. Gorlinův syndrom - Névoidní basocelulární syndrom • autozomálně dominantní nádorový syndrom, vzácný (1: 50-100 000 obyvatel; u pacientů s bazocelulárními karcinomy 1:200). • souvisí s vrozenými mutacemi PTCH, které v 80% vedou ke zkrácenému proteinu PTCH a způsobují zvýšenou expresi a pozitivní aktivaci Gli1; gen kódován v oblasti 9q22.3 • vývojové abnormality: skeletální defekty, kraniofaciální defekty, polydaktylie a syndaktylie, vysoký vzrůst • zvýšené riziko nádorů: mnohočetné basaliomy kůže (téměř všichni postižení GS onemocní v průběhu života kožními nádory, často již v dětském věku), dále cysty čelistí, meduloblastom (odvozen z buněk mozečku), fibromy ovaria, meningiomy, fibrosarkomy, rhabdomyosarkomy • asi 1/3 mutací v zárodečné linii je de novo Dědičné nádory endokrinního systému • Mnohočetná endokrinní neoplasie typu 1 - MEN1: kumulace nádorů příštítných tělísek, endokrinních ostrůvků pankreatu, předního laloku hypofýzy a nadledvinek • Mnohočetná endokrinní neoplasie typu 2 MEN2A: medulární karcinom štítnice, hyperparathyreoidismus, feochromocytom MEN2B: medulární karcinom štítnice, feochromocytom, ganglioneuromy GIT, neuromy sliznic • Familiální medulární karcinom štítné žlázy FMTC Mnohočetná endokrinní neoplasie typu 1 - MEN1 • autozomálně dominantní onemocnění spojené s vývojem adenomů příštítných tělísek (90 - 97 % pacientů), nádorů endokrinních ostrůvků pankreatu (50 - 65 % pacientů) a předního laloku hypofýzy (40 - 50 %), nádory kůže, vzácněji i nádory neendokrinní tkáně • téměř 100 % penetrance; asi 10% mutací de novo • prvním příznakem onemocnění je většinou hyperfunkce endokrinních žláz • syndrom spojen s vrozenými mutacemi genu MEN1 (11q13), v nádorech doprovázenými LOH • produktem genu MEN1 je menin, převážně jaderný protein, nepříbuzný s žádným dalším proteinem; pravděpodobně negativní regulátor buněčné proliferace Srovnání MEN1 a MEN2 Wilmsův tumor - nefroblastom • maligní nádor ledvin dětského věku; jeden z nejčastějších solidních nádorů u dětí • frekvence výskytu asi 1:10.000 • poprvé popsán Maxem Wilmsem v roce 1899 • vznik a charakteristické histologické rysy tumoru jsou výsledkem aberantního embryonálního vývoje • vyskytuje se v dědičné formě i jako sporadický nádor • sporadický nádor se typicky u dětí vyskytuje kolem 4. až 5. roku života, o něco častěji u dívek než chlapců, se stejnou pravděpodobností v různých etnických skupinách; dědičná forma (velmi vzácná) nádoru se typicky objevuje během 2. roku života, často bilaterálně • autozomálně dominantní onemocnění s neúplnou penetrancí Wilmsův tumor • Asi 10% nádorů je bilaterálních. Pokud jsou bez rodinné anamnézy, často spojeny se zárodečnou mutací de novo. • Incidence dalších primárních malignit u vyléčených dětí (kolem 90%) je spíš nízká a dává se více do souvislosti s léčbou Wilmsova tumoru. • Vzácně se vyskytuje i u dospělých, z toho 20% mezi 15. a 20. rokem života, 80% do 7. dekády. Nádorový supresor WT1 • WT spojen s mutacemi více genů. • První popsaný (1990) byl nádorový supresor WT1, lokalizovaný v oblasti 11p13. Jeho mutace jednak spojeny s tvorbou Wilmsova tumoru a také s vývojovými malformacemi urogenitální oblasti výrazněji u chlapců (mechanismus haploinsuficience). • Asi 1% postižených vykazuje tzv. syndrom WAGR (Wilmsův tumor, Aniridie, Genitální vady, růstová a mentální Retardace). WT u 1 dítěte z 10.000, aniridie u 1 dítěte ze 70.000. Aniridie se vyskytuje u 1 ze 70 dětí s WT, WT se vyvine u 1 ze 3 dětí s aniridií. • Aniridie souvisí s mutací genu Pax6. Lokusy pro aniridii a WT (Pax6 a WT1) jasně odděleny, ale leží blízko sebe. WAGR syndrom je spojen s rozsáhlejšími cytogenetickými delecemi oblasti 11p13 (typický mikrodeleční syndrom). • je exprimován v ledvinách, jeho exprese je přísně během vývoje regulována: časově i prostorově • tkáňově specifický, sekvenčně specifický transkripční faktor, další roli hraje zřejmě při posttranskripčních úpravách - interakcí s RNA • má antiproliferativní účinek a zřejmě schopnost stimulovat specifické diferenciační procesy • zřejmě hraje i nějakou roli v hematopoietickém vývoji: nejčastějším dalším primárním onemocněním je leukémie; asi u 20% AML/ALL se popisují (somatické) mutace WT1 • další geny spouvisející s vývojem Wilmsova tumora: WT2-WT5, mikrodelece 11p13 Nádorový supresor WT1 Li-Fraumeniho syndrom • Vzácné autozomálně dominantní dědičné onemocnění (opět: dominantní na úrovni celého organismu, recesivní na úrovni buňky). • Rodinný syndrom charakteristický častým a časným výskytem malignit různého typu včetně sarkomu, nádoru prsu, nádoru mozku, leukémií, adrenokortikálního nádoru dětí (kůra nadledvin). • Nádory u LFS mají tendenci se objevovat u dětí a mladých dospělých, často jako násobné primární nádory. • Syndrom spojen s mutací genu pro nádorový supresor p53 (17p13.1). Li-Fraumeniho syndrom • Proband se sarkomem do 45. roku života, příbuzný 1. stupně s nádorem do 45. roku života, příbuzný 1. nebo 2. stupně s jakýmkoliv nádorem do 45. roku života nebo se sarkomem v kterémkoliv věku. • Až 80% případů spojeno s vrozenou mutací p53. nádory prsu nádor plic sarkom leukémie glioblastomy karcinom pankreatu Wilmsův tumor Spektrum nádorů v rodině s mutací p53 v zárodečné linii Li-Fraumeniho-like syndrom • Proband s jakýmkoliv nádorem v dětství nebo sarkomem, nádorem mozku nebo adrenokortikálním nádorem do 45. roku života, příbuzný 1. nebo 2. stupně s kterýmkoliv typickým LFS nádorem v jakémkoliv věku, další příbuzný 1. nebo 2. stupně s jakýmkoliv nádorem do 60. roku života. • Asi 50% případů spojeno s vrozenou mutací p53. (U některých LFS / LFLS rodin popsány zárodečné mutace genu chk2, ale úloha genu chk2 v etiologii LFS nejasná.) Historie LFS 1969: Li a Fraumeni retrospektivně porovnávali data a anamnézy dětských pacientů, kteří zemřeli na sarkom. Našli několik rodin, kde onemocněním byli postiženi sourozenci nebo bratranci/sestřenice a v jejich anamnéze zjistili, že v jedné rodičovské linii je vysoký výskyt nádorů širokého spektra, především sarkomů a nádorů prsu v mladém věku, a dalších. SBLA syndrom: Sarcoma, Breast and Brain cancer, Leukemia, Lung and Laryngeal cancer, Adrenocortical carcinoma (1978). 1988: první verze definice LFS 1995: vedle „klasického“ LFS volněji definován LFLS (LFS-L) Epidemiologie LFS • Frekvence výskytu celosvětově 1-9 na 100.000. • Penetrance 50% ve 30 letech, 90% v 60 letech. Penetrance vyšší u žen (100%) - spojeno s výskytem nádoru prsu. • Mutace v genu p53 patří k nejčastějším genetickým (somatickým) změnám detekovaným v solidních nádorech X extrémně vzácný syndrom LFS. • Anticipace – při přenosu genu mezi generacemi stále časnější a závažnější výskyt onemocnění (? v důsledku navyšování genetických změn?) Cílové orgány maligní transformace u pacientů s LFS nádory prsu: 25.8 % sarkomy měkkých tkání: 14 % nádory mozku: 12.4 % adrenokortikální nádory: 11.9 % sarkomy kostí: 8.2 % neznámá lokalizace: 3.9 % nádory kůže: 2.7 % nádory plic: 2.5 % hematologické malignity: 4.3 % nádory střeva: 2.4 % Gen a protein p53 Gen lokalizován na chromozomu 17 (17p13) Protein - poprvé popsán díky interakci s LT SV40 - funguje jako transkripční faktor - funguje jako tetramer Struktura proteinu: DNA vazebná doména, transaktivační doména, oligomerizační doména, NLS, C-koncová regulační doména Funkční síť p53 Weinberg RA. The Biology of Cancer. Garland Science 2007 Signální síť p53 (1) Produkce vlastních proliferačních signálů (2) Necitlivost k signálům zastavujícím buněčný cyklus (3) Odolnost k programované buněčné smrti (4) Neomezený replikační potenciál (5) Indukce angiogenese (6) Aktivace invazivity a metastazování (7) Genetická nestabilita a mutace (8) Přítomnost zánětu podporující nádor (9) Přeprogramování energetického metabolismu (10) Schopnost vyhnout se destrukci imunitním systémem (11) Změny mikroprostředí nádoru Získané vlastnosti maligního nádoru Hanahan D. and Weinberg R.A., Cell 144 (2011) 646-674 Funkce p53 1 3 5 2 4 6 7 7 chronický zánět CXCL1 (NF-κB) Gudkov 2011 Cooks et al. 2014 modulace imunitního systému CD43, ICAM1 Fracktalkine CSF1, ISG15 IRF5, IRF9 MCP1, PKR Lowe et al. 2013 Menendez et al. 2013 přeprogramo vání metabolismu Glut1 Glut4 Glut3 TIGAR SCO2 Vousden a Ryan 2009 8 910 Funkce p53  Zprostředkovává adekvátní reakci buňky na stresové podněty. Cílové geny: mdm2 - zpětnovazebná inhibiční klička p21CIP1/WAF1 - blok G1 bax - apoptóza GADD45 - oprava DNA p53 - ochránce genomu Regulace p53 • regulace transkripce a translace • regulace hladiny/stability proteinu • regulace buněčné lokalizace • regulace aktivity Regulace stability p53  V normálně proliferujících buňkách je hladina proteinu p53 udržována velmi nízká rychlým odbouráváním. • Klíčovou roli v regulaci stability p53 hraje protein MDM2. • MDM2 funguje pro p53 jako ubikvitin ligáza E3: po interakci s p53 zprostředkovává ubikvitinaci p53 a jeho odbourání proteazomem. • mdm2 je cílovým genem p53 ( zpětnovazebná klička) • MDMX (MDM4) - další regulátor p53: nezprostředkovává jeho degradaci, ale inhibuje jeho schopnost aktivovat transkripci cílových genů. Úloha proteinu MDM2 v regulaci p53: v normální a poškozené buňce V poškozené buňce je znemožněna vazba MDM2 k p53 a p53 je stabilizován. Regulace vazby p53 - MDM2 • interakce p53 s MDM2 je znemožněna fosforylací • p53 je fosforylován jako odpověď na buněčný stres (poškození DNA, hypoxie, …) kinázami: Chk1, Chk2, ATM a ATR, JNK, Polo-like kinase,... • buňky s mutacemi v ATM a Chk2 mají poškozenou schopnost stabilizovat p53 (Vrozená heterozygotní mutace v genu chk2 („G2 checkpoint kinase“) byla detekována u LFS) (Mutace chk2 v zárodečné linii se vyskytují asi u 1,1 až 1,4% západní populace a až u 5% pacientek s nádorem prsu (tj. vrozená mutace chk2 je spojena s vyšším rizikem vývoje tohoto nádoru). Úloha proteinu MDM2 v regulaci p53: funkční a nefunkční p53 Regulace buněčné lokalizace p53 • p53 má na C-konci několik signálů jaderné lokalizace - NLS, je po syntéze transportován do jádra. • p53 má dvě sekvence pro export z jádra - NES: v oligomerizační doméně (ve funkčním tetrameru odstíněno) a na N-konci v MDM2 vazebné doméně. Export z jádra je výrazně potencován vazbou MDM2 (i když vazba MDM2 není podmínkou) a také ovlivněn fosforylací v dané oblasti: fosforylace vyvolaná stresem inhibuje transport z jádra (vedle toho, že znemožňuje vazbu MDM2) • Popsána kináza Parc, která zadržuje p53 v cytoplasmě. Regulace aktivity p53 Regulace schopnosti p53 vázat se na DNA a interagovat s dalšími komponentami transkripčního aparátu - regulováno posttranslačními modifikacemi. Především různé kovalentní a nekovalentní modifikace (fosforylace, Sumoylace, glykosylace, acetylace, ubiquitinace, neddylace) Ckonce p53 ovlivňují schopnost p53 vázat se na DNA: p53 je např. aktivována fosforylací ser392 (indukováno UV), Sumoylací Lys386, acetylací C-konce... N-konec? Stresem indukovaná fosforylace N-konce potencuje interakce s acetyltransferázami, které acetylují C-konec (a také acetylují histony v nukleozomech v cílových promotorech) Posttranslační modifikace p53 Posttranslační modifikace souvisejí s regulací aktivity a také stability p53. Inaktivace p53 v nádorech • Mutace • Jaderná exkluze (37% zánětlivých karcinomů prsu, více než 90% nediferencovaných neuroblastomů) • Interakce s virovými onkoproteiny (LT SV40, E1B, E6) • Amplifikace mdm2 (neuroblastomy), případně mdmX (gliomy) Frekvence mutací p53 v nádorech Typy mutací p53 • především bodové missense mutace • krátké delece a inzerce (více v okrajových částech genu) Weinberg RA. The Biology of Cancer. Garland Science 2007