Molekulární a buněčná biologie nádorů Prof. RNDr. Jana Šmardová, CSc. Ústav experimentální biologie Přírodovědecká fakulta MU Brno 2020 Bi9910 středa 14.00 – 16.00 A11 – č. 306 9. Nádorová angiogeneze Molekulární a buněčná biologie nádorů 2020 Nádorová angiogeneze, neovaskularizace  Schopnost nádoru indukovat proliferaci nových krevních vlásečnic.  Má vliv na růst primárního nádoru, schopnost tvořit metastázy a na růst sekundárního nádoru ( pro tvorbu metastáz má angiogeneze význam 2x!!).  Nádor bez angiogeneze doroste maximálně do několika miliónů buněk (100 až 200m je difúzní limit pro kyslík), tj. do velikosti několika kubických milimetrů - nedoroste do klinicky detekovatelné velikosti - tím je schopnost tvořit metastázy omezena (nikoli vyloučena! - dormantní mikrometastázy - např. nádoru prsu do plic). Historický pohled na angiogenezi nádorů • 1865 – histopatologický důkaz, že nádory jsou zásobeny proměněnou, nově vytvořenou vaskulaturou… • 1. Nejsou to nové vlásečnice, ale využité stávající. • 2. Jsou to nové vlásečnice a jsou výrazem boje organismu s nádorem. • 3. 1971 (Judah Folkman) - pokus: prevence neovaskularizace  restrikce růstu nádoru  nádory jsou dependentní na angiogenezi. • Bez angiogeneze roste nádor pomalu a lineárně, po neovaskularizaci rychle a exponenciálně: krevní vlásečnice přivádějí nejenom živiny a kyslík (a odvádějí odpady), ale také růstové faktory. Pomalost a malá velikost nádoru před angiogenezí není dána jen pomalou proliferací, ale i tím, že je vyrovnaná rychlost proliferace a odumírání buněk. • Angiogeneze je nutná pro maligní fenotyp nádoru, ale není dostatečná - tj. i benigní nádory mohou být angiogenní. Nádorová angiogeneze, neovaskularizace Souvislost angiogeneze a metastázování S neovaskularizací se zvyšuje šance na infiltraci nádoru (buňky mají kudy infiltrovat) a navíc už mohou mít angiogenní potenciál, což zvyšuje jejich šanci na uchycení a vytvoření sekundárního nádoru. Průběh neovaskularizace Vaskulogeneze - endoteliální buňky de novo diferencují z mezodermálních progenitorů (angioblastů a hemangioblastů) a proliferují in situ v původně avaskulární tkáni. Proces je nezávislý na stávajících cévách. Uplatňuje se zejména při tvorbě primitivních embryonálních cév. Angiogeneze - následuje vaskulogenezi, uplatňuje se v embryogenezi, hojení ran, ovulaci,.. Remodelace a větvení - modifikace iniciální sítě větvením do avaskulární tkáně a zvětšováním kapilár, vznik složité rozvětvené sítě charakteristické pro zralou vaskulaturu. Zároveň dozrávají také stěny vlásečnic, jak se zpevňují interakce mezi endoteliálními a podpůrnými (hladké svalstvo) buňkami. • neovaskularizace: vaskulogeneze (vznik de novo z progenitorů) a angiogeneze (vývoj vycházející ze stávající vaskulatury) • nádorová angiogeneze: schopnost nádoru indukovat proliferaci nových krevních vlásečnic Nádorová angiogeneze, neovaskularizace vaskulogeneze angiogeneze vaskulogeneze a angiogeneze Průběh neovaskularizace • U dospělého jedince se uplatňuje převážně angiogeneze. Vaskulatura je velmi „klidová“ tkáň (s výjimkou např. přísně řízeného reprodukčního cyklu u žen: ovulace, menstruace, implantace, těhotenství) - endoteliální buňky patří k nejdéle žijícím buňkám (mimo CNS) v těle (v aktivní fázi buněčného cyklu je asi 1 z 10.000 endoteliálních buněk - 0.01%). • Při působení odpovídajících (růstových) faktorů mohou klidové vaskulární buňky přejít z klidového stádia a začít invadovat okolní tkáně. Model průběhu nádorové neovaskularizace Iniciace začíná uvolňováním angiogenních stimulátorů nádorovými buňkami. Tyto faktory stimulují proliferaci a invazivní chování vaskulárních buněk. Invaze/proliferace: Vaskulární buňky sekretují proteolytické enzymy a zároveň proteiny ECM. Dochází k remodelaci ECM, tvoří se prostor pro nové cévy. Maturace/diferenciace: Vznikající céva produkuje komponenty bazální membrány, které udržují endoteliální b. v klidovém stavu. Nové výběžky fúzují a nový cévní systém se uzavírá. Nádorová vaskulatura je funkčně i strukturně abnormální  normální vaskulatura, ve které jsou perfektně vybalancovány pro- a anti-angiogenní faktory, je tvořena zralými cévami, které jsou hierarchicky uspořádány: cévy – kapiláry – mikrovlásečnice - …  abnormální nádorová vaskulatura typicky postrádá hierarchické uspořádání, je tvořena nezralými diferencovanými i nediferencovanými cévami se zvýšenou propustností , kapiláry se nepravidelně kroutí, jsou roztažené, s nepravidelným průměrem (chybějícím nebo poškozeným lumen), s nadměrným větvením, přerušované, nezralé, bez souvislé bazální membrány, téměř bez podpůrných buněk pericytů,.…  to může vznikat v důsledku nerovnoměrného uvolňování angiogenních regulátorů    nerovnovážně vysoká hladina VEGF oproti dalším faktorům ( původní označení VPF!!) Nádorová vaskulatura je funkčně i strukturně abnormální Pericyty • specializované buňky mesenchymálního původu, příbuzné buňkám hladkého svalstva • těsně přiléhají na vnější stranu endoteliálních buněk, které tvoří základní strukturu cév • podporují endoteliální buňky mechanicky i fyziologicky: poskytují parakrinní stimulaci (např. uvolňují Ang-1; podílejí se – s endoteliálními b. – na tvorbě cévní bazální membrány) • mělo se za to, že zcela chybí v nádorové vaskulatuře; jejich přítomnost ale byla prokázána, i když ve značně nižší úrovni, jsou pro funkční vaskulaturu nezbytné • exprimují na svém povrchu receptory pro PDGF: farmakologická inhibice tohoto receptoru vede ke snížení hladiny pericytů, což nádorovou (nikoli nenádorovou!!) vaskulaturu destabilizuje Struktura nádorové vaskulatury struktura krevní kapiláry v kolorektálním karcinomu: umístění nádorové buňky (zelená fluorescence) uvnitř krevní kapiláry (endoteliální buňky červená fluorescence) tzv. mozaikovitá struktura Carmeliet P and Jain RK, Nature 407 (2000) 249-257 Struktura nádorové vaskulatury kvantifikace mozaikovité struktury vlásečnic u kolorektálního karcinomu: - asi 15% vlásečnic je mozaikovitých - nádorové buňky zaujímají asi 4% povrchu vlásečnic Carmeliet P and Jain RK, Nature 407 (2000) 249-257 Struktura nádorové vaskulatury • abnormální endoteliální buňky umístěné v lumen krevních vlásečnic • násobné intercelulární otvory Carmeliet P and Jain RK, Nature 407 (2000) 249-257  Tok krve je chaotický a velice různý v různých částech systému. Proto vznikají v nádoru místa s hypoxií a nadměrnou kyselostí.  Tato okolnost může ovlivňovat efekt terapie; vytváří se prostor, ve kterém může např. dojít k selekci a klonální expanzi buněk, které neodpovídají na hypoxii apoptózou, ..  Tato okolnost ovlivňuje další vývoj nádoru... Nádorová vaskulatura je funkčně i strukturně abnormální Buněčné mechanismy neovaskularizace nádorů Hostitelská síť prorůstá do nádoru. Lymfatické vlásečnice kolem nádoru „omývají“ nádor, jsou příležitostí pro metastázování, přinášejí růstové faktory…. Nádorové vlásečnice expandují a prorůstají až do stávajících vlásečnic. Endoteliální prekurzory z kostní dřeně a periferní krve pronikají do nádoru a začínají vaskulogenezi. Carmeliet P and Jain RK, Nature 407 (2000) 249-257 Kdo se podílí na neovaskularizaci? Které buňky? • Nádorové buňky • Endoteliální buňky • Stromální buňky • Krevní buňky • Extracelulární matrix Jejich podíl je různý u různých typů nádorů a mění se i během vývoje nádoru. Při nádorové neovaskularizaci kooperují různé buňky * * * Nádor je komplexní tkáň Kdo se podílí na neovaskularizaci? Které faktory? Specifické: • VEGF a receptory VEGFR • Angiopoietiny a receptory Tie • Ephriny a receptory EphB Nespecifické: • růstové faktory, které nejsou specifické pro endoteliální buňky (PDGF, FGF, TGF). • další proteiny různých signálních drah VEGFs a receptory VEGFR • VEGF byl první charakterizovaný faktor specifický pro vaskularizaci vaskulární endoteliální růstový faktor (původní název - vaskulární permeabilní faktor - VPF ) • kritický pro iniciaci vaskulogeneze i pro angiogenní větvení • popsáno 6 různých VEGF faktorů a 4 různé receptory • patří do rodiny PDGF Yancopoulos GD et al, Nature 407 (2000) 242-248 VEGFs a receptory VEGFR • Všechny faktory mají podobnou strukturu a překrývající se specificitu - všechny jsou schopny interagovat s receptory a indukovat je. Jsou označeny jako VEGF-A až E a dále byl rozpoznán jako příbuzný faktor PLGF („placental growth factor“). • tyrozin protein kinázové receptory VEGFR-1 (Flt-1), VEGFR-2 (KDR, Flk-1) a VEGFR-3 (Flt-4) zprostředkovávají signalizaci faktory VEGF VEGFR-2 zprostředkovává hlavní signalizace týkající se růstu a permeability cév VEGFR-1 stimuluje změny v ECM (mohl by mít i negativní roli (možná funguje jako „decoy“ a suprimuje tak funkci VEGFR-2) VEGFR-3 je specifický pro lymfatické tkáně VEGFs a receptory VEGFR • VEGF je tak potentní a kritický vaskulární regulátor, že jeho hladina musí být perfektně regulována (exprese stimulována hypoxií a signalizací onkogeny; VEGFs mohou být zadržovány v ECM v latentní formě a aktivovány a uvolněny proteázami ECM) • poškození i jediné alely VEGF je u myši letální během embryonálního vývoje; naopak zřejmě postradatelný v dospělosti • nadměrná exprese VEGF (nebo samotné podání VEGF) v dospělých tkáních vede k tvorbě propustných vlásečnic, které vedou ke krvácení, a to vyvolává zánětlivou reakci a otoky (vaskulární permeabilní faktor) Angiopoietiny a receptory Tie • Angiopoetiny tvoří nejvýznamnější partnery faktorů VEGF při tvorbě vaskulatury • Angiopoietiny byly popsány jako ligandy tyrozin protein kinázových receptorů Tie, které byly nalezeny jako receptory specificky exprimované v endoteliálních buňkách, podobně jako VEGFRs Angiopoietiny a receptory Tie • popsány alespoň čtyři typy angiopoetinů Ang1 až 4 a dva typy receptorů Tie1 a Tie2 • Ang1 je nezbytný k udržování klidového stádia a stability již zralé vaskulatury • naopak porušení této stability je nezbytné pro reiniciaci přestavby vaskulatury v dospělosti (např. reprodukční systém žen), která je zajištěna působením antagonisty Ang1 - Ang2 Yancopoulos GD et al, Nature 407 (2000) 242-248 Působení angiopoietinu 1 • Ang1 samotný optimalizuje interakci endoteliálních buněk s podpůrnými buňkami, která umožňuje získávání dalších kritických signálů z prostředí • produkován hlavně hladkými svalovými buňkami • transgenní overexprese Ang1 spíše zvyšuje velikost vlásečnic (VEGF jejich počet) • samotné podání Ang1 spíše stabilizuje a chrání dospělou vaskulaturu, činí ji rezistentní k poškození a propustnosti vyvolanými působením VEGF nebo zánětlivou reakcí Působení angiopoietinu 2 • Ang2 byl popsán na základě své homologie s Ang1 a na základě schopnosti interagovat s Tie2 • je produkován endoteliemi • u dospělých je indukována exprese Ang2 v iniciační fázi remodelace vaskulatury; zřejmě destabilizuje a činí více plastickými stávající cévy, které tak připomínají primitivní cévy během vývoje; tato destabilizace je nutná k následné remodelaci Ephriny a receptory EphB • receptory Eph jsou tyrozin protein kinázy, ephriny jsou jejich ligandy • Ephriny - na rozdíl od většiny ligandů - musí být pevně přichyceny k povrchu buňky, aby mohly aktivovat své receptory • ve vývoji vaskulatury se uplatňují především Ephrin-B2 a receptor EphB4 Yancopoulos GD et al, Nature 407 (2000) 242-248 Juxtakrinní signalizace  Ephriny a receptory EphB • Ephriny - na rozdíl od většiny ligandů - musí být pevně přichyceny k povrchu buňky, aby mohly aktivovat své receptory  signální dráha NOTCH • signál začíná interakcí proteinů Notch L a Notch sousedních buněk (např. endoteliální buňka – nádorová buňka – stromální buňka) • signalizace mezi sousedními buňkami: „contact-dependent“ Čtyři typy signalizace Ephrin-B2 a receptor EphB4 • Ephrin-B2 a receptor EphB4 se vyznačují výrazně reciprokou expresí během vývoje vaskulatury Ephrin-B2 označuje endotelium primordiálních tepenných cév a receptor EphB4 označuje primitivní žilné cévy • Ephrin-B2 i v dalším vývoji je exprimován na tepnách, ale také v okolních tkáních obklopujících tepny (hladké svalstvo v okolí tepen), zřejmě zajišťuje vzájemné interakce těchto tkání • i když Ephrin-B2 a EphB4 tvoří „klasickou dvojici“ ligand-receptor jejich vzájemné interakce jsou zřejmě možné pouze na rozhraní arterií a vén ( Ephrin-B2 je pevně přichycen na buněčném povrchu!!) Ephrin-B2 a EphB4 odlišují tepny a žíly vaskulogeneze  angiogeneze  arteriogeneze ??? Yancopoulos GD et al, Cell 93 (1998) 661-664 Úloha VEGF, Ang1 a 2, Ephrinu-B2 a EphB4 při vaskulogenezi a angiogenezi Vaskulogeneze - uplatňuje se VEGF a také od samého začátku Ephrin-B2 a EphB4 rozlišují primitivní tepny a cévy. Na angiogenní remodelaci a zrání se vedle VEGF a EphrinuB2/EphB4 dále podílí Ang1, který následně udržuje zralou vaskulaturu v klidovém stádiu. Pro destabilizaci je nezbytné působení Ang2. Destabilizovaná nebo nezralá vaskulatura prochází buď regresí nebo angiogenním větvením v závislosti na přítomnosti nebo nepřítomnosti VEGF. A Yancopoulos GD et al, Nature 407 (2000) 242-248 Úloha VEGF, Ang1 a 2, Ephrinu-B2 a EphB4 při vaskulogenezi a angiogenezi B Holash J et al, Oncogene 18 (1999) 5356-5362 Úloha VEGF, Ang1 a 2, Ephrinu-B2 a EphB4 při vaskulogenezi a angiogenezi Praktické využití znalostí o nádorové angiogenezi 1. Terapie nádorů Blok aktivity VEGF zatím představuje nejúspěšnější antiangiogenní taktiku při terapii nádorů! • blok angiogeneze • regrese nezralých stádií 2. Diagnostika nádorů Prvním markerem provázejícím nádorovou angiogenezi je zvýšená exprese Ang2. Klinické využití výzkumu neovaskularizace 1. Stimulace angiogeneze při hojení ran, pro „nechirurgické bypasování“ zjizveného srdce, apod. 2. Využití pro diagnózu a prognózu nádorů. 3. Využití pro terapii nádorů. Angiogenní zapnutí • Angiogeneze je nezbytná pro rychlou expanzi nádorových buněk.  Otázky: • Kdy se objevuje během kancerogeneze? • Kolik času je potřeba k navození angiogenního stavu? • Je to postupný proces od neangiogenního k angiogennímu stavu?  Odpověď (na základě několika modelů): • Zapnutí angiogeneze je svébytným, samostatným krokem kancerogeneze a často se odehraje v ranných stádiích vývoje nádoru. Myší bazální keratinocyty byly progresivně transformovány v karcinomy dlaždicobuněčných buněk expresí onkogenu viru HPV16. Zapnutí angiogeneze bylo opět zřetelně patrné jako samostatný krok. Slabá angiogenní aktivita byla pozorovatelná v hyperplastických stádiích (lehce zvýšená hustota kapilár), mohutná angiogeneze se objevila v dysplastickém stádiu. Model angiogenního zapnutí - 1 Hanahan D and Folkman J, Cell 86 (1996) 353-364 Lidský model - duktální karcinom prsu - hustota krevních vlásečnic byla studována imunohistochemicky - barvením buněčných endoteliálních markerů vWF a CD31. • Angiogenní karcinom in situ představoval přechodné a distinktní stádium mezi neangiogenním karcinomem in situ a invazivním karcinem. • Hustota krevních vlásečnic je u invazivního karcinomu prsu prognosticky významná. Model angiogenního zapnutí - 2 Hanahan D and Folkman J, Cell 86 (1996) 353-364 Lidský model - karcinom děložního čípku - hustota krevních vlásečnic byla studována imunohistochemicky - barvením buněčných endoteliálních markerů vWF a CD31. Mírné zvýšení hustoty cév se objevovalo ve stádiu CIN I/II, zatímco ve stádiu CIN III už je mnoho nových cév, což jasně indikuje angiogenní zapnutí - z klidové (quiescentní) stávající vaskulatury k nové vaskularizaci: nové cévy se výrazně objevily těsně pod bazální membránou dysplastického epithelia. Model angiogenního zapnutí - 3 Hanahan D and Folkman J, Cell 86 (1996) 353-364 Zapnutí angiogeneze • Angiogeneze je nezbytná pro rychlou expanzi nádorových buněk. • Zapnutí angiogeneze je svébytným, samostatným krokem kancerogeneze. Zapnutí angiogeneze je do jisté míry rychlý jednorázový krok - „switch“. Podle hypotézy rovnováhy je angiogenní zapnutí regulováno rovnováhou mezi aktivátory a inhibitory angiogeneze: převaha inhibitorů nad aktivátory vypíná angiogenezi, převaha aktivátorů nad inhibitory ji zapíná. Aktivátory angiogeneze • VEGFs a jejich receptory • bazický fibroblastový růstový faktor bFGF (FGF-2) a acidický fibroblastový růstový faktor aFGF (FGF-1); tyrozin kinázové receptory FGFR1-4 jsou obecněji exprimovány než třeba VEGFRs VEGF a bFGF mohou fungovat synergisticky Dnes popsáno více než 20 induktorů angiogeneze, ale zmíněné faktory jsou zvláště často detekovány ve zvýšené hladině u mnoha nádorů. Některé aktivátory jsou zřetelně tkáňově specifické. Aktivátory angiogeneze Jak je indukována exprese aktivátorů angiogeneze?  epigenetické příčiny: • hypoxie • deprivace glukózy, ..  genetické příčiny: • především jasně prokázaná souvislost mezi mutací ras a VEGF. Ras je nezbytný pro udržování správné hladiny VEGF: mutace ras  zvýšení hladiny VEGF Úloha hypoxie v nádorové angiogenezi V „neangiogenním“ nádoru vznikají nepravidelná místa s různou mírou hypoxie (stav snížené hladiny O2): 1. Tlak na selekci klonů s proangiogenním fenotypem. 2. Hypoxie aktivuje transkripční faktory HIFs, které transaktivují angiogenní geny, např. VEGF, PDGF-B, Ang2, a další). Carmeliet P and Jain RK, Nature 407 (2000) 249-257 Transkripční faktor HIF-1 • aktivován jako odpověď na hypoxii ve všech typech tkání/ buněk savčího organismu • heterodimer složen z podjednotek HIF-1α a HIF-1ß  podjednotka HIF-1ß je exprimována konstitutivně  podjednotka HIF-1α regulována kyslíkem: hydroxylace HIF-1α na zbytcích prolinu, následná ligace ubikvitinu a poté degradace proteazomem ← kyslík pochází přímo z molekulárního kyslíku! • při nedostatku kyslíku je hydroxylace inhibována, HIF-1α je translokována do jádra a stabilizována vazbou s HIF-1ß Syndrom von Hippel-Lindau - VHL • autozomálně dominantní onemocnění; spojeno s vysokým rizikem vývoje nádorů v mnoha orgánech, především: • retinální hemangiomy: zpravidla nejčasnější detekce, v průměru kolem 25 let • hemangiomy CNS a páteře: průměrný věk při detekci 30 let • karcinomy ledvin: průměrný věk při diagnóze 37 let, objevují se u 28 - 45% postižených; jsou maligní a mohou metastazovat • feochromocytomy • onemocnění spojeno s vrozenými mutacemi genu VHL, který je lokalizován v oblasti 3p25.5 Historie syndromu von Hippel-Lindau • Eugene von Hippel (1904) popsal rodiny, ve kterých byli postižení s angiomy – nádory krevních vlásečnic v retině • Arvind Lindau (1927) popsal, že tito postižení mají vysoké riziko vývoje nádorů krevních vlásečnic mozku a míchy (hemangioblastomy) • ke spektru nádorů u postižených VHL patří dále: karcinomy renálních buněk, feochromocytomy (nádory dřeně nadledvinek, 20% familiální výskyt), nádory endoteliální výstelky lymfatických uzlin, nádory Langerhansových ostrůvků pankreatu Syndrom von Hippel-Lindau • frekvence výskytu je asi 1:36.000 • penetrance je 80-90% • expresivita je vysoce variabilní - klinická variabilita je přímo znakem VHL; popsány dvě formy VHL: typ 2 VHL („low risk“) je spojen s výskytem feochromocytomů a missense mutacemi (96%); typ 1 VHL („high risk“) spojen spíše s delecemi/inzercemi, nesmyslnými kodóny  vývoj feochromocytomů zřejmě spojen s pouze částečnou ztrátou aktivity pVHL • somatické mutace VHL jsou časté také u sporadických hemangioblastomů a nádorů ledvin; gen může být inaktivován také methylacemi CpG ostrůvků v promotorové oblasti VHL - protein • protein pVHL lokalizován v jádře i v cytoplasmě, převaha proteinu je v cytoplasmě • typicky koimunoprecipituje se specifickou sadou proteinů: interaguje s proteinem elonginem C, ten interaguje dále s elonginem B a proteinem cullin-2 (CUL2) • tento komplex homologní s ubikvitin ligázovým komplexem SCF (Skp1 – Cdc53 – F-box) kvasinek – z této podobnosti se usoudilo na funkci pVHL a celého komplexu: Funkce pVHL pVHL jako součást komplexu s Elonginem B, C a CUL2 rozpoznává cílové proteiny, komplex poté způsobuje jejich ubikvitinaci a následnou degradaci proteazomem Kaelin WG Jr., Nature Rev Cancer 2 (2002) 673-680 Funkce pVHL • hemangiomy a nádory ledvin mají dva společné znaky: 1. vysoká vaskularizace spojená s vysokou hladinou VEGF 2. produkce erythropoietinu (EPO), který způsobuje navýšení počtu červených krvinek - tyto proteiny kódovány geny indukovatelnými hypoxií („hypoxia-inducible genes“) • buňky s nefunkčním pVHL produkují vysoké hladiny mRNA genů indukovatelných hypoxií – bez ohledu na hladiny kyslíku – to je molekulárním markerem inaktivace VHL Funkce pVHL: regulace HIF-1 NTAD, CTAD – transaktivační domény Kaelin WG Jr., Nature Rev Cancer 2 (2002) 673-680 Ubikvitinace a proteasom komplex ubikvitin ligázy (E1, E2 a E3) rozpoznává protein určený k degradaci  označuje ho připojením řetězce ubikvitinů: polyubikvitinuje jej  označený protein je zachycen proteasomem, ubikvitin je odstraněn a protein degradován na oligopeptidy 1. aktivace ubikvitinu enzymem E1; 2. ubikvitin konjugující enzym E2; 3. vazba na substrát (zbytek lysinu) ubikvitin ligázou E3 – ta je specifická, je to klíčový enzym E3: např. SCF, APC/C („anaphase-promoting complex“), MDM2, pVHL Ubikvitin Ubikvitin je relativně malý peptid, složený ze 76 aminokyselinových zbytků. Jeho struktura je téměř úplně konzervovaná mezi eukaryotickými buňkami. HIF-1 a jeho regulace pVHL Při dostatku kyslíku (normoxie) je HIF-1α silně exprimován a téměř okamžitě účinně degradován účinkem pVHL. Prolin hydroxyláza oxiduje až dva zbytky prolinu na molekule HIF-1α na hydroxyprolin. Tyto hydroxyproliny umožňují vazbu pVHL, který spolu s dalšími 2 proteiny ubikvitinuje HIF-1α. Při nedostatku kyslíku (hypoxie) prolin hydroxyláza nedokáže oxidovat proliny, HIF-1α uniká degradaci, tvoří dimer s HIF-1β a transaktivuje své cílové geny (např. VEGF). Aktivace aktivátorů angiogeneze • (Ras, hypoxie)  FGFs a další angiogenní faktory mohou být uloženy (zadržovány) v extracelulární matrix mnoha buněčných typů (včetně endoteliálních buněk) a uvolňovány - aktivovány při proteolytické degradaci ECM. Inhibitory angiogeneze • Thrombospondin-1 (TSP-1): sekretovaný glykoprotein, ve vysoké hladině u normálních buněk, v nízké hladině u mnoha nádorových buněk. (Váže se na transmembránový receptor endoteliálních buněk CD36, který je spojen s intracelulární Srclike tyrozinkinázou.) exprese TSP-1 je regulována p53: inaktivace p53  snížení hladiny TSP-1 • souvislost: Ras (protoonkoprotein) - aktivátory angiogeneze X p53 (nádorový supresor) - inhibitory angiogeneze • Typickým znakem mnoha inhibitorů angiogeneze je, že jsou v buňce nebo v ECM přítomny ve formě neaktivních nebo málo aktivních prekurzorů (fibronectin, plasminogen, platelet factor-4), které mohou být proteolytickým štěpením aktivovány v účinné inhibitory angiogeneze (plasminogen  angiostatin) - rychlý mechanismus, který se pravděpodobně uplatňuje při procesech hojení, ovulace, atd. Podobně platelet factor-4 je slabý inhibitor angiogeneze, ale může z něho být vyštípnut fragment s 50x vyšší inhibiční potencí. Aktivace inhibitorů angiogeneze  Jak aktivátory, tak inhibitory angiogeneze jsou „vždy připraveny“ k činnosti, jen odlišným mechanismem. Inhibitory přímým proteolytickým štěpením, aktivátory uvolněním z vazeb na struktury ECM při degradaci ECM.  Taková regulace aktivátorů a inhibitorů umožňuje zvládnout úkol: na jedné straně udržovat velmi stabilní klidové stádium vaskulatury a na straně druhé rychle reagovat v případě potřeby zapnutím angiogeneze. Aktivace aktivátorů a inhibitorů angiogeneze Hypotéza rovnováhy zapnutí přepnutí angiogeneze Hanahan D and Folkman J, Cell 86 (1996) 353-364 Přehled mediátorů angiogeneze • proangiogenní faktory rodina VEGF, angiopoietiny, HGF, MMP, FGFb, PD-EPDGF, PDGF, EGF, TNF, IL-6, integriny • antiangiogenní faktory trombospondin, endostatin (fragment kolagenu XVIII), tumstatin, kanstatin (fragmenty kolagenu IV), angiostatin, vazostatin, TGFβ, IFNα, IFNβ, TIMPs, PAI, IL-12, IL-18, vasohibin  biologický reostat, který zahrnuje nádorové i nenádorové buňky (někdy více příspěvek aktivace ras, myc, jindy více vliv pericytů, zánětu, ...) Indukce angiogenních faktorů Klener P, Klin onkologie 23 (2010) 14-20 Možnosti inhibice signální dráhy VEGF 1. neutralizace ligandu VEGF humanizovanou monoklonální protilátkou: bevacizumabAvastin, ... 3. inhibitory tyrozin protein kinázové domény receptorů: sunitinib, sorafenib, nintedanib, pazopanib, regorafenib, vatalanib, ... 2. blokace vazebné domény receptoru monoklonální protilátkou: volociximab, ramucirumab, ... Rezistence k anti-angiogenní terapii  velké naděje vkládané do anti-angiogenní terapie nebyly naplněny  řada nádorů vykazuje vůči anti-angiogenní terapii rezistenci Kuczynski EA et al, Nat Rev Clin Oncol (2019); doi: 10.1038/s41571-019-0181-9 Důvody rezistence 1. některé nádory mohou využívat alternativní způsob indukce angiogeneze (FGF2, angiopoietin 2, ...) 2. některé nádory nejsou na angiogenezi závislé  vaskulogenní mimikry  kooptace stávajících cév  některé nádory při svém vývoji neindukují vznik vlastního cévního systému, kooptují již existující cévní systém  vyvíjejí se tak na svém začátku jako malé, ale dobře prokrvené nádory.  v nádorech zůstává vaskulatura se strukturou a topografickou distribucí shodnou s původní vaskulaturou Typy nádorové vaskularizace: kooptace stávajících cév Kooptace stávajících cév  normální vaskulatura, ve které jsou perfektně vybalancovány pro- a anti-angiogenní faktory, je tvořena zralými cévami, které jsou hierarchicky uspořádány: cévy – kapiláry – mikrovlásečnice  abnormální nádorová vaskulatura typicky postrádá hierarchické uspořádání, je tvořena nezralými diferencovanými i nediferencovanými cévami se zvýšenou propustností, chybějícím nebo poškozeným lumen; tok krve je málo efektivní, v nádorovém mikroprostředí vzniká hypoxie, i když hustota mikrovlásečnic je oproti normální tkáni zvýšená  anti-angiogenní terapie (anti-VEGF – bevacizumab) vyvolá normalizaci nádorové vaskulatury, ale nenormalizované (tj. stávající) cévy, které jsou dobře podporovány pericyty, zvětší průměr a dobře nádor zásobují – jsou rezistentní k antiangiogenní terapii! Jensen LD, Transl Cancer Res 5 (Supl 7)(2016): S1433-S1436 Kooptace stávajících cév Jensen LD, Transl Cancer Res 5 (Supl 7)(2016): S1433-S1436 Nádory citlivé k anti-VEGF působení jsou ve svém zásobení krví typicky závislé na angiogenezi a rostou především in situ. Působení anti-VEGF způsobí regresi krevních vlásečnic, nekrózu buněk především uvnitř nádoru a zmenšení nádoru. Nádory rezistentní k působení anti VEGF naopak přepnou na invazivní fenotyp, kooptují stávající cévy a nejsou proto ve svém růstu závislé na indukci angiogeneze. Typy nádorové vaskularizace: vaskulogenní mimikry  Avaskulární kanálky, tvořené nádorovými buňkami, kterými protéká krev: • tvoří se bez účasti endoteliální proliferace • připisuje se plasticitě geneticky deregulovaných nádorových buněk  Poprvé popsáno u vysoce agresivních forem maligního melanomu; prokázáno také u karcinomu ovaria, prostaty, inflamatorního karcinomu prsu a sarkomů měkkých tkání.  Spojeno s vysokým gradem, invazí, metastázami a sníženým přežíváním pacientů.  Standardní antiangiogenní terapie je také zde neúčinná! Způsoby nádorové vaskularizace Donnem T et al, Nat Rev Cancer 18 (2018): 323-336  Navzdory obecně přijímané teorii nádory mohou růst i bez neo- angiogeneze.  Jen málo nádorů je zcela neangiogenních, ale mnohé využívají jak angiogenní, tak neangiogenní mechanismy.  Nádory mohou během svého vývoje přepínat z angiogenního do neangiogenního modu, v závislosti na anatomické lokalizaci a působení terapie.  Mechanismus neangiogenního růstu je ovlivněn jak typem orgánu, ve kterém nádor roste, tak typem nádoru.  Neangiogenní nádorové buňky jsou vysoce metastatické a jsou asociovány s vysokou pohyblivostí a schopností infiltrovat okolní prostředí.  Neangiogenní růst je jedním z více způsobů, kterými mohou nádory unikat anti-angiogenní terapii. Kuczynski EA et al, Nat Rev Clin Oncol (2019); doi: 10.1038/s41571-019-0181-9