jména: obor: datum provedení: přílohy protokolu: graf: extrapolace rychlosti fenoloxidasové reakce k nulovému času, graf: vliv kyanidu sodného a azidu sodného na rychlost vzniku TBQ fenoloxidasovou reakcí (závislost absorbance reakční směsi na čase), graf: vliv přirozeně se vyskytujících derivátů fenolu na rychlost vzniku TBQ fenoloxidasovou reakcí (závislost absorbance reakční směsi na čase) OKRUHY K PŘÍPRAVĚ Fenoloxidasová reakce, principy měření fenoloxidasové aktivity. Rychlost enzymové reakce, počáteční rychlost enzymové reakce, aktivita enzymu, jednotky enzymové aktivity, specifická aktivita enzymu, jednotky specifické aktivity. Inhibice enzymové reakce. Struktura derivátů fenolu. Chemické výpočty. Návod v plném znění platí pro obory molekulární biologie, chemie, biochemie (pětihodinová a sedmihodinová cvičení). Biologické obory kromě molekulární biologie (tříhodinová cvičení): části A, B, C. Učitelské kombinace (čtyřhodinová cvičení): části A, B, D, E. PRINCIP ÚLOHY A. Příprava enzymového preparátu Fenoloxidasa (1,2-benzendiol : O[2] – oxidoreduktasa), nazývaná též polyfenoloxidasa, fenolasa, monofenoloxidasa, difenoloxidasa nebo tyrosinasa, katalyzuje v přítomnosti molekulárního kyslíku hydroxylaci různých monofenolů na o-difenoly (tzv. kresolasová aktivita) a následnou oxidaci o-difenolů na odpovídající o-chinony (tzv. katecholasová aktivita). Fenoloxidasa se vyskytuje ve většině druhů ovoce a zeleniny, velké množství tohoto enzymu obsahují také brambory. Fenoloxidasa rovněž katalyzuje přeměnu aminokyseliny tyrosinu (4-hydroxyfenylalanin) na 3,4-dihydroxy-fenylalanin (DOPA), který dále oxiduje molekulárním kyslíkem na dopachinon. Dopachinon se v několika krocích spontánně přeměňuje na indolchinon, který polymeruje za vzniku tmavě zbarveného melaninu, což se projevuje tmavnutím různého ovoce a zeleniny po jejich rozříznutí nebo jiném narušení jejich povrchu na vzduchu. DOPA může být (v živočišných buňkách) také dekarboxylován za vzniku dopaminu, který je prekurzorem biosyntézy adrenalinu a noradrenalinu. Fenoloxidasa bývá z biologického materiálu izolována v inaktivní formě (jako tzv. proenzym); aktivaci lze provést pomocí detergentů nebo trypsinu, který hydrolyticky odštěpí část enzymové molekuly a tím zpřístupní její aktivní centrum. B. Stanovení aktivity fenoloxidasy Aktivitu fenoloxidasy lze stanovit fotometricky, neboť produkty fenoloxidasové reakce jsou barevné sloučeniny. Reakční produkty vzniklé fenoloxidasovou reakcí s přirozenými substráty však často polymerují, přičemž se v závislosti na stupni polymerace v čase mění vlnová délka jejich absorpčního maxima a hodnota absorpčního koeficientu. Aktivitu fenoloxidasy je tedy možné kvantitativně fotometricky stanovit pouze s umělými chromogenními substráty. Jako umělé chromogenní substráty fenoloxidasy jsou nejčastěji používány 4-methylkatechol nebo terciární butylkatechol (TBC), které jsou fenoloxidasou oxidovány za vzniku 4-methyl-chinonu resp. terciárního butylchinonu (TBQ). Tyto chinony nepolymerují, absorbují viditelné záření s maximem v okolí vlnové délky 400 nm a jejich množství vzniklé fenoloxidasovou reakcí lze fotometricky stanovit (ε[TBQ] = 10^4 l.mol^-1.cm^-1). . TBC TBQ C. Substrátová specifita fenoloxidasy V této části úlohy bude studována substrátová specifita fenoloxidasy. Budou použity deriváty fenolu a naftolu hydroxylované v různých polohách a jednoduchým vizuálním sledováním tmavnutí roztoků bude určeno, které deriváty jsou substráty fenoloxidasy, popřípadě jak rychle s nimi reakce probíhá. D. Důkaz přítomnosti kovu v aktivním centru fenoloxidasy Mnohé enzymy kyslíkového metabolismu obsahují v aktivním centru atom kovu, nejčastěji železa nebo mědi. Tyto enzymy jsou velmi silně inhibovány kyanidem, azidem, oxidem uhelnatým a dalšími látkami, které se vážou na centrální atom kovu a působí jako nekompetitivní inhibitory enzymu. Cílem této části úlohy bude zjistit, zda fenoloxidasa obsahuje v aktivním centru atom kovu. E. Inhibice fenoloxidasy analogy substrátů Látky strukturně podobné přirozenému nebo umělému substrátu mohou být buďto alternativními substráty enzymu anebo působit jako kompetitivní inhibitory enzymu, pokud je enzym nedokáže přeměnit na produkt. V tom případě zůstávají navázány v jeho aktivním centru a blokují jej - znemožňují vazbu molekulám substrátu. V této části úlohy bude zjišťováno, zda-li přirozeně se vyskytující analogy substrátů fenoloxidasy kyselina skořicová, kyselina benzoová a fenylalanin působí jako její inhibitory. PRAKTICKÁ ČÁST A. Příprava enzymového preparátu Materiál a vybavení: brambor 0,2 mol.l^-1 fosfátový pufr pH 7,5 vychlazený 10 mmol.l^-1 fosfátový pufr pH 7,5 roztok trypsinu (100 x zředěný preparát používaný v úloze č. 8) nůž, struhadlo, mísa, gáza, kádinka, ledová lázeň, filtrační papír, nálevka, odměrná zkumavka, velká zkumavka s uzávěrem, pipeta, dávkovač, termostat, odměrný válec, předvážky Postup: Oloupaný brambor zvažte s přesností na 0,1 g, nastrouhejte a šťávu vymačkejte přes hustou gázu do kádinky. Rychle odfiltrujte 10 ml šťávy do odměrné zkumavky umístěné v ledové lázni (při laboratorní teplotě fenoloxidasa oxiduje stopy tyrosinu přítomného v rostlinném materiálu, což se projevuje tmavnutím preparátu). K filtrátu přidejte 0,5 ml 0,2 mol.l^-1 fosfátového pufru pH 7,5 (neutrální pH udržuje fenoloxidasu v latentním stavu) a 50 μl roztoku trypsinu. Filtrát inkubujte 15 minut při teplotě 30 ^oC (ve vodním terostatu). 1 ml filtrátu zřeďte 10 x (tj. v poměru 1 : 9) 10 mmol.l^-1 vychlazeným fosfátovým pufrem, zbytek filtrátu ponechejte neředěný. Oba preparáty uložte do ledové lázně. Vyhodnocení: Do protokolu uveďte: - hmotnost brambor (g): - celkový objem vymačkané bramborové šťávy (filtrát + zbytek) (ml): PRAKTICKÁ ČÁST B. Stanovení aktivity fenoloxidasy Materiál a vybavení: filtrát bramborové šťávy připravený v úloze 11a (ředěný i neředěný) 50 mmol.l^-1 octanový pufr pH 5,0 90 mmol.l^-1 TBC (čerstvě připravený roztok) zkumavky, pipety, dávkovače, fotometr, temperovaná nádobka, vzduchovací motorek Postup: Příprava pracovního pufru: Smíchejte 10 ml 90 mmol.l^-1 roztoku TBC, 15 ml octanového pufru a 4 ml vody, směs (označte jako směs B) nalijte do temperované nádobky a nejméně po dobu 10 minut ji provzdušňujte pomocí vzduchovacího motorku. Při všech experimentech používejte důkladně provzdušněnou vytemperovanou pracovní směs! Snížená koncentrace kyslíku v reakční směsi je limitujícím faktorem reakční rychlosti. Stanovení počáteční rychlosti enzymová reakce: Do spektrofotometrické kyvety pipetujte 950 μl provzdušněné pracovní směsi. Kyvetu vložte do fotometru a hodnotu absorbance při vlnové délce 400 nm seřiďte na nulu. Fenoloxidasovou reakci startujte přídavkem 50 μl zředěného filtrátu bramborové šťávy - důkladně promíchejte. Spusťte stopky a v intervalech 10 sekund odečítejte hodnoty absorbance vzorku při vlnové délce 400 nm po dobu 2 minut. Přírůstek absorbance by měl činit přibližně 0,2 za minutu – je-li vyšší nebo nižší, změňte vhodným způsobem ředění filtrátu. Měření nejméně dvakrát (v případě špatné reprodukovatelnosti výsledků i vícekrát) opakujte. Do kontrolního listu zapište, jaký objem filtrátu jste použili k měření a jaké bylo ředění použitého filtrátu. Proveďte korekci měření na přídavek enzymového preparátu do reakční směsi: Změřte absorbanci vzorku obsahujícího 950 μl octanového pufru a 50 μl použitého enzymového preparátu proti octanovému pufru při vlnové délce 400 nm. doba reakce t [s] A[400] A[400] A[400] 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 Vyhodnocení: Do protokolu uveďte tabulky doplněné experimentálními (A[400]) a vypočtenými údaji (A[400 korigovaná] = Ø A[400] - A[400] korekčního vzorku). Vypočtěte reakční rychlosti v jednotlivých časových intervalech a extrapolací k nulovému času (viz úloha 8) zjistěte počáteční rychlost fenoloxidasové reakce jako rychlost přírůstku produktu: (ε[TBQ] = 10^4 l.mol^-1.cm^-1) - A[400] korekčního vzorku: - objem reakční směsi [ml]: doba reakce t [s] Ø A[400] A[400 korigovaná] c(TBQ )[] [mmol/l] n(TBQ) [nmol] dn(TBQ) [nmol] v [nkat] 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 Zjistěte počáteční rychlost enzymové reakce v[0] (extrapolací – jako rychlost přírůstku produktu) [nkat]: - objem ředěného filtrátu v reakční směsi [ml]: - objem neředěného filtrátu v reakční směsi [ml]: - specifická aktivita fenoloxidasy ve filtrátu [nkat na 1 ml neředěného filtrátu]: PRAKTICKÁ ČÁST C. Substrátová specifita fenoloxidasy Materiál a vybavení: neředěný filtrát bramborové šťávy připravený v úloze 11a 50 mmol.l^-1 octanový pufr pH 5,0 10 mmol.l^-1 roztoky derivátů fenolu (fenol, pyrokatechol, resorcinol, hydrochinon, 1-naftol, 2-naftol) zkumavky, pipety, odměrný váleček nebo Pasteurova pipeta, termostat Postup: Do 6 zkumavek pipetujte 1,5 ml octanového pufru a dále přidejte podle rozpisu: zkumavka č. 1 ml substrátu zbarvení před přidáním enzymového preparátu zbarvení po 15 min zbarvení po 60 min 1 fenol (hydroxybenzen) 2 pyrokatechol (1,2-dihydroxybenzen) 3 resorcinol (1,3-dihydroxybenzen) 4 hydrochinon (1,4-dihydroxybenzen) 5 1-naftol (1-hydroxynaftalen) 6 2-naftol (2-hydroxynaftalen) Roztoky fenolu a jeho derivátů nepipetujte - dávkujte pomocí odměrného válečku nebo Pasteurovy pipety! Fenoloxidasovou reakci startujte přídavkem 0,5 ml neředěného filtrátu - důkladně promíchejte. Zkumavky umístěte do termostatu temperovaného na 30 ^oC, reakční směs občas promíchejte (přísun kyslíku do reakční směsi) a pozorujte vznik zbarvení ve zkumavkách, srovnejte po cca 15 a 60 minutách reakce. Vyhodnocení: Do protokolu uveďte tabulku doplněnou experimentálními výsledky (zbarvení reakčních směsí). Popište substrátovou specifitu fenoloxidasy: - fenoloxidasa oxiduje: - fenoloxidasa neoxiduje: - substrátová specifita fenoloxidasy: PRAKTICKÁ ČÁST D. Důkaz přítomnosti kovu v aktivním centru fenoloxidasy Materiál a vybavení: filtrát bramborové šťávy připravený v úloze 11a 50 mmol.l^-1 octanový pufr pH 5,0 90 mmol.l^-1 TBC (čerstvý roztok) 0,1 mol.l^-1 kyanid sodný (čerstvý roztok) 0,1 mol.l^-1 azid sodný zkumavky, pipety, dávkovače, fotometr, temperovaná nádobka, vzduchovací motorek Postup: Příprava pracovního pufru: Smíchejte 10 ml 90 mmol.l^-1 roztoku TBC, 15 ml octanového pufru a 1 ml vody, směs (označte jako směs D) nalijte do temperované nádobky (30 ^oC) a nejméně po dobu 10 minut ji provzdušňujte pomocí vzduchovacího motorku. Při všech experimentech používejte důkladně provzdušněnou vytemperovanou pracovní směs! Snížená koncentrace kyslíku v reakční směsi je limitujícím faktorem reakční rychlosti. Fotometrické stanovení aktivity fenoloxidasy: Do spektrofotometrické kyvety pipetujte 2,6 ml provzdušněné pracovní směsi a dále dle rozpisu: zk. č. 0,3 ml A[400] t [s] 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 1 voda 2 voda 3 voda 4 kyanid sodný 5 kyanid sodný 6 kyanid sodný 7 azid sodný 8 azid sodný 9 azid sodný Kyanid sodný a azid sodný jsou látky silně toxické! Roztoky činidel pipetujte se zvýšenou opatrností, použijte bezpečnostní nástavec na pipety! Kyvetu vložte do fotometru a hodnotu absorbance při vlnové délce 400 nm seřiďte na nulu. Fenoloxidasovou reakci startujte přídavkem 0,1 ml zředěného filtrátu bramborové šťávy (ředění viz úloha 11b) - důkladně promíchejte. Spusťte stopky a v intervalech 20 sekund odečítejte hodnoty absorbance vzorku při vlnové délce 400 nm po dobu 4 minut. Každé měření proveďte jedenkrát (bílé řádky), po konzultaci s vedoucím cvičení případně budete měření opakovat. Vyhodnocení: Do protokolu uveďte tabulku doplněnou experimentálními údaji (A[400]) a do grafu vyneste závislosti A[400 ]na době reakce pro jednotlivé reakční směsi (kontrolní vzorek a další vzorky obsahující různá činidla) – vyberte vždy jedno ze tří paralelních měření. Dále uveďte: látka inhibice fenoloxidasy* předpokládaný typ inhibice** kyanid sodný azid sodný *) + ..... látka inhibuje fenoloxidasu - ..... látka neinhibuje fenoloxidasu **) kompetitivní nebo nekompetitivní Fenoloxidasa obsahuje - neobsahuje atom kovu: PRAKTICKÁ ČÁST E. Inhibice fenoloxidasy analogy substrátů Materiál a vybavení: filtrát bramborové šťávy připravený v úloze 11a 50 mmol.l^-1 octanový pufr pH 5,0 15 mmol.l^-1 TBC (čerstvý roztok) 7,5 mmol.l^-1 kyselina benzoová (pH upraveno na hodnotu 5) 7,5 mmol.l^-1 kyselina skořicová (pH upraveno na hodnotu 5) 7,5 mmol.l^-1 fenylalanin zkumavky, pipety, dávkovače, fotomet, temperovaná nádobka, vzduchovací motorek Postup: Příprava pracovního pufru: Smíchejte 5 ml 15 mmol.l^-1 roztoku TBC, 18 ml octanového pufru a 7,2 ml vody, směs (označte jako směs E) nalijte do temperované nádobky (30 ^oC) a nejméně po dobu 10 minut ji provzdušňujte pomocí vzduchovacího motorku. Při všech experimentech používejte důkladně provzdušněnou vytemperovanou pracovní směs! Snížená koncentrace kyslíku v reakční směsi je limitujícím faktorem reakční rychlosti. Fotometrické stanovení aktivity fenoloxidasy: Do spektrofotometrické kyvety pipetujte 2,5 ml provzdušněné pracovní směsi a dále dle rozpisu: zk. č. 0,4 ml A[400] t [s] 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 1 voda 2 voda 3 voda 4 kys.skořicová 5 kys.skořicová 6 kys.skořicová 7 kys.benzoová 8 kys.benzoová 9 kys.benzoová 10 fenylalanin 11 fenylalanin 12 fenylalanin Kyvetu vložte do fotometru a hodnotu absorbance při vlnové délce 400 nm seřiďte na nulu. Fenoloxidasovou reakci startujte přídavkem 0,1 ml zředěného filtrátu bramborové šťávy (ředění viz úloha 11b) - důkladně promíchejte. Spusťte stopky a v intervalech 20 sekund odečítejte hodnoty absorbance vzorku při vlnové délce 400 nm po dobu 4 minut. Každé měření proveďte jedenkrát (bílé řádky), po konzultaci s vedoucím cvičení případně budete měření opakovat. Vyhodnocení: Do protokolu uveďte tabulku doplněnou experimentálními údaji (A[400]) a do grafu vyneste závislosti A[400 ]na době reakce pro jednotlivé reakční směsi (kontrolní vzorek a další vzorky obsahující různé přirozeně se vyskytující deriváty fenolu) – vyberte vždy jedno ze tří paralelních měření. Dále uveďte: látka inhibice fenoloxidasy* předpokládaný typ inhibice** kys. skořicová kys. benzoová fenylalanin *) + ..... látka inhibuje fenoloxidasu - ..... látka neinhibuje fenoloxidasu **) kompetitivní nebo nekompetitivní Srovnejte strukturu tyrosinu (přirozený substrát fenoloxidasy), kyseliny benzoové, kyseliny skořicové a fenylalaninu. Vysvětlete, proč jsou některé z derivátů fenolu inhibitory fenoloxidasy a jiné nikoliv: KONTROLNÍ LIST jméno: obor: datum provedení: ÚLOHA 11B doba reakce t [s] A[400] A[400] A[400] 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 - A[400] korekčního vzorku: preparát použitý k fotometrickému stanovení aktivity fenoloxidasy: a) uveďte ředění filtrátu (kolikrát zředěný filtrát jste přidávali do kyvety): b) uveďte, kolik zředěného filtrátu jste přidávali do kyvety – objem: Podpis vedoucího cvičení: ÚLOHA 11C zkumavka č. 1 ml substrátu zbarvení před přidáním enzymového preparátu zbarvení po 15 min zbarvení po 60 min 1 fenol (hydroxybenzen) 2 pyrokatechol (1,2-dihydroxybenzen) 3 resorcinol (1,3-dihydroxybenzen) 4 hydrochinon (1,4-dihydroxybenzen) 5 1-naftol (1-hydroxynaftalen) 6 2-naftol (2-hydroxynaftalen) Podpis vedoucího cvičení: ÚLOHA 11D zk. č. 0,3 ml A[400] t [s] 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 1 voda 2 voda 3 voda 4 kyanid sodný 5 kyanid sodný 6 kyanid sodný 7 azid sodný 8 azid sodný 9 azid sodný Podpis vedoucího cvičení: ÚLOHA 11E zk. č. 0,4 ml A[400] t [s] 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 1 voda 2 voda 3 voda 4 kys.skořicová 5 kys.skořicová 6 kys.skořicová 7 kys.benzoová 8 kys.benzoová 9 kys.benzoová 10 fenylalanin 11 fenylalanin 12 fenylalanin Podpis vedoucího cvičení: