Molekulární a buněčná
biologie nádorů
Prof. RNDr. Jana Šmardová, CSc.
Ústav experimentální biologie
Přírodovědecká fakulta
MU Brno
2020
Bi9910
středa 14.00 – 16.00
A11 – č. 306
7. Apoptóza a
nádory
Molekulární a buněčná
biologie nádorů
2020
(1) Produkce vlastních proliferačních signálů
(2) Necitlivost k signálům zastavujícím buněčný cyklus
(3) Odolnost k programované buněčné smrti
(4) Neomezený replikační potenciál
(5) Indukce angiogenese
(6) Aktivace invazivity a metastazování
(7) Genetická nestabilita a mutace
(8) Přítomnost zánětu podporující nádor
(9) Přeprogramování energetického metabolismu
(10) Schopnost vyhnout se destrukci imunitním systémem
(11) Změny mikroprostředí nádoru
Získané vlastnosti maligního
nádoru
Hanahan D. and Weinberg R.A., Cell 144 (2011) 646-674
Buněčná smrt a vývoj nádoru
• Rychlost růstu tkání je
určována na jedné straně
rychlostí buněčného dělení
a na straně druhé rychlostí
buněčné smrti.
• Při homeostáze jsou oba
procesy v rovnováze.
• U nádoru je rovnováha
mezi buněčným dělením a
buněčnou smrtí porušena.
Rudin CM and Thompson CB, (1997) 193-203
Apoptóza a nekróza
Nekróza:
• týká se skupiny postižených buněk
• vyvolána nefyziologickým poškozením (virová infekce, hypotermie,
hypoxie, metabolické jedy, ..)
• fagocytóza makrofágy
• významná zánětlivá reakce
Apoptóza - programovaná buněčná smrt:
• postihuje jednotlivé buňky
• indukována i fyziologickými stimuly (nedostatek růstových faktorů,
změny hormonálních hladin, ..)
• fagocytóza okolních buněk nebo makrofágy
• žádná zánětlivá reakce
• na rozdíl od nekrózy je popsáno mnoho příkladů fyziologické
apoptózy
Morfologické znaky: začíná bobtnáním cytoplasmy a mitochondrií a končí
úplnou lyzí, netvoří se vesikly, rozpadají se organely, ztráta integrity
buněčné membrány
Biochemické znaky: ztráta regulace homeostáze, pasivní proces
nevyžadující energii (běží i ve 4C), nahodilá degradace DNA, postlytická
fragmentace DNA (= pozdní událost během nekrózy)
Nekróza
Morfologické znaky: kondenzace buňky a jádra, výchlipky membrány
(„blebs“), kondenzace chromatinu, fragmentace jádra a rozpad buňky na
apoptotická tělíska, membrána neztrácí svou integritu, ..
Biochemické znaky: přísně regulovaný, aktivní proces vyžadující energii
(neběží při 4C), nenahodilá fragmentace DNA (žebřík na ELFO),
uvolňování specifických faktorů z mitochondrií do cytoplasmy, aktivace
kaskád kaspáz, ..
Apoptóza
Buňky procházející apoptózou
Zornig M, Baum W, et al. (2000) 19-40
myší fibroblast
A. v přítomnosti séra B. v nepřítomnosti séra
HeLa buňka 24 hod po
přidání aktinomycinu D
Další formy buněčné smrti
Nekroptóza
• programovaná nekróza indukovaná externími stimuly (ligandy)
prostřednictvím proteinů RIP-1/RIP-3, je-li znemožněna apoptóza, např.
inhibicí kaspázy-8
Autofagie
• degradační dráha, při níž jsou poškozené organely nebo nevyužívané
proteiny degradovány v autofagosomech za uvolnění energie
Aponekróza
• nedochází k dokončení apoptózy, v konečných stádiích se objevují známky
nekrózy; klíčový je pravděpodobně intracelulární obsah ATP: není-li ATP k
dispozici, je zánik buňky dokončen formou nekrózy
Paraptóza
• nápadná tvorba vakuol a nabobtnání mitochondrií; nesouvisí s apoptózou
Apoptóza je fyziologický
proces
Buněčná smrt se v mnohobuněčném organismu objevuje během
celého vývoje. Je součástí embryogeneze a organogeneze např.:
• hormonálně regulovaná involuce „pulčího“ ocasu během vývoje
• odumírání neuronů během vytváření CNS
• odumírání buněk během tvorby končetin,…
Apoptóza v dospělém organismu je součástí fyziologických procesů a
odstraňuje škodlivé buňky, např.:
• negativní selekce autoreaktivních lymfocytů
• smrt buněk napadených virem
• buňky s poškozenou DNA
Regulace apoptózy u hlísta
Caenorhabditis elegans
• Bob Horvitz
• Nobel prize 2002
• háďátko obecné
• zcela průhledné tělo
• 131 z 1090 somatických buněk umírá během vývoje apoptózou
• průměrná délka života 20 dní
Změny v regulaci apoptózy
jsou patologické
Zvýšená apoptóza
• syndrom získané imunodeficience AIDS (CD4+ T-buňky)
• neurodegenerativní nemoci (Alzheimerova, Parkinsonova
nemoc, Huntingtonova choroba)
• myelodysplastický syndrom (hypercelulární dřeň, periferní
cytopenie)
• některé autoimunitní nemoci
• spinální svalová atrofie, roztroušená skleróza,...
Nedostatečná apoptóza
• nádory, MDS,...
• některá autoimunitní onemocnění
• virové infekce
Regulace apoptózy u hlísta
Caenrohabditis elegans
C. elegans byl prvním modelem pro studium molekulárních
mechanismů apoptózy.
Pro apoptózu C. elegans jsou klíčové 3 proteiny:
• CED-3 je kaspáza - cysteinová proteáza; existuje ve formě
zymogenu - neaktivního proenzymu, který je aktivován „by self-
cleavage“.
• CED-4 se váže na CED-3 a iniciuje jeho aktivaci
• CED-9 se váže na CED-4 a zabraňuje tak aktivaci CED-3
Normálně tvoří CED-9, CED-4 a CED-3 neaktivní komplex.
Apoptóza je stimulována disociací CED-9 a následnou aktivací
CED-3.
Regulace apoptózy u
Caenorhabditis elegans
U buněk určených k apoptóze protein EGL-1 odstraní z komplexu
CED-4/CED-3/CED-9 protein CED-9, zbylý komplex oligomerizuje a
následně se aktivuje CED-3.
Hengartner M, Science 281 (1998) 1298-1299
Regulace apoptózy v buňkách
obratlovců
V buňkách obratlovců se vyvinuly celé rodiny genů, které ale
odpovídají genům buněčné smrti C. elegans.
• Kaspázy jsou podobné CED-3.
• Jediný dosud známý homolog CED-4 je Apaf-1.
• Proteiny z rodiny Bcl-2 jsou homologní CED-9, s tím rozdílem,
že některé proteiny z rodiny Bcl-2 jsou antiapoptotické, jiné jsou
ale proapoptotické.
Regulace apoptózy
Apoptotická mašinerie je držena pod kontrolou i díky signálům
přežití, které přicházejí z vnějšího prostředí, a díky vnitřním
signálům, které monitorují buněčnou integritu.
Apoptóza je indukována, když například:
• buňka ztratí kontakt s vnějším prostředím (anoikis)
• buňka je neopravitelně poškozena
• buňka simultánně dostává signály indukující buněčné dělení a
apoptózu
• buňka dostává signály smrti (smrtící signály)
Regulace a průběh apoptózy
Vnější cesta receptorová: vazbou ligandu na příslušný receptor smrti
vzniká proapoptotický signál. Ten vede k aktivaci domény smrti za
kooperace dalších proteinů. Cílem je aktivace prokaspázy 8.
Vnitřní cesta: signalizací (např. přes p53) je zahájen apoptotický děj,
jehož složkou je systém Bcl-2/Bax, signalizace přes mitochondrie,
tvorba komplexu nazývaného apoptozóm a cílem je aktivace
prokaspázy 9.
Regulace a průběh apoptózy
1. Signalizace přes receptory
2. Vnitřní signalizace (mitochondrie)
3. Efektory apoptózy
Receptory smrti
• Jsou povrchové receptory, které přenášejí proapoptotické signály
indukované ligandy smrti.
• Mohou aktivovat kaspázy během sekund po vazbě ligandů a
způsobit odstranění buňky během několika hodin.
• Patří do superrodiny receptoru TNF (tumor necrosis factor):
- mají podobnou strukturu extracelulární domény (bohatou na
cystein)
- obsahují homologní cytoplasmatickou doménu smrti, která jim
umožňuje přímo interagovat s apoptotickým aparátem
Receptory smrti a jejich
ligandy
• Fas (CD95, Apo1) - FasL, CD95L
• TNFR1 (p55, CD120a) - TNF, lymphotoxin
• DR3 (Apo3, WSL-1, TRAMP, LARD) - Apo3L (TWEAK)
• DR4 - Apo2L (TRAIL)
• DR5 (Apo2, TRAIL-R2, TRICK 2, KILLER) - Apo2L (TRAIL)
• DR6 (TNFRSF21) - ? N-APP
• /EDAR (ectodysplasmin A receptor); NGFR (nerve growth factor
receptor)/
Fas/CD95 - FasL/CD95L
CD95L je homotrimer - váže se na tři receptory CD95 - a způsobuje
jejich klastrování - na tuto strukturu se váže adaptorový protein
FADD (Fas-associated death domain) a prostřednictvím vlastní
domény smrti interaguje s podobnou doménou na kaspáze 8, která
je touto interakcí indukována k aktivaci seberozštěpením a může
dále aktivovat další kaspázy, např. kaspázu-3, -7,.. (amplifikace).
Exprese Fas v mnoha buňkách, exprese FasL více omezena, téměř
výlučně na aktivované T lymfocyty a NK buňky.
Fyziologická apoptóza:
• periferních aktivovaných T-buněk na závěr imunitní odpovědi
• odstranění např. virem infikovaných nebo nádorových buněk Tbuňkami
nebo NK buňkami
Apoptotická
signalizace
receptorem CD95
DD - death domain
DED - death effector domain
Ashkenazi A and Dixit VM, Science 281 (1998) 1305-1308
Regulace receptorů smrti:
decoy receptory
• kompetují s funkčním receptorem o vazbu ligandu – „vychytávají“
ligand (decoy = návnada vs. decay = rozklad, rozpad), například:
• DcR3 („decoy receptor 3“): váže ligand FasL, a tím blokuje jeho
vazbu k funkčnímu receptoru Fas
• DcR1 (TRID, TRAIL-R3, LIT) - má podobnou strukturu jako DR4 a
DR5, ale zcela postrádá cytoplazmatickou část; mají glycosylfosfatydilinositolovou
skupinu, kterou jsou přichyceny na
membránu
• DcR2 (TRAIL-R4, TRUNDD) - má zkrácenou cytoplazmatickou
část o kritické aminokyseliny nutné k vyvolání odpovědi, tj. k
přenesení signálu
Další způsob regulace receptorů
smrti: decoy receptory
Ashkenazi A and Dixit VM, Science 281 (1998) 1305-1308
• antiapoptotický protein cFLIP („FLICE-like inhibitory protein“; FLICE
– „FADD-like ICE“ - původní označení pro kaspázu 8): strukturně
podobný kaspáze-8 (obsahuje DED doménu/y), ale bez
enzymatické aktivity – váže se na FADD a znemožňuje vazbu
prokaspázy-8 (a -10)
 několik isoforem s odlišnými funkcemi
 zasahuje i do regulace programované nekroptózy a autofagie
 zvýšená exprese c-FLIP nalezena u mnoha nádorů (např. CRC, ca
močového měchýře, čípku, některé lymfomy, ca jater,..); často
spojeno s horší prognózou
Regulace receptorů smrti:
c-FLIP
Safa A.R. Exp Oncol 34(3): 176-184, 2012
Regulace receptorů smrti:
c-FLIP
Fas/FasL brzdí kancerogenezi
• Vrozené defekty v expresi nebo funkci Fas způsobují vrozené
dispozice k autoimunitním nemocem, ale jsou také spojeny se
zvýšeným rizikem vývoje nádoru.
 Signalizace Fas/FasL je nádorově supresivní.
 mutace receptoru Fas
 snížená exprese receptoru Fas
 amplifikace genu pro DcR3 u některých nádorů plic a kolorektálních
karcinomů
Fas/FasL a nádory
TNFR1 - TNF
TNF je produkován hlavně aktivovanými makrofágy a T-buňkami
jako odpověď na infekci.
Aktivace TNFR1 vede jednak k zánětlivé odpovědi organismu
(aktivaci NF-B a AP-1), u některých buněčných typů k
apoptóze. Na rozdíl od CD95, TNFR1 nevyvolává apoptózu,
pokud není blokována syntéza proteinů ( existence proteinů
blokujících apoptózu).
Po vazbě TNF receptor TNFR1 tvoří trimery a dochází tak k
asociaci jejich domén smrti. Na ně se váže adaptorový protein
TRADD („TNFR associated DD“), který funguje jako platforma
pro vazbu dalších proteinů - TRAF2 a RIP, které stimulují
aktivaci transkripčních faktorů NF-B a AP-1.
Ke komplexu TNFR1-TRADD se může vázat adaptor FADD,
který potom aktivuje kaspázu-8.
DR3 – Apo3L
Receptor DR3 je velice podobný TNFR1, po stimulaci aktivuje NFB
přes TRADD, TRAF2 a RIP a indukuje apoptózu přes
TRADD, FADD a kaspázu-8.
Funkčně jsou DR3 a TNFR1 velmi podobné, ale zásadně se liší
expresí svou a svých ligandů:
• TNF je exprimován hlavně u aktivovaných makrofágů a
lymfocytů, zatímco Apo3L je konstitutivně exprimován téměř ve
všech tkáních.
• Naopak TNFR1 je exprimován obecně ve všech tkáních,
zatímco DR3 je přítomen hlavně ve slezině, thymu a v periferní
krvi a je indukován aktivovanými T-buňkami.
Apo
signalizace
receptory
TNFR a DR3
Ashkenazi A and Dixit VM, Science 281 (1998) 1305-1308
Nekroptóza
• nekróza indukovaná externími stimuly (ligandy) prostřednictvím
receptorů smrti, je-li znemožněna apoptóza, např. působením
inhibitorů kaspázy-8
• proces je regulovaný, ale morfologicky shodné znaky s
neregulovanou nekrotickou buněčnou smrtí
• klíčovým hráčem regulace je kináza RIP1 (receptor-interacting
protein 1)
Nekroptóza
Christofferson DE and Yuan J, Curr Opin Cell Biol 22 (2010) 263-268
Inhibitor apoptózy c-FLIP
inhibuje i nekroptózu
Safa A.R. J Carcinog Mutagen Suppl. 6, 2013
Receptory smrti: DISC
po vazbě ligandů
cytoplasmatické části těchto
receptorů - prostřednictvím
FADD nebo TRADD
domén – vytvářejí DISC
(„death-inducing signalig
complex“: ligand-receptoradaptor),
který štěpí
prokaspázu 8 na aktivní
kaspázu 8
 FADD – spojeno primárně s indukcí apoptózy;
TRADD – primárně indukce zánětlivé odpovědi
AshkenaziA, Nat Rev Cancer 2 (2002) 420-431
Receptory smrti a jejich ligandy
• CD95 (Fas, Apo1) - CD95L, FASL – primárně stimulace apoptózy
• TNFR1 (p55, CD120a) - TNF, lymphotoxin - primárně stimulace
zánětu
• DR3 (Apo3, WSL-1, TRAMP, LARD) - Apo3L (TWEAK) - primárně
stimulace zánětu
• DR4 - Apo2L (TRAIL) - primárně stimulace apoptózy
• DR5 (Apo2, TRAIL-R2, TRICK 2, KILLER) - Apo2L (TRAIL) –
primárně stimulace apoptózy
• DR6 (TNFRSF21)- ? N-APP - úloha zatím nejasná
Využití receptorů smrti k indukci
apoptózy nádorových buněk
Pro:
• DR mají přímou návaznost na apoptotickou mašinerii
• navozují apo nezávisle na p53 apod.
Proti:
• silné vedlejší účinky působení CD95L a TNF - šok připomínající
septický šok (indukce zánětlivých odpovědí!!)
Úloha mitochondrií v apoptóze
Mitochondrie hrají klíčovou úlohu v regulaci buněčné smrti.
(Endosymbiotický původ mitochondrií a evoluce aerobního
metabolismu u eukaryot vytvořily základ pro evoluci aktivní
buněčné smrti.)
Pro průběh apoptózy je klíčové vytvoření apoptozómu, proteinového
komplexu, který je nutný k aktivaci iniciační kaspázy. Apoptozóm je
tvořen cytochromem C, Apaf-1 a prokaspázou-9. Kritické pro
vytvoření apoptozómu je uvolnění cytochromu C z mitochondrií.
Úloha mitochondrií v apoptóze
Z mitochondrií uvolněny i další pro-apoptotické faktory:
 cytochrom c
 AIF (apoptosis-inducing factor)
 Smac (second mitochondria-derived activator of caspase)
 DIABLO (direct inhibitor of apoptosis-binding protein with low pI)
 Omi/HtrA2 (high temperature requirement protein A)
 endonukleáza G
 některé prokaspázy (-2, -3, -9)
Apoptozóm: „kolo smrti“
Apoptozóm se tvoří v
cytosolu, je-li uvolněn
cytochrom C z mitochondrií
a asociuje s Apaf-1. Tak se
vytvoří sedmiramenné kolo,
kde ramena jsou tvořena
sedmi podjednotkami Apaf-1
a jejich vrcholy tvoří
cytochrom C (červená). Toto
kolo přitahuje prokaspázu 9,
která se váže do středu/osy
kola (modrá) a je aktivována
na kaspázu 9
Weinberg R.A.: The Biology of Cancer. Garland Science 2007
Úloha mitochondrií v apoptóze
Cytochrom C je v mitochondriích
uložen mezi vnější a vnitřní
mitochondriální membránou.
Weinberg RA. The Biology of Cancer. Garland Science 2007
Regulace permeability
mitochondriální membrány
Bylo popsáno mnoho molekul, které ovlivňují permeabilitu
mitochondriální membrány - mitochondrie tak fungují jako integrátory
(pro- a anti-) apoptotických signálů.
• Především proteiny z rodiny Bcl-2*. Je to rodina (asi 25) proteinů
strukturou a funkcí homologní s proteinem CED-9. Některé proteiny z
rodiny Bcl-2 mají antiapoptotickou funkci: Bcl-2, Bcl-XL, Bcl-W, některé
proapoptotickou funkci: Bax, Bak, Bid, Bim.
*BCL2 („B-cell lymphoma gene-2“) byl první apoptotický gen objevený v savčích
buňkách (1988) díky své roli v maligní přeměně B-buněk - tak také poprvé
popsána nová třída proto-onkogenů: ne aktivátory buněčné proliferace, ale blok
buněčné smrti.
t(14;18) – FL
(nalezení homologie Bcl-2 a CED9 = „Aha! moment“)
Mitochondrie jako integrátory
apoptotických signálů
Proteinová rodina Bcl-2
Brenner C and Kroemer G, Science 289 (2000) 1150-1151
Struktura proteinů Bcl-2
• Pro všechny proteiny rodiny Bcl-2 je typická konzervovaná sekvence
označovaná jako Bcl-2 homologní motiv. Každý člen rodiny
obsahuje alespoň jednu tuto sekvenci ze čtyř: BH1 až BH4.
• Většina anti-apoptotických členů obsahuje BH1 a BH2, proteiny
nejvíce podobné Bcl-2 obsahují všechny čtyři.
• Pro-apoptotické proteiny tvoří dvě podrodiny: jedna (např. Bax, Bak,
Bok) je blízce příbuzná Bcl-2 a obsahuje BH1, BH2 a BH3, druhá je
vzdáleně příbuzná (např. Bik, Blk), obsahuje jen BH3 a představuje
spíše funkční analog proteinu EGL-1 (označují se někdy jako BH3
faktory).
BH3 je nezbytná pro funkci pro-apoptotických proteinů.
Struktura anti-apoptotických
proteinů Bcl-2
Adams JM and Cory S, Science 281 (1998) 1322-1326
Struktura pro-apoptotických
proteinů Bcl-2
Adams JM and Cory S, Science 281 (1998) 1322-1326
Puma
Noxa
Bmf
Proteinová rodina Bcl-2
Cory S and Adams JM, Nat Rev Cancer 2 (2002) 647-656
Význam multiplicity proapoptotických
proteinů
Různé fyziologické
stresy/signály fungují
prostřednictvím různých
proapoptotických proteinů, které
mají za úkol antagonizovat antiapoptotický
protein Bcl-2
Weinberg RA. The Biology of Cancer. Garland Science 2007
„Součinnost“ pro- a antiapoptotických
proteinů
Každý člen rodiny
Bcl-2 má svůj vlastní
soubor
antagonistických
proteinů. V centru
stojí anti-apoptotické
proteiny Bcl-2, Bcl-XL,
Bcl-w a Mcl-1.
Proteiny Bax a Bak – pokud nejsou „neutralizovány“ vazbou
„opozičních“ proteinů, indukují apoptózu otevřením mitochondriálních
vnějších kanálů.
Weinberg RA. The Biology of Cancer. Garland Science 2007
Struktura proteinů Bcl-2
• Proteiny z rodiny Bcl-2 mohou tvořit heterodimery a titrovat,
ovlivňovat navzájem svůj účinek: jejich vzájemné koncentrace tak
mohou fungovat jako apoptotický reostat.
• Sekvence BH1, BH2 a BH3 ovlivňují schopnost dimerizovat.
• Heterodimerizace není nezbytná pro anti-apoptotické proteiny.
• U pro-apoptotických proteinů je heterodimerizace nezbytná pro
BH3-only faktory,
• ale postradatelná pro proteiny typu Bax.
Model regulace Apaf-1
proteiny Bcl-2
• Anti-apoptotický protein (Bcl-XL) zabraňuje Apaf-1 aktivovat prokaspázu-9.
• Pro-apoptotický protein (Bik) může být stimulován k interakci s tímto
proteinem a tak zrušit tuto inhibici apoptózy.
Adams JM and Cory S, Science 281 (1998) 1322-1326
Proteiny Bcl-2 a nádory
Potenciálně jsou anti-apoptotické proteiny onkogenní:
• bcl-2 v translokacích spojených s folikulárními lymfomy a difúzními
velkobuněčnými lymfomy a CLL
• Nepřímá účast v kancerogenezi: Myb, Ras,.. indukují expresi bcl-
2. Exprese bcl-2 zvýšena např. u myeloidních leukémií, nádorů
žaludku.
Pro-apoptotické proteiny jsou potenciálními nádorovými supresory:
• bax je mutován u některých nádorů trávicího traktu (Lynchův
syndrom!) a některých leukémií
• exprese bax (a dalších) redukována u nádorů s mutací TP53
Apoptotické dráhy u hlísta a
savčí buňky
Klíčové rozdíly apoptotické mašinerie nematod a savců: cytochrom C,
proteiny IAP  savčí apoptóza je komplexnější
Adams JM and Cory S, Science 281 (1998) 1322-1326
Signály přežití (X signály smrti)
• Některé cytokiny mají povahu signálů přežití (nikoli mitotických
signálů!).
• IGF-I („insuline-like growth factor“)
• tyrosin protein kinázový receptor
• funguje jako heterotetramer (2 podjednotky α a β)
• signál je přenášen přes PI3K a vede k:
• buněčné proliferaci, inhibici
apoptózy (případně indukci
diferenciace);
• může indukovat maligní
transformaci, reguluje
mezibuněčné interakce a pohyb
buněk.
Hartog H et al, Eur J Cancer 43 (2007) 1895-1904
Anoikis
• Většina buněk potřebuje být přichycena k extracelulární matrix
(ECM), aby mohla přežít („anchorage dependent cell survival“).
Tuto vazbu zprostředkovávají integriny.
• Buňka, která ztratí kontakt s ECM, zahájí apoptózu - tzv. anoikis
(z řečtiny - bezdomovectví).
• Integriny rozpoznávají na cílových proteinech ECM sekvenci
arginin-glycin-aspartát (RGD).
• Vazba integrinů k ECM není o prostém přichycení, ale hlavně o
získávání nutných signálů přežití.
Úloha proteinů RGD v
apoptóze
Buňky přisedají k ECM
vazbou integrinů.
Přidání solubilních RGD
proteinů způsobuje
apoptózu aktivací
kaspázy-3.
Vazbou integrinů k ECM
získává buňka signály k
přežití.
Ruoslahti E and Reed J, Nature 397 (1999) 479-480
Anoikis
• Na zprostředkování „anchorage-dependent cell
survival“ se podílí FAK.
• FAK je jedním z cílů kaspáz během apoptózy.
• Signalizace FAK je pravděpodobně
zprostředkována PI3K, a to buď přímou interakcí
FAK s podjednotkou p85 nebo aktivací Ras a
následnou aktivací PI3K.
• Signalizace PI3K potom vede přes c-Akt k
fosforylaci pro-apoptotického proteinu Bad.
Kaspázy - efektory apoptózy
• Rodina cysteinových proteáz, které mají specifitu k aspartátové
kyselině na substrátu („cysteine aspartyl-specific proteases“).
• Analogy proteinu CED-3. První savčí popsaná kaspáza: ICE*
(„interleukin-1-converting enzyme“) - kaspáza-1
• Jsou hlavními vykonavateli finální exekuční fáze apoptózy.
• Jsou konstitutivně přítomny v cytosolu buněk, a to ve formě
jednořetězcového proenzymu jako prokaspázy.
Např. prokaspáza-8 má asi 1-2% aktivity plně funkční kaspázy-8.
• Sdílejí podobnost sekvenční, strukturní a substrátovou.
* ICE nemá prokazatelnou úlohu v apoptóze, ale byla to první identifikovaná
proteáza celé rodiny proteinů, které mají úlohu v apoptóze a zánětu.
Aktivace kaspáz
Proenzym má velikost 30 až 50 kD a tři domény: N-terminální, velkou
podjednotku (20 kD) a malou podjednotku (10 kD).
Prokaspázy jsou aktivovány dvojím proteolytickým štěpením:
• Molekula prokaspázy je rozštěpena na dvě podjednotky - menší a
větší.
• Je odštěpena N-terminální
doména.
• Podjednotky vytvoří tetramer
(2+2 podjednotky)
se dvěma aktivními místy.
Alberts B et al: Základy buněčné biologie. Espero Publishing 1998
Aktivace kaspáz
• Kaspázy patří k proteázám s nejvyšší specifitou a vysokou aktivitou.
Ve specifitě jsou mezi kaspázami rozdíly - mají odlišné funkce.
• Všechny prokaspázy jsou aktivovány štěpením v místě, které je
konsensus sekvencí* pro kaspázy.
 Kaspázy jsou aktivované autokatalyticky nebo enzymy s podobnou
specifitou.
• Během apoptózy fungují jako iniciátory (2, 8, 9, 10), kdy iniciují
řetězec - kaskádu událostí jako odpověď na proapoptotické signály,
a jako efektory (3, 6 a 7), kdy se podílejí na odstranění buňky
(degradaci proteinů).
* Štěpí za kyselinou aspartovou a rozpoznávají alespoň další 4
aminokyseliny směrem k N-konci molekuly.
Struktura a funkce kaspáz
Thornberry NA and Lazebnik Y, Science 281 (1998) 1312-1316
Regulace kaspáz
Kaspázy jsou v neaktivní formě konstitutivně přítomné v buňce:
 jejich aktivitu lze rychle indukovat
 jejich regulace musí být velmi efektivní
1. Aktivace iniciačních kaspáz - především kaspázy-8 a kaspázy-9 (2,
10)
2. Aktivace efektorových kaspáz (3, 6, 7)
• Různé iniciační kaspázy zprostředkovávají různé signály (receptory
smrti - kaspáza-8, cytotoxické látky - kaspáza-9), ale spouštějí stejné
následné efektorové kaspázy. Tak je vysvětleno, jak různé
apoptotické signály vedou ke stejným biochemickým a
morfologickým změnám.
• Proapoptotické signály kulminují aktivací iniciačních kaspáz, které
potom následně aktivují efektorové kaspázy - kaskádový model.
Různé apoptotické signály mají
stejný výsledek
Kaspázy fungují v aktivační
kaskádě
Alberts B et al: Základy buněčné biologie. Espero Publishing 1998
Aktivace iniciačních kaspáz
Kaspázy jsou regulovány pomocí
jak aktivátorů, tak inhibitorů.
Apoptotické signály iniciují tři
dráhy:
1. Aktivaci kofaktorů
• uvolnění cytochromu C,
tvorba komplexu s APAF-1,..
• aktivace FADD, ..
2. Modifikace prokaspázy
• např. přemístění prokaspázy-8
k receptorovému komplexu,..
3. Inaktivace inhibitorů
• FLIP, ARC, IAP,...
Thornberry NA and Lazebnik Y, Science 281 (1998) 1312-1316
Inhibitory kaspáz IAPs
• (c-FLIP)
• Inhibitors of Apoptosis Proteins
 skupina strukturně i funkčně příbuzných proteinů – obsahují
doménu BIR (Baculovirus IAP Repeat)
• alespoň 8 různých IAPs u člověka: - např. NAIP (BIRC1) Survivin
(BIRC5), XIAP (BIRC4), cIAP1 (BIRC2), cIAP2 (BIRC3), Apollon
(BIRC6), Livin (BIRC7)…
 váží se na kaspázy prostřednictvím domény BIR a blokují jejich
aktivitu nebo indukují jejich degradaci
 U některých nádorů je např. zvýšená exprese Survivinu.
Inhibitory inhibitorů:
pro-apoptotické proteiny
 Naopak proteiny
DIABLO/Smac (direct inhibitor
of apoptosis-binding protein
with low pI/ second
mitochondria-derived activator
of caspase), Omi/HtrA2 (high
temperature requirement
protein A) se mohou vázat na
proteiny IAP a inhibovat jejich
působení. Ovlivňují tak citlivost
buněk k apoptotickým
signálům.
Wong RSY, J Exp Clin Cancer Res 30 (2011) 87
Regulace apoptózy: IAP a
DIABLO/Smac
De Laurenzi V and Melino G, Nature 406 (2000) 135-136
Úkoly kaspáz
A. Inaktivace inhibitorů apoptózy, např.:
• Inaktivace ICAD, který je inhibitorem CAD - nukleázy, která je
odpovědná za fragmentaci DNA.
• Inaktivace Bcl-2 - pravděpodobně je tak nejen inhibován
inhibitor apoptózy, ale produkován i fragment, který potencuje
apoptózu (amplifikace!).
B. Desintegrace buněčných struktur, např.:
• Destrukce jaderné laminy - struktura pod jadernou membránou,
která se podílí na kondenzaci chromatinu.
Úkoly kaspáz
C. Inaktivace některých proteinů
(separováním regulační a
katalytické podjednotky),
účastnících se:
• regulace cytoskeletu (FAK, kináza
PAK2,..)
• replikace DNA
• oprav DNA
• sestřihu mRNA, ..
D. Účast kaspáz a dalších
„apoptotických“ molekul - např.
FADD - v regulaci buněčného
cyklu!
Thornberry NA and Lazebnik Y, Science 281 (1998) 1312-1316
Poškození apoptózy u nádorů
1. poškození receptorové dráhy: (i) snížená exprese receptorů smrti
(např. Fas); (ii) snížená exprese signálů smrti (např. FasL); (iii)
zvýšená exprese decoy receptorů
2. porušení rovnováhy proteinů rodiny Bcl-2: (i) zvýšená exprese
antiapoptotických proteinů (např. up-regulace bcl-2
chromozomální translokací t(14;18) ve folikulárních lymfomech);
(ii) snížená exprese proapoptotických proteinů
3. poškození funkce p53 (regulace apo mechanismem transaktivace
bax a dalších genů a přímou regulací mitochondrií)
4. snížení exprese kaspáz
5. zvýšení exprese inhibitorů apoptózy (např. survivinu a dalších
IAPs)
6. zvýšení exprese faktorů přežití (např. IGF-1, IGF-2)
Poškození apoptózy u nádorů
Wong RSY, J Exp Clin Cancer Res 30 (2011) 87
Anti-apoptotické
strategie nádorů
Nádory používají nejrůznější
strategie, jak zmenšit šanci
na vstup do apoptózy. Buď
snižují hladinu/aktivitu
proapoptotických (modře)
proteinů, nebo zvyšují
hladinu/aktivitu
antiapoptotických
(červenohnědě) proteinů.
Aktivace apoptózy nádorovým
supresorem p53
p53 aktivuje apoptózu několika
signálními drahami:
1.  Transaktivuje fas (na povrchu
buňky se tak vystavuje receptor Fas a
buňka se stává citlivou k působení
FasL, který může být přítomen v
extrabuněčném prostoru.
2.  Indukuje expresi IGFBP-3 (IGFbinding
protein-3) a jeho uvolňování do
extracelulárního prostoru, kde váže
IGF-1R. Bez vazby IGFBP-3 se na
receptor IGF-1 váže IGF-1 a to vede k
uvolnění anti-apoptotických signálů v
buňce, které inaktivují Bad, kaspázu-9
a IΚB.
3.  Indukuje expresi bax, což vede k
uvolnění cytochromu C z mitochondrií.
4.  Inaktivuje některé anti-apoptotické
faktory, např. Smac/DIABLO.
cílové geny p53
jsou označeny
červeně
Aktivace apoptózy nádorovým
supresorem p53
Inhibitory apoptózy
• c-FLIP
• IAPs
• NF-B
 stimuluje přežívání, buněčný růst, metastatický potenciál,…
Autofagie
• Fyziologický program autofagie vede k degradaci buněčných
organel (např. ribozomů, mitochondrií), což umožňuje využít
výsledné katabolity k biosyntéze a metabolismu energie. To
stimuluje přežití v podmínkách stresu a hladovění, nedostatku.
• Intracelulární váčky – autofagozomy – pohlcují organely a fúzují s
lysozomy, následně probíhá degradace.
• Normálně běží jen na bazální úrovni, ale může být výrazně
stimulována stresem a nedostatkem živin.
• Zřejmé propojení regulace autofagie, apoptózy a buněčné
homeostáze. Signální síť zahrnuje PI3-K, AKT, mTOR.
• Specifickým regulátorem autofagie je Beclin-1, který patří mezi
BH3-only proteiny.
• Indukce autofagie může sloužit jako bariéra proti vývoji nádorů a
může fungovat nezávisle na apoptóze, ale také v kooperaci s
apoptózou. Možná tak představuje další nezávislou bariéru proti
nádorům.
• Hladovění, radioterapie, některé cytotoxické léky mohou
stimulovat autofagii, která má zřetelné cytoprotektivní účinky u
nádorových buněk. Může spíše umožňovat jejich poškození než
přímo zničení.
• Těžce stresované buňky se mohou díky autofagii zmenšit a
vstoupit do stavu přechodné dormance, což umožní přežití a
pozdější (po odeznění účinku terapie) další růst a vývoj.
 „dvousečná zbraň“ (double-edged sword) autofagie při modulaci
nádorů
Autofagie
Autofagie moduluje přežití a
regeneraci nádorových buněk
stres
autofagie
terapie
nádoru
dormance
kancerogeneze
odstranění
stresu
MCCR
regenerace
MCCR –minimal cells capable of recovery
White E and DiPaola RS, Clin Cancer Res 15 (2009) 5308-5316
Inhibitor apoptózy c-FLIP
inhibuje autofagii
Safa A.R. J Carcinog Mutagen Suppl. 6, 2013
• c-FLIP inhibuje autofagii přímou interakcí se složkami autofagové
mašinerie
Terapie nádorů zacílená na
apoptózu
1. rodina proteinů Bcl-2: inhibice proteinu Bcl-2 (antisense
oligonukleotidy, nízkomolekulární inhibitory)
2. protein p53 (genová terapie, malé molekuly obnovující funkční
konformaci proteinu, p53 vakcíny, …)
3. inhibitory IAPs (siRNA; antisense oligonukleotidy, …)
4. samotné kaspázy: nízkomolekulární aktivátory, např. apoptotin,
genová terapie,…)
vs. receptory smrti (indukce zánětu!) a c-FLIP (příliš velká podobnost
s kaspázou-8 – inhibitory by inhibovaly také kaspázu-8)