Molekulární a buněčná biologie nádorů Prof. RNDr. Jana Šmardová, CSc. Ústav experimentální biologie Přírodovědecká fakulta MU Brno 2020 Mgr. Jana Koptíková, Ph.D. Institut biostatistiky a analýz LF MU Brno 5. Individuální dispozice k nádorům II Molekulární a buněčná biologie nádorů 2020 Bi9910 pondělí 16.00 – 18.00 A11 – č. 305 Kolorektální nádory - CRC Sporadické: Dědičné: • Nepolypózní Lynchův syndrom • Polypózní Familiální adenomatózní polypóza coli FAP Peutz-Jeghersův syndrom Familiální juvenilní polypóza Hyperplastická polypóza Kolorektální nádory • Pouze asi u 5-10 % pacientů s kolorektálním nádorem je zřejmá vrozená genetická příčina dispozice k tomuto nádoru, ale z epidemiologických dat se odhaduje, že vrozené dispozice odpovídají možná za 15 a více % všech kolorektálních nádorů („clusterování“ CRC nádorů v rodinách). • Zřejmý je vliv vnějších faktorů, především diety (živočišné tuky, červené maso, nedostatek vlákniny). Historický příklad: V Japonsku bývala nízká incidence nádorů střeva a vysoká incidence nádorů žaludku. Emigranti do USA vykazovali výrazné zvyšování incidence nádorů střeva. V současnosti postupné zvyšování incidence nádorů střeva s tím jak postupuje „westernizace“ Japonska. Phakomatosy „phakos“ (řec.) - mateřské znaménko 1932 - takto označena kategorie syndromů, které se vyznačují velkým množstvím benigních lézí, které tak představují znamení, předzvěst možného vývoje nádoru - původně zařazeny: neurofibromatóza, syndrom von Hippel- Lindau - dnes asi 10 onemocnění: FAP, juvenilní polypóza, PeutzJeghersův syndrom, Gorlinův syndrom, Cowdenův syndrom, syndrom dysplastických névů,... Familiální adenomatózní polypóza - FAP • autozomálně dominantní dědičné onemocnění • U pacientů s FAP se vyvíjejí stovky až tisíce benigních kolorektálních nádorů, z nichž některé progredují do karcinomů, nejčastěji během druhé a třetí dekády života. Průměrný věk detekce nádoru u FAP pacientů je 40 let. Polypy, které se objevují u pacientů s FAP, jsou totožné s polypy sporadickými a také nemají větší riziko maligní progrese než sporadické polypy. Ale jejich velký počet „zajišťuje“, že některé se s jistotou v maligní vyvinou. Weinberg RA. The Biology of Cancer. Garland Science 2007 Familiální adenomatózní polypóza • zvýšené riziko vývoje thyroidních nádorů, nádorů tenkého střeva, žaludku a mozku • často i mimostřevní projevy, včetně poškození sítnice, osteomy, desmoidy kůže,... Mezi pacienty s FAP je pozorována velká variabilita, byly popsány varianty FAP: • Gardnerův syndrom - charakteristické jsou nádory měkkých tkání, osteomy, abnormality zubů, … • Některé formy FAP s nižším počtem střevních polypů (10 až 100) • Turcotův syndrom - typická je kombinace nádorů nervového systému a nádorů střeva (ne všechny případy Turcotova syndromu jsou „FAP“ - nesouvisí s mutacemi APC) Tvorba adenomatózních polypů u FAP A. Normální střevní epitel: zárodečné buňky krypt, diferencované buňky klků B. - C. vývoj polypu: adenomatózní tkáň D. - F. mikroadenomy Bienz M and Clevers H, Cell 103 (2000) 311-320 • FAP je spojena s vrozenými mutacemi genu APC. • Ten je lokalizován v oblasti 5q21. • Během kancerogeneze musí být inaktivovány obě kopie genu APC ( častý „LOH“ 5q). • Somatické mutace APC také hrají klíčovou úlohu při vývoji sporadických kolorektálních karcinomů, jsou detekovány alespoň u 80% všech CRC. • Vysoký podíl mutací, které vedou ke zkráceným proteinům. • Relativní vztah mezi typem mutace a průběhem onemocnění. Familiální adenomatózní polypóza Struktura proteinu APC Fodde R et al, Nat Rev Cancer 1 (2001) 55-66 Mutace APC • Většina mutací APC vede ke zkráceným proteinům, které postrádají různý počet sekvencí nutných k regulaci -kateninu. • Vrozené mutace se nacházejí v 5´polovině genu APC, somatické mutace potom především mezi kodóny 1286 a 1513. Weinberg RA. The Biology of Cancer. Garland Science 2007 Struktura APC a mutační spektrum Mutace APC • Pozice a typ druhé mutace u FAP závisí na místě první mutace! Specifické genotypy jsou selektovány během časné fáze kancerogeneze CRC tak, aby zbytková hladina -kateninu byla „optimální“, nikoli maximální (apoptóza). (princip „tak akorát“)  Alespoň jedna mutace zachovává ve výsledné molekule alespoň jednu (20 AA) sekvenci nutnou k regulaci -kateninu. Závislost vrozených a somatických mutací APC Fodde R et al, Nat Rev Cancer 1 (2001) 55-66 Dvojí úloha proteinu APC v buňce: Dvojí úloha APC při vývoji CRC APC se zřejmě uplatňuje jak při iniciaci vývoje nádoru (v důsledku selektivní výhody získané aktivací Wnt-1/-katenin dráhy), tak také v pozdějších fázích vývoje nádoru tím, že je příčinou chromozomální nestability. APC je „caretaker“ i „gatekeeper“. Další stadia vývoje kolorektálního karcinomu Kolorektální karcinomy představují výborný model pro studium kancerogeneze: • relativně „standardní“ průběh od malých adenomů (do 1 cm), přes středně pokročilé (více než 1 cm bez známek transformace) a velké adenomy až po plně rozvinutý maligní CRC • souvislost mezi „anatomií“, morfologií jednotlivých stadií a molekulárními změnami, které se odehrály • model kooperace onkogenů a nádorových supresorů během kancerogeneze Další stadia vývoje kolorektálního karcinomu - aktivace K-ras • Specifické bodové mutace protoonkogenu K-ras nebo Nras jsou detekovány alespoň u 50% kolorektálních adenomů větších než 1 cm a asi u 50% karcinomů. • Mutace ras jsou jen vzácně (do 10%) detekovány u adenomů menších než 1cm.  mutace ras se typicky objevují při progresi adenomů Kinzler KW and Vogelstein B, Nature Rev Cancer 2 (2002) 673-680 Další stadia vývoje kolorektálního karcinomu - „LOH“ 18q • Delece oblasti 18q detekovány u 50% velkých adenomů a 70% karcinomů. • Na chromosomu 18q detekován gen pro SMAD4, někdy označovaný jako DPC4 („deleted in pancreatic cancer“). • SMAD4 je součástí signální dráhy TGF-. Kinzler KW and Vogelstein B, Nature Rev Cancer 2 (2002) 673-680 Další stadia vývoje kolorektálního karcinomu - inaktivace p53 • Ztráta 17p je detekována u 75% kolorektálních karcinomů. • Ztráta 17p je jen vzácně detekována u kolorektálních adenomů.  Inaktivace nádorového supresoru p53 je typicky pozdní událost během vývoje kolorektálních karcinomů. Kinzler KW and Vogelstein B, Nature Rev Cancer 2 (2002) 673-680 Genetický model kancerogeneze CRC Vývoj nádorů trvá roky Weinberg RA. The Biology of Cancer. Garland Science 2007 Alternativní genetické změny při vývoji CRC Wood LD et al. Science 318: 1108-1113, 2007Weinberg RA. The Biology of Cancer. GS 2007 Rostoucí tolerance ke zvyšující se hladině ß- kateninu! Fodde R et al, Nat Rev Cancer 1 (2001) 55-66 Genetický model kancerogeneze CRC β-katenin a biologie střevních krypt Na „dně“ střevních krypt se nacházejí replikující se kmenové buňky, které obsahují vysoké hladiny β-kateninu, protože dostávají Wnt signály z okolních stromálních buněk. Proliferující nediferencující progenitorové buňky putují vzhůru: snižuje se stimulace Wnt signálem a zvyšuje se tak degradace β-kateninu. Snižuje se proliferace a postupuje diferenciace. Diferencované buňky odumírají apoptózou po 3 až 4 dnech. V případě mutace APC jsou vysoké hladiny β-kateninu i bez signálu Wnt, nediferencované proliferující buňky putují na vrcholek střevní krypty a vytvářejí polyp. Adenokarcinom žaludku a polypóza proximální části žaludku (GAPPS) Li J. et al., Am.J.Hum.Genet. 98: 830-842, 2016  gastric adenocarcinome and proximal polyposis of the stomach klíčový znak GAPPS:  kobercovité (více než 100) polypy z fundických žlázek (FGPs) v přední části žaludku, některé z nich jsou dysplastické;  vrátník, přední část střeva, tenké i tlusté střevo jsou zcela bez polypů, na rozdíl od FAP  zhruba u 12-84 % pacientů s FAP se objeví FGPs, z toho u asi poloviny postižených pacientů je těchto polypů více než 100, ale nejsou dysplastické  sporadické FGPs jsou méně četné a jen vzácně dysplastické GAPPS klíčový znak GAPPS:  kobercovité (více než 100) polypy z fundických žlázek (FGPs) v přední části žaludku, některé z nich jsou dysplastické;  vrátník, přední část střeva, tenké i tlusté střevo jsou zcela bez polypů, na rozdíl od FAP Li J. et al., Am.J.Hum.Genet. 98: 830-842, 2016 GAPPS  autozomálně dominantní syndrom  příčinný gen lokalizován 5q22 včetně LOH  celoexomové a celogenomové sekvenování neodhalilo příčinné mutace  Li et al. 2016: analýzou 6 rodin s GAPPS (27 postižených zástupců) byly odhaleny 3 bodové mutace v promotoru 1B genu APC, které kosegregovaly s výskytem onemocnění  mutace snižovaly vazbu transkripčního faktoru YY1 a následně expresi genu APC (nebo reportérského genu)  tyto mutace se nevyskytují u FAP!  promotor 1A je metylovaný u GAPPS a sporadických FGPs a také v normální žaludeční mukóze  transkripty 1B jsou v žaludeční mukóze významnější! střevní buňky jsou „chráněny“ expresí isoforem 1A Li J. et al., Am.J.Hum.Genet. 98: 830-842, 2016 GAPPS  APC haploinsuficience je zodpovědná za vývoj polypů z fundických žlázek (FGPs), ztráta druhé alely APC vede k rozvoji dysplasie  isoformy 1A a 1B jsou in frame, ale liší se na N konci (1B má navíc exon 1B a chybí mu exony 2 a 7)  Specifické bodové mutace ve vazebném místě TF YY1 v promotoru genu 1B genu APC jsou příčinou GAPPS, nové a potenciálně závažné varianty FAP. Li J. et al., Am.J.Hum.Genet. 98: 830-842, 2016 Juvenilní polypóza coli • autozomálně dominantní syndrom • Název „juvenilní“ u JPS ani tak neodráží věk postižených, jako spíš histologii polypů, která se podobá juvenilním polypům. • 34x zvýšená pravděpodobnost CRC; celoživotní riziko CRC asi 40%; průměrný věk dg. CRC 44 let. • Některé případy JPS (asi 20%) jsou spojeny s vrozenými mutacemi SMAD4 (DPC4) (18q21.1). Dědičný nepolypózní kolorektální karcinom - HNPCC = Lynchův syndrom • HNPCC představují asi 2-4% všech kolorektálních nádorů v západních zemích. • Průměrný věk detekce nádoru u HNPCC pacientů je 40 let. • Pacienti nemají zvýšený počet prekurzorových adenomů. • Celoživotní riziko vývoje CRC je pro ženy 50%, pro muže 80% a celoživotní riziko vývoje nádoru dělohy je 60%. • Pacienti s HNPCC ohroženi dále nádory vaječníků, žaludku, pankreatu a močových cest. • Vývoj nádorů souvisí s mutacemi genů MMR, nádory jsou geneticky nestabilní a progredují rychle, jsou ale méně agresivní než FAP (jsou diploidní). • Somatické mutace v genech MMR (nejčastěji metylace MLH1) se nejčastěji vyskytují u kolorektálních nádorů, u nádorů dělohy, a u nádorů žaludku (asi 13-15%), u jiných typů nádorů jsou vzácné (asi 2%). Dědičný nepolypózní kolorektální karcinom • autozomálně dominantní syndrom • syndrom je spojen s vrozenými mutacemi genů pro opravu chybného párování ( „mismatch repair“): • MSH2 (první detekovaný; 2p15-16, 106 kDa) • MLH1 (3p21; 85 kDa) - tyto dva odpovídají za více než 90% HNPCC • PMS2 (7p22; 96 kDa) • MSH6 (2p16) - odpovídá za odlišný fenotyp - tyto dva odpovídají jen za malý podíl HNPCC • PMS1 (2q31) • MSH3 (5q11-q12) - jejich význam v MMR je stejně velký, ale jejich mutace jsou jen vzácně předávány v zárodečné linii • MLH3 (14q24.3) Oprava chybného párování • MMR studován v souvislosti s nádory po objevení skupiny sporadických kolorektálních nádorů, u kterých byly v genomu nalezeny rozsáhlé změny v oblastech poly(A). Později byly nalezeny obdobné změny také v poly(CA) opakováních a tento jev dostal označení mikrosatelitová nestabilita. • Mikrosatelitová DNA se zdá být zvláště náchylná k chybnému párování, protože při syntéze krátkých tandemových repetic DNA může snadněji dojít ke sklouznutí syntetizovaného řetězce vůči templátu: např. A7  A6 nebo A8 Důsledky defektů v opravě chybného párování „Onkogenní“ mutace vznikající sekundárně v důsledku nestability repetic (mikrosatelitů) se mohou objevit v kterémkoliv genu. Popsáno např. u APC, genu pro receptor pro TGFßII (sekvence 10A kódujících 3 lyziny), gen pro BAX (obsahuje sekvenci 8G - kodóny 38-41: u MMR+ nádorů se v této sekvenci vyskytují časté inzerce nebo delece jedné báze – to typicky spojeno s nepřítomností mutace TP53). Příklad důsledku chyb v MMR: mutace TGF-βRII Tento gen často mutován u CRC s mikrosatelitovou nestabilitou. V genu se nachází mikrosatelit 10A. Často deletován 1 nebo 2 A  non-sense mutace  předčasně ukončená translace  ztráta Cterminální signální domény  rezistence k signalizaci TGFβ. (výsledný protein má 129 nebo 161 namísto 565 AA) Peutz-Jeghersův syndrom - PJS • autozomálně dominantní dědičné onemocnění (Peutz 1921; Jeghers 1949) • Spojeno s výskytem typických pigmentových lézí okolo rtů a na sliznicích (nepodléhají maligní transformaci) a s tvorbou hamartomatózních polypů, především v tenkém střevu, ale i v tlustém střevu a žaludku. Tyto polypy obvykle zůstávají benigní, ale mohou malignizovat (pravděpodobně přes adenomy a dále karcinomy; phakomatosa). • Zvýšené riziko různých typů nádorů, především nádorů pankreatu, gastrointestinálního traktu, bilaterálních nádorů prsu, vzácněji gynekologických nádorů. Peutz-Jeghersův syndrom • PJS spojen s mutacemi genu LKB1 (STK11) na chromozomu 19p13.3. • LOH pozorována u menšího podílu hamartomatózních polypů a u 70% maligních nádorů PJS pacientů  haploinsuficience LKB1 iniciuje tvorbu hamartomů. • Mutace LKB1 jsou vzácné u sporadických nádorů. • Zárodečné mutace LKB1 asi u 70% postižených rodin, penetrance téměř úplná (93%). Průměrný věk detekce maligního nádoru je 43 let. Předpokládá se existence dalšího genu zodpovědného za PJS. • Produktem genu je serine-threoninová protein kináza vyskytující se v jádře i cytoplazmě. • Většina mutací vede k úplné ztrátě proteinu LKB1, bodové mutace inaktivují kinázovou aktivitu. • Aktivita LKB1 je regulována fosforylací. Exprese LKB v tenkém střevu Kmenové epiteliální buňky jsou v kryptách, diferencují a během 3-5 dnů migrují na vrchol klků; frakce buněk migruje do bází krypt. Na vrcholku klků i v bázi krypt buňky prodělávají apoptózu. Vysoká exprese LKB1 je na vrcholcích klků a na bázi krypt – především v buňkách procházejících apoptózou. Yoo LI et al, Nature Rev Cancer 2 (2002) 673-680 Funkce LKB1 • LKB1 je exprimován v buňkách procházejících apoptózou. • Vysoká exprese LKB1 indukuje apoptózu. • V apoptotických buňkách je protein LKB1 translokován do mitochondrií.  Protein LKB1 hraje pravděpodobně roli v regulaci apoptózy. • Podle některých studií jsou v nádorech s mutacemi LKB1 vzácné mutaceTP53 – to naznačuje funkční souvislost LKB1 a p53 (apoptóza?). • LKB1 pravděpodobně také indukuje blok buněčného cyklu, pravděpodobně indukcí p21WAF1/Cip1. Důsledek špatných oprav DSBs pro genetickou stabilitu NHEJ - nonhomologous end joining SSA - single-strand annealing HR - homologní rekombinace Venkitaraman AR, Cell 108: 171-182, 2002 Fyziologický výskyt DSBs • meiotická rekombinace • přestavba genů pro imunoglobuliny a receptory B buněk a T buněk (V(D)J) Síť proteinů, které opravují dvouřetězcové zlomy DNA homologní rekombinací • tyto proteiny udržují integritu genomu • jejich mutace v zárodečné linii predisponují k vývoji nádorů modré šipky: fosforylace Wang JYJ, Nature 405: 404-405, 2000 Ataxia – Telangiectasia (A-T) • autozomální recesivní onemocnění • frekvence výskytu asi 1:40.000 narozených lidí (USA); frekvence nositelů (tj. heterozygotů) asi 1% • progresivní neuromotorické dysfunkce související s postupnou degenerací (ataxií) některých oblastí mozku (cerebellum) • endokrinní dysfunkce • dysfunkce imunitního systému • sterilita, předčasné stárnutí • citlivost k ionizujícímu záření, inhibitorům topoizomeráz,... • zvýšené riziko vývoje nádoru Ataxia telangiectasia zvýšené riziko vývoje nádoru: • asi u 38 (25) % pacientů s AT se vyvine během (zkráceného) života nádor - především (85%) T-lymfomy a CLL - chronická lymfocytární leukémie, ale také zvýšený výskyt nádorů žaludku, meduloblastomů, gliomů, nádorů močovodů Choi M et al. 2016, DOI: 10.1158/1535-7163.MCT-15-0945 Ataxia telangiectasia • heterozygoti (nositelé) ATM mají asi 2-3x zvýšené riziko nádoru prsu a CLL heterozygoti mají částečně zvýšenou citlivost k ionizujícímu záření ( haploinsuficience) (USA - 1995: nositelé mutací ATM představují asi 1% populace a mají asi 5% všech nádorů) Ataxia telangiectasia: gen • lokalizován na chromozomu 11 (11q22.3), 66 exonů • exprimován ve všech tkáních • popsáno více než 250 (167) různých mutací ATM, časté je zkrácení proteinu • zdá se, že existuje vztah genotyp - fenotyp Weinberg RA: The Biology of Cancer. GS, 2007 Spektrum mutací ATM Choi M et al. 2016, DOI: 10.1158/1535-7163.MCT-15-0945 Frekvence somatických mutací ATM u různých typů nádorů Choi M et al. 2016, DOI: 10.1158/1535-7163.MCT-15-0945 Ataxia telangiectasia: protein • 3506 AA, 370 kDa • serin/threonin protein kináza, C-konec výrazně homologní s kinázou PI3K (PIKK rodina „PI3K-like protein kinases“: PIRK, ATM, ATR, DNA-PKs, TRRAP,..) • Je aktivován dvouřetězcovými zlomy DNA (DSBs) vyvolanými např. ionizujícím zářením (ne UV!), inhibitory topoisomeráz. • Aktivace ATM představuje bezprostřední a primární reakci na DSBs (ne jedinou). Později jsou aktivovány další ATM-nezávislé signální dráhy. Cílové proteiny • fosforyluje p53 na ser15  stabilizace a aktivace • fosforyluje MDM2 alespoň na dvou místech  uvolnění komplexu MDM2-p53 • fosforylace a aktivace dalších substrátů: např. Chk2, c-Abl, BRCA1, NBS1, FANCD2 a dalších Cílové signální dráhy ATM Rotman G and Shiloh Y, Oncogene 18 (1999) 6135-6144 Funkce ATM při opravě DSBs Choi M et al. 2016, DOI: 10.1158/1535-7163.MCT-15-0945 Úloha proteinu ATM Jako odpověď na dvouřetězcové zlomy DNA: • zastavit buněčný cyklus • indukovat reparaci DBS: mimo jiné přímou interakcí s proteinem RAD51 (RAD51 interaguje také s BRCA1 a BRCA2) Této funkci odpovídají klinické symptomy typické pro A-T: pohlavní buňky, které procházejí meiozou a meiotickou rekombinací, a zrající lymfocyty, ve kterých dochází k V(D)J rekombinaci, jsou citlivější k nepřítomnosti funkce ATM ( sterilita, imunodeficience,..) Nijmegen breakage syndrome - NBS • Velice podobné symptomy jako pacienti s A-T, i když klinicky rozlišitelné onemocnění: mikrocefalie, mentální retardace (tyto dva znaky specifické pro NBS), růstová retardace, endokrinní dysfunkce, imunodeficience, citlivost k záření, zvýšené riziko vývoje nádorů, především B-lymfomů (asi u 40% pacientů se vyvine lymfom do 20 let). • Také na úrovni buněk silné podobnosti: zvýšená „lámavost“ chromozomů - souvisí s neschopností opravovat dvouřetězcové zlomy (DSB). • Spojeno s mutací genu NBS1 (8q21). • autozomálně recesivní dědičnost Nijmegen breakage syndrome - NBS • Protein NBS1 (nibrin: „bratranec ATM“) je součástí trimeru (MRE11 a RAD50), který interaguje s místy dvouřetězcových zlomů DNA a připravuje je na jejich opravu. • NBS1 v komplexu funguje jako „senzor“ – bez jeho přítomnosti MRE11-RAD50 není lokalizován v místech DSB – i jako efektor – podílí se i na samotné opravě. • MRE11 je mutován ve vzácném onemocnění ATLD („AT-like-disorder“). • MRE11 má nukleázovou aktivitu, v místech DSB odštěpuje nukleotidy a tvoří jednořetězce DNA. RAD52  zprostředkovává vazbu Rad51 na ssDNA; preferenčně váže ssDNA, a tím podporuje annealing komplementárních sekvencí DNA  polymerizuje, obtáčí se kolem ssDNA a vytváří pravotočivé vlákno, které umožňuje udržet ssDNA v nataženém stavu. RAD51 • Asi 10% nádorů prsu je dědičných, z nich asi 50% souvisí s mutacemi BRCA1 a BRCA2. • Podíl vrozeného zvýšeného rizika nádoru prsu způsobena jinými zárodečnými mutacemi: TP53, PTEN, LKB1 (5-10%) a zřejmě ještě dalších, neznámých genů (40%).  Somatické mutace genů BRCA jsou u sporadických nádorů vzácnější! Dědičná forma nádoru prsu BRCA1, BRCA2  nemají homology u kvasinek nebo drozofily - jsou to poměrně „mladé“ geny (obratlovci)  BRCA1: objeven 1994; lokalizován 17q21.31; 22 exonů  BRCA2: objeven 1994/1995; 13q12.3; 27 exonů  kódují velké proteiny, které jsou exprimovány v řadě tkání a jsou lokalizovány hlavně v jádře  hrají významnou roli při ochraně struktury chromozomů, jejich funkce ale není totožná, nejsou to homology!!  fungují jako „caretakers“, udržují genetickou stabilitu Model funkce BRCA2 Wang JYJ, Nature 405 (2000) 404-405 Interaguje s RAD51 a reguluje jeho dostupnost a aktivitu.  DSBs aktivují ATM nebo ATR  ATM/ATR fosforyluje a tím aktivuje komplex BRCA2- RAD51  aktivovaný RAD51 nasedá na poškozené jednořetězcové úseky DNA a aktivuje homologní rekombinaci; uvolnění z opravených částí DNA je spojeno s defosforylací komplexu Funkce BRCA1  popsat přesnou funkci BRCA1 je mnohem komplikovanější • v oblastech DSB je rychle modifikován chromatin: fosforylace, acetylace histonů, přestavba chromatinu,… • BRCA1 se objevuje v místech DSB velmi rychle: je fosforylován kinázami ATM, ATR, ChK2,…, interaguje se SWI/SNF, HDAC/HATs,...  BRCA1 interaguje s komplexem MRE11/RAD50/NBS1, inhibuje nukleázu MRE11 a tak reguluje délku jednořetězců  BRCA1 interaguje s DNA helikázou BLM Funkce BRCA1  BRCA1 interaguje s proteiny MSH2 a MSH6, které se podílejí na opravě chybného párování  Při signalizování poškození DNA je zastaven procesing mRNA, mimo jiné působením proteinu BARD1; BRCA1 tvoří komplex BARD1- BRCA1  v oblastech poškození DNA je s BRCA1 kolokalizován protein kódovaný genem FANCD2 (mutovaný u Fanconiho anémie)  odpovídá za správné sestavení reparačních komplexů, které se seskupují v místech dvouřetězcových zlomů DNA – má funkci lešení Model funkce BRCA1 Wang JYJ, Nature 405 (2000) 404-405 Souvislost mutací BRCA1 s mutacemi dalších genů  Mutace obou alel BRCA1 nebo BRCA2 je pro buňku letální a přežití je zřejmě spojeno s mutacemi v některých kontrolních bodech buněčného cyklu, např. p53 („úzké okno přežití“). Chronologicky: vrozená mutace BRCA  inaktivace p53  mutace druhé alely BRCA (mutace druhé alely BRCA se skutečně během kancerogeneze objevuje poměrně pozdě). Frekvence mutací p53 vyšší u nádorů s mutacemi BRCA než u sporadických nádorů (plus jiné spektrum mutací). • Podobnou roli jako mutace p53 mohou hrát mutace genů spojených s kontrolním bodem sestavení mitotického vřeténka: Bub1, BubR1.  Mutace BRCA1 a 2 přežívají pouze buňky prsu a vaječníků, a to díky anti-apoptotickému působení estrogenů. Dědičný syndrom nádoru prsu a ovaria • frekvence mutací BRCA1 a 2 v populaci v ČR není známa, ve světě 1 : 300-800 • polovina pacientek může zdědit mutaci od svého otce • profylaktická mastektomie (odstranění prsních žláz) snižuje riziko nádoru prsu z celoživotních 85% na 1-5% (zbývající riziko může souviset s problematikou odstranění celé tkáně mléčné žlázy) • profylaktická adnexektomie (odstranění vaječníků a vejcovodů) snižuje riziko nádoru ovaria z předpokládaných 60% (u nosiček mutace BRCA1) nebo 20% (BRCA2) na 1-5% • operace se doporučuje ve věku 35-40 let • odstranění ovarií může sekundárně snížit riziko onemocnění nádorem prsu o 50% díky estrogenní depleci Foretová L.: Dědičný syndrom nádorů prsu a ovaria, Medical Tribune XI, 24.3.2015 Jak zlomit Damoklův meč BRCA mutace Ondřichová L. Jak zlomit Damoklův meč BRCA mutace. Medical Tribune XI (2) 2015 Hereditární malignity si zaslouží více pozornosti než dosud • Mutace BRCA1 či BRCA2 se nacházejí u více než pětiny (22 %) high grade serózních ovariálních karcinomů. Nejsou omezeny jen na tento typ nádoru, vyskytují se, i když vzácněji, i u endometriodních karcinomů. U světlobuněčných či mucinózních karcinomů je výskyt BRCA1/2 mutace ojedinělý.  BRCA mutace může být germinální, to se týká dvou třetin pacientek s BRCA pozitivním ovariálním karcinomem. Další třetina nemocných má mutaci somatickou. Hereditární malignity si zaslouží více pozornosti než dosud. Medical Tribune XII (10) 24.5. 2016 Jak vyrovnat dluh vůči BRCA pozitivním ženám • Bylo popsáno již více než 200 hereditárních nádorových syndromů… • Díky NGS (testováno 60 pacientů, u nichž nebyla detekována mutace ve vysoce rizikových genech BRCA, TP53 a HNPCC) byly odhaleny rizikové patogenní mutace např. v genech BAP1, ATM, ERCC2, PALB2, RAD51C, BRIP1, FANCA, FANCI, SDBH či PMS2. • Nejčastěji se vyskytovaly mutace v genu ATM, u mnoha nemocných byla poškozena také dráha Fanconiho anémie. • Příklad: žena s nádorem prsu, s výraznou rodinnou anamnézou (matka, sestra), TP53 a BRCA negativní: pozitivní kombinace mutací ATM a FANC. Jak vyrovnat dluh vůči BRCA pozitivním ženám. (XXXIX. BOD) AM Review 9, 2015, 10-15 Karcinom prsu u mužů • analýza 823 mužů s karcinomem prsu (a 2 795 kontrol) • (každoročně je ve Velké Británii diagnostikováno asi 350 případů ca prsu u mužů) • změny v RAD51B (SNP 17q24.1) zvyšují riziko karcinomu prsu u mužů o 50% • významná asociace také s TOX3 (16q12.1) • asi 10% pacientů má mutaci BRCA2, mutace BRCA1 se u karcinomu prsu mužů pravděpodobně neuplatňují • karcinom prsu mužů a žen je pravděpodobně velmi rozdílné onemocnění Orr N. 2012, Nat Genet 44: 1182-1184 RecQ helikázy • rodina RecQ helikáz (u člověka je jich 5) se podílí na udržování stability genomu: separují komplementární řetězce DNA s použitím energie z hydrolýzy ATP • do rodiny RecQ helikáz patří: BLM (RECQ2) (Bloomův syndrom) WRN (RECQ3) (Wernerův syndrom) RECQ4 (Rothmund-Thompsonův syndrom - RTS) - všechny syndromy jsou spojeny s vyšším rizikem vývoje nádorů Bloomův syndrom - BS • nesmírně vzácné autozomálně recesivní onemocnění • malý růst (proporční) (zvýšená apoptóza v důsledku vysoké mutability?) • výrazná predispozice k vývoji nádorů • typický (ptačí) obličej, typický vysoký hlas • přecitlivělost ke slunečnímu záření • častý Diabetes mellitus • sterilita mužů (ztráta spermatogeneze), snížená fertilita žen (předčasný nástup menopauzy) • imunodeficience Bloomův syndrom • příčinou mutace genu BLM lokalizovaného na chromozomu 15q26.1 • heterozygoti jsou zcela zdraví • mutace BLM jsou obecně v populaci velmi vzácné (mezi lety 1975 a 2003 nahlášeno celosvětově asi 220 případů), vyšší frekvence výskytu pouze u Ashkenazi židů (nositelem je 1 ze 110 lidí, a to mutace blmAsh: 6-pb delece a 7-pb inzerce v exonu 10; v jiných populacích nebyly detekovány specifické mutace). • mutace BLM všech typů: missense, frameshift, nonsense, splice-site Nádory u BS pacientů • vysoká frekvence (benigních i maligních) • široké spektrum nádorů (akutní leukémie, lymfomy, nádory jazyka, hrtanu, plic, jícnu, střev, kůže, prsu, děložního čípku,…) • velice nízký věk (průměrný věk diagnózy 24.7 roku) • vysoká frekvence mnohočetných primárních nádorů  nádorové onemocnění je nejčastější příčinou úmrtí Wernerův syndrom - WS • vzácné autozomálně recesivní onemocnění, frekvence výskytu je asi 1:220.000 - 1.000.000 • až do dospělosti normální fenotyp. Pak nastupuje předčasné stárnutí: ztráta elasticity kůže, šedivění vlasů, řídnutí vlasů, ztráta podkožního tuku (postižení vypadají asi o 20 až 30 let starší). Průměrný věk 47 let • zvýšené riziko vývoje nádoru (asi 30x): oproti normální populaci (10:1), především zvýšené riziko vývoje neepiteliálních nádorů (1:1): sarkomy měkkých tkání, osteosarkomy, melanomy, thyroidní nádory... • příčinou mutace genu WRN, který je lokalizován na chromozomu 8p12 • mutace WRN převážně non-sense a frameshift  zkrácený protein • mnoho postižených je mezi Japonci Penisi E, Science 272 (1996) 193-194 Rothmund-Thompsonův syndrom - RTS • autozomálně recesivní dědičnost • u některých postižených je mutován gen RECQ4, lokalizovaný na 8q24.3 • popsán původně jako onemocnění spojené s abnormalitami pigmentace kůže a ztrátou vlasů, postižením skeletu • spojeno se zvýšeným rizikem vývoje nádorů, často detekovaných před 25. rokem života; spektrum nádorů širší, ale hlavně osteogenní sarkomy Fanconiho anémie - FA • autozomálně recesivní onemocnění, velmi vzácné: často menší vzrůst, změny pigmentace, mikrocefalie,.. (heterogenní onemocnění) • spojeno se selháním kostní dřeně, což vede k různým vrozeným hematologickým abnormalitám (pravděpodobnost hematologických abnormalit 81% ve věku 40 let) • predispozice k vývoji nádorů, především: leukémie (AML), hepatocelulární karcinom, dlaždicobuněčné karcinomy • FA je vzácná, somatické mutace dráhy FA byly popsány u některých sporadických nádorů Fanconiho anémie • popsáno 11 (FANCA až FANCL) genů způsobujících FA (komplementační skupiny): nemají sekvenční homologii, spojuje je funkční souvislost • kódují komponenty jediné nádorové supresorové dráhy a tvoří jaderný komplex FA, který je nezbytný pro aktivaci klíčového proteinu FANCD2  FANCD2 je monoubikvitinován jako odpověď na poškození DNA, společně s dalšími proteiny (BRCA1 a BRCA2) je lokalizován v oblastech DBSs, podílí se na homologní rekombinaci • na buněčné úrovni je pro FA buňky charakteristická citlivost na činidla způsobující crosslink DNA (používá se i při diagnostice). Nádory kůže • Melanomy: vyvíjejí se transformací melanocytů buněk kůže, které produkují melanin • Nemelanomové nádory: - asi 80% představují karcinomy bazálních buněk - většinu ze zbylých 20% karcinomy dlaždicových buněk - nádory z kožních adnex (kožní „přívěsky“, drobné žlázky, vlasové folikuly,…) Xeroderma pigmentosum - XP • vzácné autozomálně recesivní onemocnění • frekvence výskytu asi 1:1.000.000 v USA a Evropě a asi 1:100.000 v Japonsku a severní Africe • vysoká citlivost k UV: extenzivní léze na kůži exponované slunečnímu záření, asi 1000x zvýšené riziko „sunlight-induced“ nádorů kůže*, dále zvýšené riziko leukémií a nádorů žaludku, mozku, plic • U některých pacientů (18%) spojeno s neurologickými abnormalitami. * XP je spojena se zvýšeným výskytem jak melanomů (5%) tak nemelanomových (odvozených z dlaždicových a bazálních buněk) nádorů kůže (95%) Xeroderma pigmentosum • 90% nádorů kůže se objevuje na obličeji, krku, a hlavě - místech nejvíce vystavených slunci. • Průměrný věk výskytu nádorů kůže je 8 let (sporadicky průměrně v 60ti letech). • Spojeno se zárodečnými mutacemi v některém genu ze sedmi komplementačních skupin XP-A až XP-G. Proteiny kódované těmito geny se podílí na nukleotidové excizní opravě (NER) jako součást multiproteinového komplexu. XP-V kóduje (error-prone) DNA polymerázu pol-η ( celkem 8 komplementačních skupin). Model mechanismů NER NER je proces, kterým se UVsvětlem (nebo dalšími exogenními mutageny) poškozené báze enzymaticky vyštěpují z DNA a následně se nahrazují správnými nukleotidy. NER zajištěna multiproteinovým komplexem asi o 24 podjednotkách. Z toho sedm proteinů kódováno geny, které tvoří 7 komplementačních skupin XPA – XPG, vyskytujících se u XP. Osmou skupinu tvoří XPV kódující tzv. „by-pass (error-prone) polymerase“ pol-η. Sekundární maligní neoplasie (SMN) indukované terapií • Tato problematika se rozvíjí s tím, jak přibývá především pediatrických pacientů dlouhodobě přežívajících po léčbě cytotoxickými terapeutiky. • Nejčastějšími nádory SMN jsou sarkomy kostí a měkkých tkání. • RAD (záření) je nejčastější příčinou SMNs. • Existuje korelace s dávkou RAD. • Mladý věk a nízká dávka RAD zvyšuje riziko thyroidních nádorů. • U žen léčených RAD pro Hodgkinův lymfom s věkem kontinuálně přibývá nádorů prsu. • U pacientů léčených alkylačními činidly a inhibitory topoizomerázy II se zvyšuje riziko vývoje sekundárních leukémií. Sekundární maligní neoplasie (SMN) indukované terapií Ukazuje se, že zvláště interakce terapie s genetickými predispozicemi je zásadní: • RB (retinoblastom): sarkomy, melanomy • NF1 (neurofibromy): neurofibrosarkomy, AML, JMML, gliomy • Gorlinův syndrom: RAD • přecitlivělost k ionizujícícmu záření: AT, NBS, BS, WS • přecitlivělost k UV záření: XP, BS • přecitlivělost k alkylačním činidlům: FA  Terapie u pacientů s vrozenými dispozicemi musí být pečlivě zvažována!!!