Molekulární a buněčná biologie nádorů Prof. RNDr. Jana Šmardová, CSc. Ústav experimentální biologie Přírodovědecká fakulta MU Brno 2020 Bi9910 středa 14.00 – 16.00 A11 – č. 306 8. Telomery, telomeráza, buněčná senescence a nádory Molekulární a buněčná biologie nádorů 2020 Stárnutí buněk  Normální diploidní buňky se nemohou v kultuře dělit donekonečna. Mají naprogramovaný (tzn. vnitřními faktory určený) konečný počet buněčných dělení, kterými mohou projít (Leonard Hayflick, 1961). Pro lidské diploidní fibroblasty (HDF) je to asi 50-60 cyklů.  Po dosažení tohoto počtu dělení se u buněk vyvine senescentní fenotyp (M1 – „mortality stage 1“): buňky změní morfologii, jsou nadále metabolicky aktivní, ale nedělí se. Blok buněčného cyklu je udržován signalizací přes proteiny p53/p21 a p16/RB.  Jsou-li vyřazeny tyto dráhy, buňky se dále (20 až 30x) dělí, až dosáhnou krize (M2 – „mortality stage 2“). I potom se mohou dělit, ale díky velkým chromozomálním aberacím vstupují často do apoptózy.  Vzácně (s pravděpodobností asi 10-6) mohou buňky uniknout krizi a stát se nesmrtelnými. „Telomerová hypotéza“ Telomery jsou repetitivní sekvence DNA na koncích lineárních chromozomů, na které se váží proteinové komplexy. Jejich hlavní funkcí je ochrana konců lineárních chromozomů. telos = konec (end) meros = část (part) Telomeráza je ribonukleoproteinový enzym, který je nutný pro kompletní replikaci konců DNA, tj. pro udržování stabilní délky telomer. • Většina buněk neexprimuje telomerázu a telomery se proto progresivně zkracují při každém buněčném dělení. To souvisí s problémem neúplné replikace chromozomů: Problém neúplné replikace chromozomů • DNA polymeráza katalyzuje prodlužování řetězce jen ve směru 5´ 3´ • proto se jedno vlákno uvnitř replikační vidlice syntetizuje kontinuálně a jedno diskontinuálně po Okazakiho fragmentech z RNA primeru • RNA primery jsou potom odstraněny a nahrazeny sekvencí DNA • jen na 5´- koncích dceřiného vlákna zůstává nedosyntetizovaná část vlákna  zkrácení při každé replikaci Telomerová hypotéza Zkracování telomer funguje jako mitotické počítadlo, které určuje proliferativní kapacitu všech buněčných typů, které nemají telomerázovou aktivitu. Délka telomer určuje replikativní potenciál buněk Mathon NF and Lloyd AC, Nat Rev Cancer 1 (2001) 203-213 Elizabeth Helen Blackburn Nobelova cena 2009 • narodila se (26.11.1948) v Austrálii, studovala v Melbourne a v Cambridge • v současnosti je prezidentkou Salk Institute, La Jolla, Ca, USA • studuje telomery, je spoluobjevitelkou telomerázy (1985) – za tento objev získala Nobelovu cenu za lékařství a fyziologii 2009 společně s Jackem Szostakem a svou bývalou studentkou Carol Greiderovou Senescence nezávislá na délce telomer  senescenci mohou navodit i jiné (externí) podněty než kritické zkrácení telomer (předčasná senescence X replikativní senescence): • látky poškozující DNA • oxidativní stres • aktivace mitogenních signálních drah (např. aktivace Ras) • kumulativní trauma in vitro kultur („culture shock“ - kultivační šok) - náhlá změna kultivačních podmínek Weinberg RA. The Biology of Cancer. Garland Science 2007 Typy buněčné senescence: co ji indukuje  replikativní senescence • krátké telomery  „předčasná“ senescence • aktivace (i inaktivace) některých onkogenů (oncogene-induced senescence - OIS) (např. K-Ras, B-Raf, MYC) • inaktivace (i up-regulace) některých nádorových supresorů (např. PTEN, TSC2, NF1, VHL) • cytokiny • reaktivní kyslíkové radikály • poškozená DNA (genotoxický stres) • nedostatek nukleotidů • metabolický šok • … kultivační šok Co indukuje buněčnou senescenci  replikativní senescence • krátké telomery  „předčasná“ senescence • onkogenní stres (OIS), cytokiny, reaktivní kyslíkové radikály, genotoxický stres, metabolický šok, …  fyziologická senescence • embryogeneze • remodelace tkání • hojení ran  terapií indukovaná senescence (TIS) Buněčná senescence • ireverzibilní, nevratná ztráta možnosti buněčného dělení • senescentní buňky se ale liší od jiných nedělících se buněk, například quiescentních nebo terminálně diferencovaných, mají své specifické znaky : • exprimují proteiny, které navozují senescentní fenotyp a blokují buněčné dělení (p16) • produkují a secernují látky, které stimulují zánětlivou reakci; intenzita a sestava těchto faktorů je pro senescentní buňky tak charakteristická, že se označuje jako SASP - sekreční fenotyp spojený se senescencí („senescence-associated secretory phenotype“) Buněčná senescence Calcinotto et al, Physiol Rev 99 (2019) 1047-1078  buněčná senescence může být indukovaná oxidativním stresem, poškozením DNA nebo telomer  senescentní buňky mají permanentní blok buněčného dělení, zvýšenou expresi inhibitorů buněčného cyklu a změněné buněčné struktury a expresi proteinů  senescence může být autokrinně posilována a může se parakrinně šířit na sousední buňky prostřednictvím SASP a SMS (senescence-messaging secretome) Úkoly buněčné senescence - SASP SASP:  stimulace imunitního systému ( odklízení)  udržování integrity tkání (např. přepnutí fibronektického do fibrolytického režimu (ochrana proti fibróze)  bariéra proti vzniku iPSC  pomáhá udržovat SC niche  stimulace vývoje nádorů!! SASP stimuluje: • vaskularizaci • EMT • invazivitu • buněčnou plasticitu Senescence a stárnutí organismu  Účelem senescence je předejít množení poškozených buněk a indukovat jejich odstranění imunitním systémem. Senescence je tak užitečnou kompenzační odpovědí, která pomáhá tkáním zbavit se poškozených a potenciálně onkogenních buněk. Tento kontrolní mechanismus ale vyžaduje efektivní nahrazování buněk, které je podmíněno odstraněním senescentních buněk a mobilizací progenitorů, které zajistí znovunastavení počtu buněk.  To zajištěno završením celé sekvence událostí: „senescence- odklizení-regenerace“. „Životní cyklus“ senescence Chan a Narita, Genes Develop 33 (2019) 127-143 Senescence a stárnutí organismu  S přibývajícím věkem roste pravděpodobnost, že řetězec „senescence-odklizení-regenerace“ nebude efektivně dokončen a bude docházet k akumulaci senescentních buněk. Ty pak mohou zhoršovat poškození a tím přispívat ke stárnutí organismu namísto toho, aby pomáhaly stárnutí předcházet ( SASP).  Proč přírodní selekce, která optimalizuje přežívání a reprodukční úspěch, umožnila přenos senescence na potomky??  Jako výsledek této duality je senescence považována za příklad tzv. antagonistické pleiotropie.  Podle hypotézy antagonistické pleiotropie mohou geny nebo procesy, které se vyvinuly, protože podporují zdraví nebo zdatnost mladého organismu, mít zhoubný efekt u staršího organismu, a tak přispívat ke stárnutí. Někdy se senescence označuje jako antagonistický znak stárnutí. Telomerová hypotéza: smrtelné (somatické) buňky Harley CB, Oncogene 21 (2002) 495-502 Buňky s aktivní telomerázou • zárodečné buňky • kmenové buňky • některé somatické buňky za určitých fyziologických podmínek: - buňky endometria ve vztahu k proliferaci během menstruačního cyklu - mitogenně stimulované lymfocyty - buňky v proliferativní zóně střevních krypt - buňky proliferativní bazální vrstvy kůže - buňky lobulárního endotelia prsu během těhotenství • nádorové buňky: 85-90% všech nádorových buněk má aktivní telomerázu! Oblasti aktivní telomerázy Telomerová hypotéza: nesmrtelné buňky Harley CB, Oncogene 21 (2002) 495-502 Telomery • Telomery jsou tvořeny DNA a proteiny. DNA: • tandemové sekvence (TTAGGG)n (Moyzis 1988) • při každé replikaci dochází ke zkrácení telomery v důsledku problému neúplné replikace chromozomů (při každém dělení asi o 50 až 200 pb) • podstatná část telomer (až 15 kb) je tvořena dvouřetězcovou DNA, samotný konec telomer tvoří 3´-vlákno DNA, bohaté na G, zakončené často 2 až 4 G („G-přesah“): konec telomery musí tvořit správnou strukturu tak, aby nebyl zaměněn za dvouřetězcové zlomy DNA!! 3´-jednovláknový konec telomery: G-bohaté vlákno telomerické DNA přesahuje C-bohaté vlákno a tak je vytvořen tzv. 3´přesah/G-přesah. Ten je dlouhý několik set nukleotidů (délka dvouřetězcového úseku telomery je asi 5 až 10 kb). Struktura konce telomery 3´-jednovláknový konec telomery se balí dovnitř, hybridizuje v dvouřetězcové oblasti s příslušnou sekvencí, ze které vytlačuje původní vlákno a to tvoří D-smyčku; dvouřetězcová část konce telomery tvoří strukturu T-smyčky; struktura je stabilizována vazbou specifických proteinů Struktura konce telomery Mathon NF, Lloyd AC, Nat Rev Cancer 1 (2001) 203-213 Struktura konce telomery 3´přesah: • po „zanoření“ do dvouvláknové struktury nevyvolává odpověď/signál jako jednořetězcový zlom DNA Proteinový komplex • tzv. shelterin (telosom); 6 proteinů: TRF1, TRF2, RAP1, TIN2, TPP1, Pot1 • váže se v mnoha kopiích (100 – 1000) na telomerové „repeaty“ • funkce: ochrana chromozomů a regulace délky telomer Nukleosomy • s modifikacemi histonů typickými pro heterochromatin Proteiny shelterinu TRF1 a TRF2 („telomere repeat factor“) • první identifikované faktory vázající se na telomery • podílejí se na tvorbě správné struktury telomer • váže se na dvouřetězcovou část telomer • funguje jako represor telomerázy (overexprese TRF1 vede ke zkracování telomer i v přítomnosti aktivní telomerázy) • Kooperace TRF1 a 2 podobná spolupráci dvou rukou při zavazování tkaniček: TRF1 tvoří smyčku a TRF2 ji utahuje a zabezpečuje. TIN2 interaguje s TRF1 a 2 (jeho identifikace vedla ke konceptu multiproteinových komplexů na telomerách, kdy je obtížné určit efekt jediného proteinu bez souvislosti s ostatními proteiny komplexu) Pot1 • („protection of telomeres“) se váže na G-přesah (ssDNA) a tím chrání konce telomer; chrání telomery před ATM- a ATR-dependentní reakcí na poškození DNA Tankyráza • interaguje s TRF1, ale má i další „netelomerické“ funkce • může ADP-ribozylovat TRF1; TRF1 je po ADP-ribozylaci rychle ubikvitinován a degradován • především cytoplasmatický protein, který se do jádra dostává prostřednictvím interakce s TRF1 během S fáze buněčného cyklu Na telomerách se vyskytují také proteiny, které se účastní oprav a rekombinace DNA: Rad50, Rad51, Rad52, Ku70/Ku86, NBS1, MRE11 a další. Proteiny shelterinu Struktura telomer Telomery • Blok buněčného cyklu je ve stárnoucích buňkách udržován signalizací přes proteiny p53/p21 a p16/RB. • Telomera zkrácená na kritickou délku je signálem k aktivaci signálních drah, které vedou k bloku buněčného cyklu: – signalizuje nejkratší telomera – telomeráza má afinitu k nejkratší telomeře signalizace se účastní např. Ku (účast v NHEJ), RAD50/MRE11/NBS1, ATM Telomeráza: podjednotka hTR • složena ze dvou podjednotek: hTERT a hTR hTR: RNA podjednotka, která slouží jako templát pro syntézu telomerových sekvencí • je 451 nt dlouhá, bez polyadenylace • templátová oblast je tvořena 11 nt sekvencí 5´-CUAACCCUAAC-3´ (1 kompletní a 1 částečná sekvence telomerového „repeatu“) • gen je lokalizován v oblasti 3q26.3 • v promotoru CpG ostrůvky (u ALT+ buněk metylován) Mathon NF and Lloyd AC, Nat Rev Cancer 1 (2001) 203-213 Telomeráza: podjednotka hTR • Na řízení transkripce se podílejí: Nf-Y (esenciální), Sp1 a RB (aktivátory), Sp3 (represor). • Dyskerin* - protein, který interaguje s hTR a je nutný pro správné fungování telomerázy. * Nepřítomnost nebo poškození dyskerinu je jednou z příčin vzácného vrozeného onemocnění Dyskeratosis congenita: křehké kosti, nepřítomnost vlasů, progresivní dystrofie nehtů, nedostatečně vyvinuté genitálie, abnormality trávicího traktu, plicní fibróza, imunitní dysfunkce a zvýšené riziko nádorů kůže. Telomeráza: podjednotka hTERT hTERT: katalytická podjednotka s aktivitou reverzní transkriptázy • 127kDa protein, 1132 AA, limitující součást telomerázy: aktivita  exprese (hTERT) telomerázy • gen je lokalizován v oblasti 5p15.33* • promotor může být metylován • řízení transkripce se účastní: c-Myc, Sp1 a estrogen (pozitivní regulace), MZF-2 a Mad (negativní regulace); nepřímo se účastní také IFN- (přes downregulaci c-Myc) a p53 (inhibuje vyvázáním faktoru Sp1) • holoenzym telomeráza potřebuje ke správnému sbalení in vivo chaperony: p23, hsp90 * Model „telomere position effect“ • gen pro hTERT lokalizován v pozici 5p15.33 – jeden z nejdistálněji lokalizovaných genů na chromozomu 5 (pouze několik set kb od telomer) - proto otázka, zda exprese hTERT není regulována mechanismem „telomere position effect“ (TPE) • jak buňky stárnou a telomery se zkracují, může docházet k derepresi genů v blízkosti telomer nebo naopak k reaktivaci původně utlumených genů Shay JW and Wright WE, Carcinogenesis 26 (2005) 867-874 „Telomere position effect“ (TPE) • vliv (silent) konformace telomerového chromatinu na expresi genů lokalizovaných v těsné blízkosti telomer (okolo 1 Mb)  Telomere position effect over long distances (TPE-OLD) - vliv konformace telomerového chromatinu na expresi genů lokalizovaných až ve vzdálenosti 10 Mb  možná i regulace transkripce v závislosti na délce telomer některých genů po celém genomu Mechanismus fungování telomerázy vazba telomery  elongace  translokace   disociace Harley CB, Oncogene 21 (2002) 495-502 Nádory, telomery a aktivní telomeráza • 85 až 90% nádorů má aktivní telomerázu • k aktivaci telomerázy dochází v pozdních stadiích kancerogeneze • ektopická exprese telomerázy nemá transformační účinek Ektopická exprese telomerázy nemá transformační účinek Harley CB, Oncogene 21 (2002) 495-502 Zkracování telomer brání vzniku nádorů • Zkracování telomer v buňkách bez aktivní telomerázy suprimuje tvorbu nádorů tím, že limituje, kolikrát se buňka může rozdělit; omezením replikační kapacity snižuje šanci na „úspěšnou, dokonanou kancerogenezi“. Je těžké určit, kolikrát se buňka musí být schopná rozdělit, aby měla dostatečnou kapacitu k vývoji nádoru! • Stabilizace telomer je nutnou podmínkou vývoje nádoru. • Telomery nádorových buněk jsou často kratší než telomery ostatních buněk ( ke stabilizaci telomer dochází až v některé pokročilejší fázi vývoje nádoru).  Např. myš „knock-out“pouze v Cdkn2a (p16, Arf) má vyšší výskyt nádorů a v mladším věku než myš knock-out v Cdkn2a a s krátkými telomerami (podobně myš ApcMin - pouze adenomy). Brání zkracování telomer vzniku nádorů? 1. nádory jsou klonální, vznikají z jediné buňky 2. 1 cm3 tkáně obsahuje asi 109 buněk 3. průměrný život ohrožující nádor je velký asi 10 cm3, tj. asi 1012 buněk  tj. 40 cyklů exponenciálního růstu a dělení, tedy 40 generací buněk in vitro je možných 50-60 cyklů, to by vyšlo!! Weinberg RA: The Biology of Cancer. GS, 2007 Tak brání zkracování telomer vzniku nádorů nebo ne? realita vypadá takto  v mnohobuněčném organismu existují ochranné bariéry a mnoho buněk zemře (nedostatek růstových faktorů, kyslíku, přítomnost odpadů, atd.) reálně je třeba mnohem více buněk, aby uspěly ve snaze vytvořit nádor  toto je ideální představa Weinberg RA: The Biology of Cancer. GS, 2007 Možné dopady zkracování telomer Shay JW, Clin Cancer Res 9 (2003) 3521-3525 Důsledky kritického zkrácení telomer Zkracování telomer přispívá vzniku nádorů • Zkracování telomer zvyšuje genetickou nestabilitu, a tím přispívá k tvorbě nádorů. • Typickým projevem kriticky zkrácených telomer je vznik „end-to-end“ fúzí a tvorba multicentrických chromozomů, které se potom lámou během mitózy (Barbara McClintock, 1941!). Zkracování telomer přispívá ke vzniku nádorů zvýšením genetické nestability Chromotripse • Jeden, případně dva chromozomy „explodují“ a rozpadnou se na bezpočet malých kousků; následně jsou znovu složeny, ale některé kousky chybějí, některé jsou špatně uspořádány. Chromotripse • jednou z příčin chromotripse může být pravděpodobně mutace TP53: mohlo by to souviset s nesprávnou funkcí telomer: chromozomy jsou do sebe „zaklesnuté“ a během mitózy jsou roztrženy jako korálky • při snaze opravit chromozomy chybí díky mutaci TP53 patřičná kontrola • při známkách chromotripse je třeba hledat vrozenou mutaci TP53 • odhaduje se, že asi 2 až 3% případů rakoviny je vyvoláno chromotripsí Chromotripse a neuroblastomy • celogenomovým sekvenováním studováno 87 primárních neuroblastomů (a lymfocytů – jako negativních kontrol) • 18% neuroblastomů (10/55) vysokého stadia (3 a 4) mělo lokální poškození chromozomů – chromotrypsi; ani jeden případ stadia 1 a 2 • u dvou případů nalezena mutace postihující geny typu FAN (FANCM a FAN1) Molenaar J.J. et al.: Nature 483 (2012) 589-593 Dvojí role telomerázy a telomerové dysfunkce v genetické nestabilitě a růstu nádoru Hackett and Greide CW, Oncogene 21 (2002) 619-626 Telomerová rovnováha Mathon NF and Lloyd AC, Nat Rev Cancer 1 (2001) 203-213 Zkracování telomer může procesu kancerogeneze jak přispívat, tak jej brzdit – zdá se, že úloha zkracování telomer je v procesu kancerogeneze vybalancována. Telomery a telomeráza v různých stadiích kancerogeneze Buňky bez aktivní telomerázy:  zkracování telomer buď navodí genetickou nestabilitu nebo inhibuje růst nádoru senescencí a/nebo apoptózou  aktivace telomerázy může v další fázi omezit genetickou nestabilitu a umožnit růst nádoru  spojení buněk s aktivní telomerázou s pozdějšími agresivnějšími stadii může souviset se selekcí výrazně proliferujících buněk (klonální expanze) Model úlohy telomer a telomerázy ve vývoji nádoru Hackett and Greide CW, Oncogene 21 (2002) 619-626 Regulace telomerázy během kancerogeneze Mathon NF and Lloyd AC, Nat Rev Cancer 1 (2001) 203-213 Buňky s aktivní telomerázou: • vypnutí telomerázy může být jedním mechanismem, jak indukovat genetickou nestabilitu • alternativní ochranou buňky proti kancerogenezi může být předčasná senescence nebo apoptóza navozená např. aktivovanými onkogeny Dvojí role senescence při vývoji nádorů  Na jedné straně senescence funguje jako proces, který suprimuje vývoj nádorů. Prostřednictvím SASP indukuje parakrinně senescenci v sousedních (nádorových i nenádorových) buňkách. Stimuluje buňky imunitního systému k odklízení senescentních i proliferujících nádorových buněk.  Na druhé straně, prostřednictvím SASP stimuluje progresi nádorů stimulací proliferace, angiogeneze,.. Chan a Narita, Genes Develop 33 (2019) 127-143 Telomery a telomeráza v různých stadiích kancerogeneze Komparativní analýza premaligních a maligních ložisek v lidském prsu: Premaligní léze: • neexprimovaly aktivní telomerázu • telomery se zkracovaly • vykazovaly neklonální chromozomální aberace Karcinomy: • aktivní telomeráza • stabilní délka telomer • stabilní aberantní karyotyp (pravděpodobně klonální selekce) Hanahan D, Nature 406 (2000) 573-574 Souvislosti: funkce p53 a délka telomer • kancerogeneze je provázena akumulací chyb v genomu v důsledku zvýšené genetické nestability (1) práh přežití: po jeho překročení nejsou buňky životaschopné (2) práh kancerogeneze: po jeho překročení se nádory vyvíjejí expanzivně • „úspěšné“ nádory: telomeráza je „aktivována“ zhruba ve fázi dosažení (2), což stabilizuje telomery a umožní expanzivní proliferaci nádorových buněk Hanahan D, Nature 406 (2000) 573-574 Souvislosti: funkce p53, délka telomer, typ nádoru? • myši s delecí TP53 rychle vyvíjejí sarkomy a lymfomy, jen vzácně epiteliální nádory (karcinomy) • asi 90% lidských nádorů jsou karcinomy a velmi často postrádají funkci p53 • myši mají mnohem delší telomery než člověk • k dosažení „human-like“ délky telomer je nutná inaktivace telomerázy a následně šest generací myší • myši s krátkými telomerami, neaktivní telomerázou a heterozygotní p53+/-: s věkem asi polovina myší vyvinula sarkom nebo lymfom, ale polovina vyvinula epiteliální nádor! Frias C et al, Front Bioscience 17 (2012) 2181-2196 Souvislosti: funkce p53, délka telomer, kancerogeneze • CIN související s krátkými telomerami pohání epiteliální karcinogenezi, pokud selžou odpovídající kontrolní body: • myší buňky jsou v tomto závislé na funkci p53 • u lidských buněk musí být inaktivovány jak dráha p53, tak RB Klinické využití poznatků o telomeráze Asi 85 až 90% nádorů má aktivní telomerázu  klinické využití? Aktivní telomerázou se buňky nádorové liší od většiny somatických buněk  využití v diagnostice: Inaktivace telomerázy může omezit růst nádorových buněk, zatímco většina „normálních“ buněk telomerázu nepotřebuje  využití pro terapii: Využití telomer v diagnostice TRAP assay • využívá PCR k amplifikaci produktů prodlužování telomerázou • velmi citlivá: detekuje 0.01% pozitivních buněk • tam kde tkáň/histologické prostředí nádoru přirozeně obsahuje aktivní telomerázu (střevní epitel) se za pozitivní považuje pouze hladina telomerázy vyšší než u odpovídající kontrolní tkáně Využití telomer v diagnostice Granger MP et al, Crit Rev Oncol Hematol 41 (2002) 29-40 Využití telomer v diagnostice U některých dětských nádorů může aktivita telomerázy sloužit jako prognostický marker. Z Kaplan-Meierových křivek přežití vyplývá, že např. u neuroblastomů (A) nebo Ewingova sarkomu (B) je aktivní telomeráza výrazně negativním prognostickým faktorem. Weinberg RA: The Biology of Cancer. GS, 2007 Aktivní telomeráza a neuroblastomy Neuroblastomy dětí (nádory periferních nervů) mají obecně velmi variabilní výhled vývoje: některé spontánně regredují, zatímco jiné jsou agresivní, metastazující… fatální. Špatná prognóza silně souvisí s amplifikací genu N-myc. Špatná prognóza silně souvisí s aktivní telomerázou. Podle některých patologů jsou neuroblastomy u dětí velmi běžné, ale většina spontánně eroduje a zanikne ( nemají aktivní telomerázu a tak buňky progredují do senescence/krize a spontánně zaniknou). Telomeráza jako terapeutický cíl • inhibice telomerázy v kultivovaných nádorových buňkách indukuje krizi a apoptózu  inhibitory telomerázy jsou potenciálně účinné protinádorové látky ? kmenové a další buňky s fyziologicky aktivní telomerázou ? - mají delší telomery než nádorové buňky - dělí se pomaleji než nádorové buňky, tj. zkracují se jim telomery pomaleji než nádorovým buňkám  dostatečné terapeutické okno • např. antisense oligonukleotidy komplementární k hTR (stabilizované /proti působení nukleáz/ chemickými modifikacemi např. 2´-0-methyl RNA) • přenosem dominantně negativního genu hTERT • použitím inhibitorů reverzní transkriptázy, např. AZT (používaných při léčbě HIV; zidovudine, BIBR1532, GRN163L,…) Telomeráza jako terapeutický cíl • díky komplexitě telomerázového kemplexu mohou některá terapeutika mířit i na další proteinové složky • vedle množství aktivní telomerázy ještě mnoho dalších faktorů rozhoduje o efektivitě, s jakou je telomeráza přiváděna k telomerám Tankyráza • může ADP-ribozylovat TRF1; TRF1 je po ADP-ribozylaci rychle ubikvitinován a degradován  vytváří se otevřenější konfigurace proteinového komplexu na telomeře a zpřístupňuje se G-přesah pro telomerázu Tankyráza a přístup telomerázy k telomerám Shay JW and Wright WE, Cancer Cell 7 (2005) 1-2 Tankyráza jako cíl terapie • vysoká exprese tankyrázy vede k prodlužování telomer u buněk exprimujících aktivní telomerázu • výrazně snížená aktivita telomerázy (o 80%) může zajistit stabilizaci telomer  kombinace inhibitorů telomerázy a tankyrázy je velmi účinná a umožňuje vyhnout se toxickým dávkám pouze jednoho nebo druhého inhibitoru Alternativní způsob prodlužování telomer Aktivní telomeráza detekována “jen“ u 85-90% nádorových buněk - co těch zbylých 10 až 15%? ALT - „Alternative Telomere Lengthening“ – výměnou telomerické DNA mezi chromozomy • založen na rekombinaci DNA • ALT je spojen s velice heterogenní délkou telomer • mechanismy ALT a telomeráza koexistují v buňce vedle sebe, aktivní telomeráza (exprese telomerázy) zřejmě reprimuje mechanismy ALT (nezdá se ale, že by tím represorem byla přímo telomeráza) Alternativní způsob prodlužování telomer u kvasinek Popsány dva typy prodlužování telomer: • I. Rekombinací subtelomerických Y´elementů, kdy G-konec zůstává krátký. Spojeno s požadavkem na funkční RAD51. To vede k tvorbě velice dlouhých telomer, které mohou být příčinou růstové nevýhody takových buněk.  Mohou konvertovat na typ II. • II. Rekombinací G-bohatých konců telomer. Spojeno s požadavkem na funkční RAD50.  Telomery v nepřítomnosti telomerázy mohou být substrátem pro různé typy rekombinací. Modely ALT Navrženy 4 modely udržování délky telomer rekombinací: • replikace indukovaná zlomy (BIR) • integrace extrachromozomální DNA • replikace otáčivou kružnicí • elongace t-smyčky  genetické změny, které potencují rekombinaci (např. defekty v MMR), potencují také prodlužování délky telomer mechanismy ALT Prodlužování telomer rekombinací Důkaz o rekombinaci jako mechanismu ALT: do jedné telomery jednoho chromozomu byla vložena specifická značka detekovatelná fluorescenční sondou. Po opakovaných děleních byla značka detekována v pěti různých chromozomech. Weinberg RA: The Biology of Cancer. GS, 2007 Telomery a stárnutí Délku telomer (a možnost předčasného úmrtí) negativně ovlivňuje: • kouření • obezita • dlouhodobý stres • socioekonomický status Krátké telomery disponují k: • demenci • poškození kognitivních schopností Wernerův syndrom • předčasné stárnutí včetně vaskulárních nemocí, diabetes mellitus, katarakta (šedý oční zákal), atrofie kůže, šedivé vlasy, nádory, průměrná délka života 47 let Trisomie 21 – Downův syndrom • zrychlené stárnutí • délka telomer lymfocytů se zkracuje 3x rychleji než u zdravých jedinců Hutchison-Gilford progeria Telomery - stárnutí - nádory Hutchison-Gilford progeria • zrychlené stárnutí již od 2 let; kratší postava, abnormální držení těla, typický fenotyp stárnutí: holohlavost, ztuhlost kloubů, atrofická a vrásčitá kůže, ateroskleróza, stav cév – angina pectoris, infarkt myokardu… • fibroblasty těchto pacientů mají kratší telomery než fibroblasty kontrol, vstupují do fáze senescence rychleji; po transfekci genu hTERT se stávají nesmrtelnými • V roce 2003 byly jako příčina zjištěny mutace genu pro protein jaderných filament lamin A (LMNA). Důsledkem je porucha prekurzorového štěpení prelaminu A se vznikem patologického progerinu a s následnou poruchou jaderného obalu, nukleoskeletu a chromosomální architektury. Telomery - stárnutí - nádory Syndromy charakteristické mutacemi v telomerových genech a v důsledku toho zrychleným zkracováním telomer: • Dyskeratosis congenita. Mutace buď přímo v TERT nebo TERC ( telomeráza), nebo v DKC1 ( interagující protein související se stabilitou telomerázy): malá postava, hypogonadismus, infertilita, defekty kůže a hematopoietického systému, selhání kostní dřeně, předčasná smrt, zvýšená genetická nestabilita, zvýšená incidence nádorů; anticipace onemocnění • Aplastická anemie: mutace TERC a TERT: předčasná smrt • Idiopatická pulmonární fibrosa: respirační selhávání Telomery - stárnutí - nádory