Ctirad Hofr MUNI SCIlablifeb.org LifeB – Laboratoř interakce a funkce esenciálních Biomolekul Funkční genomika a proteomika Národní centrum pro výzkum biomolekul Fluorescence ve výzkumu biomolekul lablifeb .org Muni Sci Muni Sci Přehled kvantitativních metod fluorescenční analýzy interakcí biomolekul Vazebná křivka, rovnovážná disociační konstanta, lineární rozsah detektoru. Teorie = základ praxe 1 2 Stanovení vazebné afinity fluorescenčně značných proteinů - fluorescenční anisotropie, microscale thermophoresis. FRET. Fluorescence při kvantifikaci afinity a vzdálenosti 3 Shrnutí praktických výhod a nevýhod kvantitativních metod fluorescenční analýzy interakce biomolekul. Která je nejlepší - srovnání metod 4 Původ rezonančního přenosu energie, charakteristické veličiny FRET, Aplikace FRET při studiu biomolekul Fluorescenční rezonanční přenos energie - FRET lablifeb .org Muni Sci Muni Sci 1 Vazebná křivka 1 isoterma KD disociační konstanta – koncentrace proteinu, při které je právě polovina molekul v komplexu Pro vazbu dvou proteinů A,B a vznik komplexu A.B při konstantní teplotě A +B ↔ A.B zapíšeme rovnovážnou disociační konstantu 𝐾𝐾𝐷𝐷 = 𝐴𝐴 𝐵𝐵 𝐴𝐴 ⋅ 𝐵𝐵 % 𝑣𝑣𝑣𝑣𝑣𝑣𝑣𝑣𝑣𝑣 = 𝐵𝐵 𝐵𝐵 + 𝐾𝐾𝐾𝐾 ⋅ 100% Jestliže přidáváme postupně protein B k proteinu A, vazebnou křivku lze vyjádřit rovnicí 0 25 50 75 100 0 20 40 60 80 100%vazby Koncentrace proteinu [B] Závislost míry vazby na celkové koncentraci přidaného proteinu B KD lablifeb .org Muni Sci Muni Sci Vazebná křivka 2 odvození rovnice funkce 0 25 50 75 100 0 20 40 60 80 100 %vazby Koncentrace proteinu B Závislost míry vazby na celkové koncentraci přidaného proteinu B Míru vazby vyjádříme poměrem koncentrace komplexu A.B a celkové koncentrace proteinu A násobený 100%. Vazebná křivka je hyperbola s hodnotou disociační konstanty KD ve jmenovateli. %𝑣𝑣𝑣𝑣𝑣𝑣𝑣𝑣𝑣𝑣 = 𝐴𝐴 ⋅ 𝐵𝐵 𝐴𝐴𝑇𝑇𝑇𝑇𝑇𝑇 ⋅ 100% Po dosazení za A.B a ATOT získáme rovnici pro vazebnou křivku 𝐴𝐴 ⋅ 𝐵𝐵 = 𝐴𝐴 𝐵𝐵 𝐾𝐾𝐷𝐷 𝐴𝐴𝑇𝑇𝑂𝑂𝑂𝑂 = 𝐴𝐴 ⋅ 𝐵𝐵 + 𝐴𝐴 % 𝑣𝑣𝑣𝑣𝑣𝑣𝑣𝑣𝑣𝑣 = 𝐵𝐵 𝐵𝐵 + 𝐾𝐾𝐾𝐾 ⋅ 100% Automatické fitování dat v Excel minimalizací součtu druhých mocnin odchylek měřených dat a fitovaných hodnot za použití doplňku Řešitel (Solver) si můžete vyzkoušet v souboru Videonávod, jak aktivovat doplněk Řešitel (Solver) v programu Excel je v souboru Návod vznikl na základě videa - autor Karl Zuvela https://youtu.be/4jpoCGWmfeM Vyzkoušet, jak se mění tvar vazebné křivky v závislosti na KD si můžete v souboru Vazebná křivka 3 fitování pro chytré hlavy Automat_KD_fit.xlsx KD_vliv_na_tvar_krivky.xlsx Resitel_Solver_ON.mp4 když ručně změníte hodnotu KD na řádku 16. lablifeb .org Muni Sci Muni Sci Vazebná křivka 4 logaritmus koncentrace = sigmoida 0 25 50 75 100 0.1 1 10 100 1000 vazby Logaritmus koncentrace proteinu log 10 [B] Závislost míry vazby na logaritmu celkové koncentrace přidaného proteinu B KD KD disociační konstanta – inflexní bod sigmoidy Sklon sigmoidy – míra kooperativity vazby v případě, že se váže více molekul B na jednu molekulu A. Jestliže přidáme k proteinu A protein B v dostatečně širokém rozsahu koncentrací, vazebnou křivkou závislosti míry vazby na logaritmu koncentrace B je sigmoida. % 𝑣𝑣𝑣𝑣𝑣𝑣𝑣𝑣𝑣𝑣 = 𝐵𝐵 𝐵𝐵 + 𝐾𝐾𝐾𝐾 ⋅ 100% https://en.wikipedia.org/wiki/ Hill_equation_(biochemistry) Jak mění kooperativita vazby tvar sigmoidy? lablifeb .org Muni Sci Muni Sci Poznejte svůj detektor - lineární rozsah detektoru = přesná kvantitativní měření Pro přesné kvantitativní měření je nezbytné, aby byl přírůstek signálu přímo úměrný přírůstku koncentrace komplexů protein-protein. To je splněno pro lineární rozsah detektoru – oblast detekce, kde po zvýšení koncentrace např. dvakrát zvýší hodnota signálu také dvakrát. Celkově má detekční křivka průběh sigmoidy. Oblast pod lineárním rozsahem - jsme blízko minimálnímu detekčnímu limitu = nelineární odezva. Oblast nad lineárním rozsahem – detektor je zahlcen signálem – saturován, velká změna koncentrace způsobí relativně malé a nelineární zvýšení signálu. Vždy si zjistit lineární rozsah detektoru. Při kvantitativních měřeních je nezbytné, aby se měřené hodnoty nacházely v lineárním rozsahu detektoru. Signáldetektoru Koncentrace Lineární rozsah detektoru Saturace detektoru Detekční limit 2 Fluorescenční stanovení vazebné affinity- anizotropie Anisotropie fluorescence - princip „Usměrněnost“ emitovaného světla se zvýší po vytvoření komplexu protein-protein; po excitaci lineárně polarizovaným zářením dochází k emisi fluorescence značené molekuly převážně v jednom směru. Prakticky - značíme menší z proteinů. - stačí naznačit 100 µg proteinu v kyvetě. - přidávaný protein není značený. - celková koncentrace přidávaného proteinu je minimálně 10x větší než koncentrace značeného proteinu Excitace v jednom směru nízká anizotropie vysoká anizotropie „usměrněnost“ čas od excitace po emisi fluorescence t ~ ns Emise fluorescence 0 25 50 75 100 0 20 40 60 80 100 %vazby Koncentrace přidávaného proteinuSložení roztoku v měřící kyvetě lablifeb .org Muni Sci Muni Sci Anisotropie fluorescence měření polarizátor analyzátor detektor Hodnota anizotropie r je podíl rozdílu IVV - IVH intenzity fluorescence při rovnoběžném (vertikálním) a kolmém (horizontálním) natočení analyzátoru vůči excitačnímu polarizátoru a celkové intenzity fluorescence IVV+2IVH ve 3D – všech třech směrech šíření fluorescence. Prakticky - Přístroj - fluorometr s polarizátorem excitačního světla a otočným polarizátorem = analyzátorem vyzářené fluorescence pro zjištění intenzity v různých směrech. - Potřebujeme ~ 10x vyšší koncentraci než na měření klasické fluorescence – polarizátory propouští 10x měně světla. - Hodnota anisotropie r je bezrozměrná veličina (podíl čísel). 𝑟𝑟 = 𝐼𝐼𝛪𝛪𝛪𝛪−𝐼𝐼⊥ 𝐼𝐼𝛪𝛪𝛪𝛪+2𝐼𝐼⊥ = 𝐼𝐼 𝑉𝑉𝑉𝑉−𝐼𝐼 𝑉𝑉𝑉𝑉 𝐼𝐼 𝑉𝑉𝑉𝑉+2𝐼𝐼 𝑉𝑉𝑉𝑉 lablifeb .org Muni Sci Muni Sci Microscale thermophoresis MST Princip MST - Vytvoříme lokální teplotní gradient – ozáříme vzorek v kapiláře infračerveným laserem. - Vzorek zároveň osvětlujeme excitačním světlem pro fluorofor, kterým je značený menší protein. - Detekujeme pohyb fluorescenčně značených molekul jako změnu fluorescence v mikrooblasti osvětlené IR laserem. - Při konstantní koncentraci fluorescenčně značeného proteinu zvyšujeme koncentraci přidávaného neznačeného proteinu = ligandu. - Sledujeme snížení míry poklesu fluorescence v čase se vzrůstající koncentrací ligandu. Čas ozařování vzorku ~ 20 s https://en.wikipedia.org/wiki/Microscale_thermophoresis Úbytekfluorescence vše navázáno polovina navázána samotný značený protein bound unbound lablifeb .org Muni Sci Muni Sci Obrázek laskavě poskytl Dr. Josef Houser, CORE FACILITY Biomolecular Interactions and Crystallization http://bic.ceitec.cz/cs Prakticky MST měření protein-protein interakce - Fluorescenčně naznačíme menší protein. - Vytvoříme ředící řadu druhého proteinu = ligandu jeho postupným ředěním 2x. - Smícháme roztoky tak, že koncentrace značeného proteinu je stejná, ale koncentrace ligandu se mění v rozsahu 5 řádů. - Vzorky nasajeme do kapilár (5uL) . - Měříme změnu fluorescence po zapnutí IR laseru. - Vyneseme změnu fluorescence v závislosti na logaritmu koncentrace ligandu. - Z inflexního bodu sigmoidy určíme disociační konstantu vzniku komplexu protein-ligand. lablifeb .org Muni Sci Muni Sci Srovnání fluorescenčních metod určení afinity biomolekul 3 3 2 5 3 10 8 8 9 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 AF MST Spotřeba vzorku Délka přípravy vzorku a měření Přesnost určení KD Uživatelská přívětivost lablifeb .org Muni Sci Muni Sci Fluorescenční rezonanční přenos energie Fluorescence resonance energy transport - FRET 4 FRET je jev, při kterém dochází k absorpci fotonu pouze molekulou donoru – příjemcem fotonu. Následně dojde k nezářivému přenosu energie – bez výměny fotonu - z donoru – dárce energie na akceptor příjemce energie. Konečným výsledkem jsou excitované molekuly akceptoru, které budící záření pro donor neabsorbují, ale přesto emitují. FRET vysvětlujeme za použití dipólových momentů přechodů absorpce a emise, které jsou dány okamžitým stavem elektronového obalu molekuly. Velikost dipólového momentu přechodu udává schopnost molekuly v daném stavu absorbovat nebo emitovat světlo. Směr dipólového momentu přechodu udává směr, ve kterém je světlo = jeho elektrická složka molekulou nejlépe absorbováno nebo emitováno, délka šipky = velikost dipólu udává pravděpodobnost přechodu elektronu mezi energetickými hladinami. Podmínkou FRET je překryv emisního spektra donoru a absorpčního spektra akceptoru. lablifeb .org Muni Sci Muni Sci Pravděpodobnost přenosu energie kDA Rychlostní konstanta kDA určuje pravděpodobnost rezonančního přenosu energie FRET. Velikost kDA pro dipól-dipólový přenos energie v případě slabé vazby, kdy vzájemné interakce donoru a akceptoru neovlivní optická spektra vypočítáme podle Försterova vzorce τD – doba dohasínání fluorescence donoru, R0 – Försterova vzdálenost, ve které je pravděpodobnost přenosu energie poloviční 50% tj. rovna pravděpodobnosti vnitřní deaktivace vzbuzeného stavu molekuly, r – vzdálenost mezi donorem a akceptorem. 6 01         ⋅= r R k D DA τ Rezonanční přenos energie je nepřímo úměrný šesté mocnině vzdálenosti donoru a akceptoru podobně jako při interakci indukovaného dipólu a permanentního dipólu. 6 0 2 2 1 r V πε αµ −= lablifeb .org Muni Sci Muni Sci Účinnost fluorescenčního rezonančního přenosu E Účinnost rezonančního přenosu energie E je závislá na poměrném množství energie fotonů, které jsou absorbovány donorem a následně je jejich energie vyzářena akceptorem. D DA F F E −=1 Prakticky se účinnost rezonančního přenosu energie E měří určením relativní intenzity fluorescence donoru za nepřítomnosti FD a za přítomnosti akceptoru FDA. E rychle klesá se 6. mocninou vzdálenosti! )( )( 1 rk rk E DAD DA + = − τ 66 0 6 0 rR R E + = lablifeb .org Muni Sci Muni Sci Popis hybridizace DNA za použití FRET Intenzitafluorescence Vlnová délka emise λ (nm) • Při hybridizaci DNA se dostávají do těsné blízkosti řetězce značené D zeleně a A červeně. • Dochází ke snížení emise donoru a zároveň k navýšení emise akceptoru při excitaci v oblasti excitačního maxima donoru. • Změna emisního spektra ukazuje na FRET mezi komplementárními řetězci a je důkazem hybridizace DNA. oblast emise Donoru oblast emise Akceptoru lablifeb .org Muni Sci Muni Sci Kde se můžete dozvědět více? C7230 Fluorescenční metody ve vědách o životě - cesta od molekuly k buňce C7235 cvičení Teoretická vysvětlení principů fluorescence a praktická výuka aplikace fluorescenčních přístupů Podzim 2020 FE010 Experimental Methods in Biophysics - life science laboratory approaches and excursions Přednášky odborníků a exkurze do výzkumných laboratoří mezinárodně uznávaných společností Podzim 2020