jména: obor: datum provedení: přílohy protokolu: 2 x graf: kalibrační přímka pro stanovení koncentrace maltosy Somogyiho-Nelsonovou metodou, závislost rychlosti α-amylasové reakce na pH prostředí OKRUHY K PŘÍPRAVĚ Redukující a neredukující sacharidy. α-amylasová reakce, princip měření α-amylasové aktivity. Rychlost enzymové reakce, aktivita enzymu. Specifická aktivita enzymu. Vliv pH na rychlost enzymové reakce. Chemické výpočty. Návod v plném znění platí pro obory molekulární biologie, chemie, biochemie (pětihodinová a sedmihodinová cvičení). Biologické obory kromě molekulární biologie (tříhodinová cvičení): jen část A. Učitelské kombinace (čtyřhodinová cvičení): kalibrační křivka pro stanovení koncentrace maltosy (z části A) + část B. PRINCIP ÚLOHY A. Stanovení aktivity α-amylasy α-amylasa (ptyalin, diastasa, systematický název: 1,4-α-D-glukan.glukanohydrolasa) katalyzuje hydrolýzu 1,4-α-D-glykosidické vazby škrobu (amylosy nebo amylopektinu) a glykogenu. Je aktivována chloridovými, bromidovými nebo jodidovými anionty, rovněž vyžaduje přítomnost vápenatých kationtů. Meziprodukty α-amylasové reakce jsou různé oligosacharidy (dextriny), konečným produktem je disacharid maltosa: H[2]O škrob g n . maltosa Maltosa (4-O-α-D-glukopyranosyl-D-glukopyranosa) je redukující disacharid skládající se z glukosových podjednotek spojených vazbou jedné alkoholické a jedné poloacetalové hydroxylové skupiny. Zatímco druhá poloacetalová hydroxylová skupina zůstává volná a propůjčuje maltose redukující vlastnosti. Množství maltosy vzniklé α-amylasovou reakcí lze na základě jejích redukujících vlastností stanovit metodou podle Somogyiho. Slinné žlázy vylučují sekret (0,5 až 1,5 l denně) obsahující stopová množství řady enzymů (např. cholinesterasu, různé typy proteinas a glykosidas). Vysokou aktivitu však vykazuje především slinná α-amylasa (je izoenzymem pankreatické α-amylasy), která má fyziologický význam v procesu trávení - hydrolyzuje až 70 % škrobu přijatého potravou. α-amylasa je jediný trávicí enzym, který se vyskytuje ve slinách (pro trávení potravy obsahující škrob má však větší význam pankreatická α-amylasa). Aktivita slinné α-amylasy může být stanovena i v krevním séru, což má diagnostický význam - její aktivita v séru je zvýšena při zánětu příušních slinných žláz (příušnice). Specifická aktivita slinné α-amylasy se však u dvou různých zdravých jedinců může lišit více než desetinásobně. Rychlost enzymové reakce lze definovat jako změnu koncentrace substrátu c (mol/l) za čas t (s) podle vzorce: v [mol.s^-1.l^-1] = dc/dt. Enzymová aktivita (mol.s^-1) je definována jako limitní rychlost enzymové reakce za definovaných podmínek: saturace enzymu substrátem, pH a teplotní optimum. Aktivitu lze vypočítat vynásobením limitní rychlosti enzymové reakce objemem reakční směsi. Základní jednotkou enzymové aktivity je katal (kat), což je taková aktivita enzymu, která přemění 1 mol látky za sekundu (kat = mol/s). Pro praxi je tato jednotka příliš vysoká, aktivita enzymu se obvykle vyjadřuje v jednotkách μkat (μmol přeměněné látky za sekundu) nebo nkat (nmol přeměněné látky za sekundu). Další možností jak vyjadřovat enzymovou aktivitu je mezinárodní jednotka (IU), která je definována jako μmol/min. Specifická aktivita enzymu je aktivita vztažená k hmotnosti celkového proteinu např. (kat/mg).. Aktivita slinné α-amylasy bude v této úloze stanovena pomocí rychlost vzniku maltosy během α-amylasové reakce. B. pH optimum α-amylasy Rychlost enzymové reakce závisí na pH. Tato závislost je dána ionizací aminokyselinových zbytků vlivem pH podobně jako u jiných bílkovin Tato ionizace ovlivňuje terciární strukturu bílkoviny a při extrémních hodnotách může vést i k denaturaci. Hodnota pH dále ovlivňuje například ionizaci substrátu reakce nebo aminokyselin v aktivním centru. Substrát se například může vázat do aktivního místa pouze v protonovaném stavu. Enzymové reakce probíhají limitní (maximální) rychlostí jen při určitém pH prostředí, v tzv. oblasti pH optima. pH optimum téhož enzymu se tedy může lišit i v závislosti na konkrétním použitém substrátu. Většina enzymů má pH optimum v neutrální, slabě kyselé nebo slabě alkalické oblasti, časté jsou však výjimky (např. pepsin má pH optimum v oblasti pH 1,5 - 2,5, alkalická fosfatasa při pH kolem 9,5). PRAKTICKÁ ČÁST A. Stanovení aktivity α-amylasy Materiál a vybavení: fyziologický roztok (0,9 % chlorid sodný) s přídavkem 1 mmol.1^-1 chloridu vápenatého standardní roztok maltosy (0,1 mmol.1^-1) 0,15 mol.1^-1 fosfátový pufr pH 7,5 1 % roztok škrobu Somogyiho-Nelsonovo činidlo I (roztok uhličitanu sodného, vínanu sodno-draselného a síranu sodného) Somogyiho-Nelsonovo činidlo II (roztok síranu měďnatého a síranu sodného) Somogyiho-Nelsonovo činidlo III (roztok molybdenanu amonného a hydrogenarseničnanu sodného v kyselině sírové) Lugolův roztok (roztok jódu a jodidu draselného) kádinka, pipety, dávkovače, pumpičkové dávkovače, odměrná baňka 10 ml, krátké zkumavky, zátky, Pasteurova pipeta, vortex, stopky, kruhový stojan na zkumavky, hrnec, termostat, fotometr, ledová lázeň V úloze pracujete s toxickými činidly (zejména Somogyiho-Nelsonovo činidlo III) - pracujte se zvýšenou opatrností! Postup: Sestrojení kalibrační závislosti pro stanovení koncentrace maltosy: Nachystejte si sadu 6 zkumavek, které důkladně vypláchnete destilovanou vodou. Podle tabulky připravte sadu šesti roztoků o celkovém objemu 0,5 ml a známé koncentraci maltosy k sestrojení kalibrační přímky (zkumavky 1-6). Zkumavka č. 1 maltosu neobsahuje, proto se použije jako slepý vzorek. zkumavka č. pipetovaný objem vypočtená c(mal) [mmol.l^-1] A[740] 0,1 mmol.l^-1 roztok mal [ml] destil. voda [ml] 1 0,0 0,5 0,00 0,000 2 0,1 0,4 3 0,2 0,3 4 0,3 0,2 5 0,4 0,1 6 0,5 0,0 Používejte pouze dokonale čisté pipety a zkumavky. Stanovení je velmi citlivé, jakákoliv stopa redukujících látek hrubě zkresluje jeho výsledek. Do všech zkumavek přidejte 0,5 ml Somogyiho-Nelsonova činidla I, vzorky promíchejte a zahřívejte asi 5 minut na vroucí vodní lázni. Potom přidejte do všech vzorků 0,5 ml Somogyiho-Nelsonova činidla II a zahřívejte na vroucí vodní lázni dalších 10 minut. Po ochlazení na laboratorní teplotu (lze chladit pomocí studené vody) přidejte do všech vzorků 2 ml Somogyiho-Nelsonova činidla III, vzorky promíchejte a ponechejte stát po dobu nejméně 2 minut při laboratorní teplotě (a opět promíchejte (vypuzení oxidu uhličitého ze vzorku). Změřte absorbanci roztoků 2-6 při vlnové délce 740 nm proti slepému vzorku č. 1 (roztoky po měření vracejte do zkumavek), výsledky zapište do tabulky. Při měření absorbance je potřeba sledovat zda se v kyvetách netvoří bublinky CO[2], které zkreslují měření. V případě výskytu bublinek (CO[2]) v kyvetách zaťukejte kyvetou jemně o stůl, čímž CO[2] vypudíte. Pokud některá z hodnot absorbance překročila 0,8 (nad touto hodnotou již není závislost absorbance na koncentraci lineární – neplatí Lambert-Beerův zákon) je nutné udělat novou kalibrační přímku, případně tuto hodnotu z kalibrace vynechat. Příprava enzymového preparátu α-amylasy: Do 10 ml odměrné baňky odpipetujte 1 ml vlastních slin, obsah doplňte po značku fyziologickým roztokem s přídavkem chloridu vápenatého. Stanovení aktivity α-amylasy: Do 6 krátkých zkumavek (sada A) pipetujte 0,5 ml roztoku škrobu a 2,4 ml fosfátového pufru. Do jedné z nich připipetujte 0,1 ml fyziologického roztoku s přídavkem chloridu vápenatého (její obsah bude sloužit jako kontrola neenzymatického rozkladu škrobu), tuto zkumavku označte A/K (kontrolní vzorek). Do dalších 6 zkumavek (sada B) dejte 0,5 ml Somogyiho-Nelsonova činidla I. (Somogyiho-Nelsonovo činidlo I v této sadě zkumavek slouží jednak k ukončení enzymové reakce, jednak ke stanovení vzniklých produktů.) Jednu ze zkumavek označte B/K. Termostat vytemperujte na teplotu 30 ^oC. Po ustálení teploty do něj vložte zkumavky sady A a ponechejte temperovat 10 minut. Po uplynutí této doby vložte zkumavky sady B do vroucí vodní lázně. Zkumavku označenou A/K ponechejte stále v termostatu, uzavřete ji zátkou. Ve zbývajících 5 zkumavkách temperovaných na teplotu 30 ^oC startujte enzymovou reakci přídavkem 0,1 ml zředěných slin v intervalu 30 s (spusťte stopky, po 30 sekundách startujte přídavkem zředěných slin v první zkumavce, reakční směs promíchejte, stopky nevypínejte, po dalších 30 sekundách startujte přídavkem zředěných slin ve druhé zkumavce, reakční směs promíchejte, stopky nevypínejte, viz tabulka). Přesně po 15 minutách opět v pravidelných intervalech 30 sekund odeberte z každé zkumavky dávkovačem 0,5 ml reakční směsi a pipetujte do zkumavky se Somogyiho-Nelsonovým činidlem I na vroucí vodní lázni (viz tabulka). Dbejte, aby špička pipety zasahovala pod hladinu činidla, nenechávejte vzorek stékat po stěně zkumavky. Během enzymové reakce zůstávají zkumavky s reakční směsí v termostatu. Do zkumavky označené písmenem B/K na vroucí vodní lázni přeneste dávkovačem s čistou špičkou (pozor na kontaminaci slepého vzorku slinami) 0,5 ml roztoku ze zkumavky obsahující kontrolní vzorek (zkumavka A/K). Všechny zkumavky ponechejte ve vroucí vodní lázni asi 3 minuty a pak je nechejte chladnout při laboratorní teplotě. Po odebrání všech vzorků reakčních směsí a kontrolního vzorku uložte jejich zbytky (nepoužité pro stanovení koncentrace maltosy) do ledové lázně (nevyhazujte je). zkumavka č. start reakce (přídavek zředěných slin) - čas na stopkách konec reakce (vnesení vzorku do Somogyiho- Nelsonova činidla I) - čas na stopkách 1 30´´ 15´30´ 2 1´ 16´ 3 1´30´´ 16´30´´ 4 2´ 17´ 5 2´30´´ 17´30´´ Stanovení koncentrace maltosy v reakčních směsích: Do každé zkumavky sady B (obsahující nyní reakční směs nebo kontrolní vzorek a Somogyiho-Nelsonovo činidlo I) přidejte 0,5 ml Somogyiho-Nelsonova činidla II, jejich obsah promíchejte a ponechejte je na vroucí vodní lázni dalších 10 minut. Pak zkumavky ochlaďte vodou, přidejte do nich 2 ml Somogyiho-Nelsonova činidla III, promíchejte, ponechejte stát po dobu nejméně 2 minut při laboratorní teplotě (a opět promíchejte (vypuzení oxidu uhličitého ze vzorku). Změřte absorbanci vzorků, v nichž probíhala enzymová reakce, proti kontrolnímu vzorku při vlnové délce 740 nm. Jestliže je kontrolní vzorek zakalený, přefiltrujte jej. Při měření absorbance je potřeba sledovat zda se v kyvetách netvoří bublinky CO[2], které zkreslují měření. V případě výskytu bublinek (CO[2]) v kyvetách zaťukejte kyvetou jemně o stůl, čímž CO[2] vypudíte. Překračují-li absorbance některých vzorků hodnotu 0,8, vzorky definovaným způsobem nařeďte vodou (zvolte vhodné násobné ředění) a znovu změřte proti stejným způsobem zředěnému kontrolnímu vzorku. Do zbytků reakčních směsí a kontrolního vzorku přidejte pomocí Pasteurovy pipety kapku Lugolova roztoku, promíchejte. Srovnejte zbarvení vzorků, v nichž probíhala enzymová reakce, se zbarvením kontrolního vzorku. Vyhodnocení: Vypočítejte koncentrace maltosy ve zkumavkách č. 2-6, výsledky doplňte do tabulky v části Postup. Sestrojte kalibrační graf (závislost A[740] na koncentraci maltosy ve zkumavce). Uveďte následující údaje a tabulku doplněnou experimentálními a vypočtenými údaji: - objem reakční směsi (ml): - doba reakce (min): - objem neředěných slin obsažených v reakční směsi (ml): zkumavka č. A[740] Ø A[740] c(maltosy) ve vzorku pro fotometrii* [mmol.l^-1] ředění vzorku pro fotometrii c(maltosy) v reakční směsi** [mmol.l^-1] 1 2 3 4 5 *) při výpočtu koncentrace maltosy použijte kalibrační graf **) koncentrace redukujících sacharidů vynásobená ředěním pro fotometrii n (maltosy)[ ]v reakční směsi [μmol] aktivita amylasy [μmol.min^-1]* specifická aktivita amylasy [μmol.min^-1.ml^-1]** [nkat] [nkat.ml^-1] *) v celém objemu reakční směsi **) aktivita vztažená na ml slin Uveďte zbarvení vzorků (po přídavku Lugolova roztoku) v nichž probíhala enzymová reakce, a zbarvení kontrolního vzorku. Rozdíl vysvětlete: Praktická část B. pH optimum α-amylasy Materiál a vybavení: 0,1 mol.l^-1 kys. citronová 0,2 mol.l^-1 Na[2]HPO[4] standardní pufry pH 4, pH 7a pH 9 fyziologický roztok (0,9 % chlorid sodný) s přídavkem 1 mmol.l^-1 chloridu vápenatého 1 % roztok škrobu Somogyiho-Nelsonovo činidlo I (roztok uhličitanu sodného, vínanu sodno-draselného a síranu sodného) Somogyiho-Nelsonovo činidlo II (roztok síranu měďnatého a síranu sodného) Somogyiho-Nelsonovo činidlo III (roztok molybdenanu amonného a hydrogenarseničnanu sodného v kyselině sírové) Lugolův roztok (roztok jódu a jodidu draselného) pipety, odměrný válec 25 ml, titrační baňky, pH-metr, kádinka, odměrná baňka 10 ml krátké zkumavky, zátky ,dávkovače, pumpičkové dávkovače, Pasteurova pipeta, vortex, stopky, kruhový stojan na zkumavky, hrnec, kahan a trojnožka nebo vařič, termostat, fotometr, ledová lázeň V úloze pracujete s toxickými činidly (zejména Somogyiho-Nelsonovo činidlo III) - pracujte se zvýšenou opatrností! Postup: Příprava sady pufrů s různým pH: Do odměrného válce nalijte 0,2 mol/l hydrogenfosforečnan sodný podle rozpisu a doplňte 0,1 mol/l kyselinou citronovou na celkový objem 25 ml. Připravený pufr přelijte do označené titrační baňky. baňka č. 0,2 mol/l hydrogenfosforečnan disodný (ml) přibližná teoretická hodnota pH pufru hodnota pH pufru stanovená pH-metrem 1 5,0 3,0 2 8,8 4,0 3 12,5 4,8 4 14,0 5,4 5 15,0 5,8 6 18,1 6,6 7 20,6 7,0 8 23,4 7,6 9 24,3 8,0 10 25,0 8,5 pH připravených pufrů zjistěte pH-metrem. Příprava enzymového preparátu α-amylasy: Do 10 ml odměrné baňky odpipetujte 1 ml vlastních slin, obsah doplňte po značku fyziologickým roztokem s přídavkem chloridu vápenatého. Stanovení aktivity α-amylasy: Do 10 krátkých zkumavek (sada A) pipetujte dávkovačem 0,5 ml roztoku škrobu, každé z nich přidejte 2,4 ml pufru s různým pH - zkumavky označte čísly 1 – 10 a hodnotou pH pufru. Do dalších 10 zkumavek (sada B) označených stejně jako zkumavky sady A dejte 0,5 ml Somogyiho-Nelsonova činidla I. (Somogyiho-Nelsonovo činidlo I v této sadě zkumavek slouží jednak k ukončení enzymové reakce, jednak ke stanovení vzniklých produktů.) Termostat vytemperujte na teplotu 30 ^oC. Po ustálení teploty do něj vložte zkumavky sady A a ponechejte temperovat 10 minut. Po uplynutí této doby vložte zkumavky sady B do vroucí vodní lázně. Ve zkumavkách sady A temperovaných na teplotu 30 ^oC startujte enzymovou reakci přídavkem 0,1 ml zředěných slin v intervalu 30 s (spusťte stopky, po 30 sekundách startujte přídavkem zředěných slin v první zkumavce, reakční směs promíchejte, stopky nevypínejte, po dalších 30 sekundách startujte přídavkem zředěných slin ve druhé zkumavce, reakční směs promíchejte, stopky nevypínejte, viz tabulka). Přesně po 15 minutách opět v pravidelných intervalech 30 sekund odeberte z každé zkumavky dávkovačem 0,5 ml reakční směsi a pipetujte do příslušné zkumavky sady B se Somogyiho-Nelsonovým činidlem I na vroucí vodní lázni (viz tabulka). Dbejte, aby špička pipety zasahovala pod hladinu činidla, nenechávejte vzorek stékat po stěně zkumavky. Během enzymové reakce zůstávají zkumavky s reakční směsí v termostatu. Po odebrání všech vzorků reakčních směsí uložte jejich zbytky (nepoužité pro stanovení koncentrace maltosy) do ledové lázně (nevyhazujte je). Připravte slepý vzorek pro fotometrii – v označené zkumavce smíchejte 0,5 ml vody a 0,5 ml Somogyiho-Nelsonova činidla I. Zkumavku vložte do vroucí vodní lázně. Všechny zkumavky ponechejte ve vroucí vodní lázni asi 3 minuty a pak je nechejte chladnout při laboratorní teplotě. zkumavka (pH) start reakce (přídavek zředěných slin) - čas na stopkách konec reakce (vnesení vzorku do Somogyiho-Nelsonova činidla I) - čas na stopkách 3,0 30´´ 15´30´ 4,0 1´ 16´ 4,8 1´30´´ 16´30´´ 5,4 2´ 17´ 5,8 2´30´´ 17´30´´ 6,6 3´ 18´ 7,0 3´30´´ 18´30´´ 7,6 4´ 19´ 8,0 4´30´´ 19´30´´ 8,5 5´ 20´ Stanovení koncentrace maltosy v reakčních směsích: Do každé zkumavky sady B (obsahující nyní reakční směs nebo vodu a Somogyiho-Nelsonovo činidlo I) přidejte 0,5 ml Somogyiho-Nelsonova činidla II, jejich obsah promíchejte a ponechejte je na vroucí vodní lázni dalších 10 minut. Pak zkumavky ochlaďte vodou, přidejte do nich 2 ml Somogyiho-Nelsonova činidla III, promíchejte, ponechejte stát po dobu nejméně 2 minut při laboratorní teplotě a opět promíchejte (vypuzení oxidu uhličitého ze vzorku). Změřte absorbanci vzorků, v nichž probíhala enzymová reakce, proti slepému vzorku při vlnové délce 740 nm. Překračují-li absorbance některých vzorků hodnotu 0,8, všechny vzorky definovaným způsobem nařeďte vodou (zvolte vhodné násobné ředění) a znovu změřte proti stejným způsobem zředěnému slepému vzorku. Do zbytků reakčních směsí a přidejte pomocí Pasteurovy pipety kapku Lugolova roztoku, promíchejte. Pozorujte zbarvení vzorků a jeho intenzitu v závislosti na pH reakční směsi. Pokud nemáte k dispozici kontrolní vzorek obsahující nerozštěpený škrob z části úlohy A, připravte si jej smícháním 0,5 ml roztoku škrobu a 1,5 ml vody. Vyhodnocení: Uveďte následující údaje a tabulku doplněnou experimentálními a vypočtenými údaji: - doba reakce (min): zkumavka č. A[740] c(maltosy) ve vzorku pro fotometrii* [mmol.l^-1] ředění vzorku pro fotometrii c(maltosy) v reakční směsi** [mmol.l^-1] 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 *) při výpočtu koncentrace maltosy použijte kalibrační graf **) koncentrace redukujících sacharidů vynásobená ředěním pro fotometrii zkumavka č. pH (zjištěné pH metrem) c (maltosy)[ ] v reakční směsi [μmol.l^-1] v[vzniku][ ] (maltosy) [μmol.l^-1.min^-1] zbarvení reakčních směsí po přidání Lugolova roztoku 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 pH optimum v[vzniku][ ] (maltosy) [μmol.l^-1.min^-1] Do grafu vyneste závislost rychlosti vzniku maltosy na pH prostředí. Uveďte, při kterém pH probíhala α-amylasová reakce nejrychleji: KONTROLNÍ LIST jména: obor: datum provedení: ÚLOHA 7A - kalibrační graf zkumavka č. A[740] 1 0,000 2 3 4 5 6 Podpis vedoucího cvičení: ÚLOHA 7A - stanovení aktivity α-amylasy zkumavka č. ředění vzorku pro fotometrii A[740] zředěného vzorku zbarvení reakčních směsí po přidání Lugolova roztoku 1 2 3 4 5 zbarvení kontrolního vzorku po přidání Lugolova roztoku: Podpis vedoucího cvičení: ÚLOHA 7B pH (zjištěné pH metrem) ředění vzorku pro fotometrii A[740] zředěného vzorku zbarvení reakčních směsí po přidání Lugolova roztoku Podpis vedoucího cvičení: