Termodynamika Př. 2.1 Pro úplnou oxidaci glukosy reakcí C[6]H[12]O[6](s) + 6O[2](g) → 6H[2]O(l) + 6CO[2](g) bylo při teplotě 25°C a tlaku 1 atm změřeno spalné teplo 673 kcal∙mol^-1. Vypočtěte změnu vnitřní energie systému doprovázející tuto reakci. Řešení: C[6]H[12]O[6](s) + 6O[2](g) → 6H[2]O(l) + 6CO[2](g) (biodegradace glukosy) dU = dQ +dW (změna vnitřní energie byla způsobena tím, že si systém s okolím vyměnil teplo q a práci w) Při zanedbání rozdílu objemů glukosy a vody nedochází k objemové práci, a tedy lze psát: dU = dQ → dU = -673 + 0 = -673 kcal ∙mol^-1 Zahrnujeme znaménkovou konvenci, podle které w a q mají kladné hodnoty, když je příslušná energie přenášena směrem do systému a mají záporné hodnoty, když systém příslušnou energii vydává. Př. 2.2 Ureasa katalyzuje reakci (NH[2])[2]CO + H[2]O → CO[2] + 2NH[3] Vypočtěte objemovou práci spojenou s hydrolysou 1 molu močoviny při teplotě 25°C za konstantního tlaku. Předpokládejte, že produkty reakce jsou ideální plyny, které se zcela uvolní z roztoku. Řešení: Vycházíme ze stavové rovnice ideálního plynu: pV = nRT Pro objemovou práci platí vztah: dW = -pdV -W = nRT (uvažujeme, že 1 mol výchozí látky se přeměnil na 3 moly produktu) -W = 3∙8,314∙298 = 7,43 kJ∙mol^-1 Př. 2.6 Hodnoty ΔH oxidace glukosy a kyseliny stearové kyslíkem činí -2880 a -11381 kJ∙mol^-1 při 37 °C. Relativní molekulové hmotnosti těchto sloučenin jsou 180 a 284. a) Vypočítejte množství tepla, jež se uvolní oxidací 1 g uvedených substrátů. Pokuste se objasnit další faktory, které zvýhodňují ukládání zásobní energie organismů ve formě esterů mastných kyselin. b) Při probuzení ze zimního spánku vzrůstá tělní teplota křečka o 30 °C. Průměrné měrné teplo jeho tkání činí 3,3 J∙K^-1∙g^-1. Vypočítejte, kolik tukové tkáně spotřebuje křeček o hmotnosti 100 g při probuzení ze zimního spánku; za hodnotu spalného tepla tuku můžete použít hodnotu vypočtenou pro kyselinu stearovou. Tuková tkáň křečka představuje asi 2% jeho tělesné hmotnosti. Je toto množství dostatečné pro uvažovaný účel? Řešení: a) 1 g glukosy = 5,55∙10^-3 mol glukosy Oxidací 1 g glukosy se uvolní: 5,55∙10^-3 ∙ 2880∙10^3 = 15984 J∙g^-1 = 16 kJ∙g^-1^ 1 g kyseliny stearové = = 3,52∙10^-3 mol kyseliny stearové Oxidací 1 g kyseliny stearové se uvolní: 3,52∙10^-3 ∙11381∙10^3 = 40073,9 J∙g^-1 = 40,007 kJ∙g^-1^ Kromě nižšího energetického výtěžku je nevýhodou sacharidů i velké množství asociované vody, která nefunkčně zvyšuje hmotnost organismu. b) →dQ = 3,3∙100∙30 = 9900 J = 0,25 g Zásoba 2 g tukové tkáně pokrývá energetickou potřebu křečka při dehibernaci Př. 2.7 Člověk o hmotnosti 70 kg produkuje po nasycení v klidu přibližně 8 MJ tepla za den (basální metabolismus) a) Odhadněte, o kolik stupňů by vzrostla za den tělní teplota člověka při zamezení výměny tepla s okolním prostředím. Průměrné měrné teplo lidského těla je asi 4 kJ∙K^-1∙kg^-1 b) Jedním z důležitých mechanismů odvodu tepla z těla do okolí je vypařování vody. Vypočtěte, kolik vody by muselo být odpařeno za den, kdyby teplota byla regulována pouze tímto mechanismem. Molární skupenské teplo vypařování vody je 44 kJ∙mol^-1 c) Slunce má hmotnost 1,99∙10^30 kg a za den vyzáří 3,37∙10^31 J elektromagnetické energie. Srovnejte měrný tepelný výkon člověka a Slunce a pokuste se vysvětlit příčiny rozdílu obou hodnot. Řešení: a) Q = m∙c∙Δt → Δt = = 28,57 °C b) → → = 181,2 mol m = n[vyp] ∙Mr = 181,2 ∙18 = 3261,6 g = 3,26 kg c) Měrný tepelný výkon člověka: = = 1,14∙10^5 J∙den^-1∙kg^-1 Měrný tepelný výkon Slunce: = = 16,9 J∙den^-1∙kg^-1 ^ ^ Př. 2.8 Glukosa -6-fosfát byl pomocí glukosa-6-fosfátfosfatasy hydrolyzován při pH 7 a 25 °C za vzniku glukosy a anorganického fosfátu. Koncentrace G-6-P na počátku reakce byla 0,1 mol∙dm^-3. V rovnováze zůstalo zachováno pouze 0,05% výchozí látky. Vypočtěte rovnovážnou konstantu a příslušnou standardní změnu Gibbsovy energie pro rozklad G-6-P a pro jeho syntézu z glukosy a anorganického fosfátu. Řešení: Glukosa-6-fosfát →glukosa + Pi K[hydrolysa] = 0,05 % výchozí látky……5∙10^-5 mol∙dm^-3 glukosy -6-P (v rovnováze) 99,95 % produktů………0,09995 mol dm^-3 glukosy a 0,09995 mol dm^-3 Pi (v rovnováze) K[hydrolysa] = = 199,8 = = -8,314∙298∙5,297 = -13,124 kJ∙mol^-1 = -ΔG^0[syntéza] [ ] Př. 2.18 Při biosyntéze bílkovin je velmi důležité, aby se správná t-RNA vázala na aminoacyl-t-RNA-ligasu příslušnou dané aminokyselině. V případě izoleucin-t-RNA-ligasy z E coli je vazba t-RNA^Ile charakterizována hodnotami ΔH^0´ = 0 kJ mol^-1 a ΔS^0´= 142 J mol^-1∙K^-1. vazbě t-RNA^Val za stejných podmínek odpovídají hodnoty ΔH^0´ = 33,4 kJ mol^-1 a ΔS^0´= 225,7 J mol^-1∙K^-1. Vypočtěte poměry obou příslušných vazebných konstant (tzv. preferenční faktor) pro správnou a nesprávnou t-RNA při 293 a 313 K za předpokladu, že hodnoty ΔH^0´ a ΔS^0´ jsou v tomto teplotním intervalu konstantní. Řešení: t-RNA^Ile při 293 K ΔG^0 = ΔH^0 - T ΔS^0 = 0-293∙142 = -41606 J mol^-1 ΔG^0 = -RT lnK → -41606 = -8,314∙293∙lnK → lnK = = 17,08 →K =e^17,08 = 2,62∙10^7 t-RNA^Val při 293 K ΔG^0 = ΔH^0 - T ΔS^0 = 33,4∙10^3-293∙225,7 = -32730,1 J mol^-1 ΔG^0 = -RT lnK → -32730,1 = -8,314∙293∙lnK → lnK = = 13,436 →K =e^13,436= 6,84∙10^5 = 38,3 Analogicky se vypočítá t-RNA^Ile a t-RNA^Val při 313 K a vyjde: t-RNA^Ile při 313 K ΔG^0 = -44446 J mol^-1 K = 2,62∙10^7 ^ t-RNA^Val při 313 K ΔG^0 = -37244,1 J mol^-1 K = 1,64∙10^6 = 15,86 Př. 2.24 Text Box: pyruvátkinasa Reakce: fosfoenolpyruvát + ADP pyruvát + ATP je jedním z hlavních zdrojů ATP pro zralou červenou krvinku; neobsahuje totiž mitochondrii, a tudíž v ní neprobíhá citrátový cyklus ani aerobní fosforylace. Pro 37 °C byla určena ΔG^0‘ =^ -32,6 kJ mol^-1. In vivo jsou koncentrace ATP, ADP a fosfoenolyruvátu udržovány na hodnotách 1850, 138 a 23 µmol∙dm^-3. Určete maximální koncentraci pyruvátu, při níž reakce probíhá zleva doprava. Řešení: mol∙dm^-3 ^ Fyziologická koncentrace pyruvátu v erythrocytech je 51 µmol∙dm^-3, tedy více než o čtyři řády nižší. Př. 2.25 V srdci krysy promývaném živným roztokem o teplotě 308 K byly nalezeny následující koncentrace metabolitů (mol∙dm^-3): [fruktosa-6-fosfát] = 60∙10^-6, [fruktosa-1,6-bisfosfát] = 9∙10^-6, [ATP] = 5,3∙10^-3, [ADP] = 1,1∙10^-3 a [AMP] = 60∙10^-6. Hodnota ΔG^0‘ reakce katalyzované^ fosfofruktokinasou je rovna -17,7 kJ mol^-1, tato hodnota pro reakci katalyzovanou adenylátkinasou (příklad 2.22) činí +2,1 kJ mol^-1. Vypočítejte ΔG pro obě reakce in vivo. Posuďte možnost uplatnění obou enzymů při regulaci metabolismu. Řešení: Reakce: Fruktosa-6-fosfát + ATP → fruktosa-1,6-bisfosfát + ADP ΔG[1] = -26585,7 J mol^-1 = -26,6 kJ mol^-1 ^ Reakce: 2ADP → ATP+AMP ΔG[2] = -153,5 J mol^-1 = -0,153 kJ mol^-1 ^ Za podmínek in vivo je fosfofruktokinasová reakce značně vzdálena od rovnováhy; díky tomu se mohla stát významným regulačním bodem glykolysy. Adenylátkinasová reakce je naproti tomu téměř v rovnováze a její uplatnění jako regulačního stupně není pravděpodobné. Př. 2.27 Pro redoxní pár NAD^+/NADH činí ΔE^0‘ (pro pH 7) -0,32 V, pro oxalacetát/malát -0,175 V. Pro pH 6 jsou hodnoty ΔE^0‘[NAD]^+[/NADH] = -0,29 V a ΔE^0’[oxalacetát/malát] = -0,116 V. Vypočítejte rovnovážnou konstantu pro oxidaci malátu pomocí NAD^+ při pH 7 a pH 6. Reakce: malát^2- + NAD^+ → oxalacetát^2- + NADH + H^+ ^ Pro pH 7: ΔE^0 = -0,32- (-0,175) = -0,145 V ΔG^0 = -z∙F∙ΔE^0 ΔG^0 = -2∙96485∙ (-0,145) = 27980,65 J mol^-1 ΔG^0 = -RTlnK 27980,65 = -8,314∙298∙ln K K = 1,24∙10^-5 ^ Pro pH 6: ΔE^0 = -0,29- (-0,175) = -0,174 V ΔG^0 = -z∙F∙ΔE^0 ΔG^0 = -2∙96485∙ (-0,174) = 33576,78 J mol^-1 ΔG^0 = -RTlnK 33576,78 = -8,314∙298∙ln K K = 1,30∙10^-6 Nekovalentní interakce Př. 4.1 Pokuste se předpovědět pořadí, ve kterém se budou vymývat z kolony Sephadexu G-200 následující bílkoviny: cytochrom-c (RMH = 96000), ATP-sulfurylasa (RMH = 440000), glukosaoxidasa (RMH = 154000) a xanthinoxidasa (RMH = 300000). Jaké faktory, kromě velikosti molekul, ovlivňují eluční objemy při gelové chromatografii na Sephadexu? Řešení: Uvažujeme-li gelovou chromatografii, separace zde probíhá na základě velikostí pórů gelu. Molekuly větší než póry gelu nemohou pronikat do pórů a procházejí přes kolonu stejnou rychlostí jako mobilní fáze. Separace: 1) ATP-sulfurylasa (RMH = 440000) 2) xanthinoxidasa (RMH = 300000) 3) glukosaoxidasa (RMH = 154000) 4) cytochrom-c (RMH = 96000) Kromě velikosti molekul mají na separaci vliv další faktory, a to: a) tvar molekul – nesférické molekuly mají zdánlivě větší objem a vytékají z kolony dříve b) hydrofobita molekul – hydrofobní části na povrchu bílkoviny často intergaují s nosičem a zyvšují tak eluční objem c) náboj molekul – Sephadex někdy obsahuje malé množství COO- skupin, které mohou zpomalovat pohyb bílkovin s vysokým kladným nábojem Př. 4.2 Roztok obsahující kyselinu asparagovou (pI = 2,98), glycin (pI = 5,97). threonin (pI = 6,53), leucin (pI = 5,98) a lysin (pI = 9,74) v citrátovém pufru pH 3,0 byl nanesen na sloupec Dowex -50 (katex), který byl uveden do rovnováhy se stejným pufrem. Sloupec pak byl dále tímto pufrem promýván. V jakém pořadí tyto aminokyseliny ze sloupce vytekly? Řešení: 1. kyselina asparagová (pI = 2,98) Neutrální aminokyseliny se separují podle stoupající hydrofobity, tj v pořadí: threonin, glycin, leucin 2. threonin (pI = 6,53), jedná se o polární, hydrofilní amk (viz vzorec) Text Box: threonin Text Box: glycin 3. glycin (pI = 5,97), jedná se o nepolární, hydrofobní amk (viz vzorec) 4. leucin (pI = 5,98), jedná se o nepolární, hydrofobní amk (viz vzorec) Text Box: leucin 5. lysin (pI = 9,74) Př. 4.10 Změna enthalpie spojená s denaturací (rozbalováním) molekuly ribonukleasy při pH 6 je +209 kJ mol^-1. Změna entropie při tomto procesu je +554 J mol^-1∙K^-1. a) Vypočtěte Gibbsovu energii tohoto procesu při teplotě 298 K b) Při jaké teplotě lze očekávat, že denaturace proběhne spontánně? Zhodnoťte velikosti zadaných i vypočtených číselných hodnot. Řešení: a) ΔG = ΔH - T ΔS ΔG = 209∙10^3-298∙554 ΔG = 44 kJ mol^-1 a)Z uvedeného vyplývá, že ΔG > 0, tj. denaturace neproběhne spontánně. To při teplotě 25 °C ani není možné. b) Aby mohla denaturace proběhnout spontánně, musí ΔG < 0 ΔH - T ΔS < 0 209∙10^3 -554T < 0 T > 377 K (tj. ~ 100 °C) → je zde příliš malá pravděpodobnost, aby konformace enzymu RNasy byla stabilní až do bodu varu vody. Ve skutečnosti se teplota přechodu této bílkoviny pohybuje, podobně jako u „běžných“ bílkovin, mezi 50 a 70 °C. Elektrochemie Př. 6.8 „Glycin je možno zakoupit jako glycinhydrochlorid, isoelektrický glycin (zvaný též glycin-volná base) nebo jako glycinát sodný (pK[1] = 2,34; pK[2] = 9,6). a) Napište vzorce těchto tří forem b) Vypočtěte pH jejich roztoků o koncentraci 0,1 mol∙dm-3 c) Představte si, že potřebujete gylcinhydrochlorid (Gly.HCl) a v laboratoři máte jen isoelektrický glycin. Popište stručně nejjednodušší postup, pomocí něhož byste si mohli pevný Gly.HCl připravit. Text Box: glycinhydrochlorid Řešení: a) Cl^-NH[3]^+-CH[2]-COOH Text Box: isoelektrický glycin NH[3]^+-CH[2]-COO^- Text Box: glycinát sodný ^ NH[2]-CH[2]-COONa^+ ^ b) Glycinhydrochlorid pH slabé kyseliny = = 1,67 Isoelektrický glycin pH = pI = = 5,97 Glycinát sodný pK[a]+pK[b] = 14 → pK[b] = 14 – pK[a ]→ pK[b] = 14-9,6 = 4,4 → pH = 11,3 c) Připraví se nasycený roztok glycinu ve zředěné HCl za horka. Po ochlazení se odfiltruje matečný roztok a vzniklý pevný Gly.HCl se vysuší v exsikátoru nad pevným NaOH. Př. 6.9 Vypočtěte isoelektrický bod dipeptidu histidyl-histidinu, jsou-li hodnoty disociačních konstant při 25 °C následující: -COOH: pK[1] = 2,25 Imidazolové skupiny: pK[2] = 5,6 a pK[3] = 6,8 -NH[3]^+: pK[4] = 7,8 Řešení: Aminokyselina His (Arg, Lys) obsahuje dvě bazické skupiny a je nutno rozhodnout, které dvě skupiny disociují v okolí isoelektrického bodu a z nich vypočítat kýžený průměr. Bazické aminokyseliny: Uvažujme ty skupiny, které se titrují na obě strany od izoelektrického bodu: = = 7,3 Př. 6.10 Kyselina octová byla postupně ředěna tak, že první zkumavka obsahovala 0,32M kyselinu, druhá 0,16 M, třetí 0,08M atd.; objem každé zkumavky byl 5 ml. Do každé zkumavky byl přidán 1 ml roztoku kaseinu v 0,1 M octanu sodném. Nejvíce kaseinu se vysráželo ve čtvrté zkumavce. Jaký je přibližně isoelektrický bod kaseinu, uvažujeme-li pouze isoelektrickou precipitaci? pK[a] kyseliny octové je 4,75. Řešení: 1. zkumavka: 0,32M kys. octová (5 ml)+1 ml kaseinu v 0,1M octanu sodném; V celk. = 6 ml 2. zkumavka: 0,16M kys. octová (5 ml)+1 ml kaseinu v 0,1M octanu sodném; V celk. = 6 ml 3. zkumavka: 0,08M kys. octová (5 ml)+1 ml kaseinu v 0,1M octanu sodném; V celk. = 6 ml 4. zkumavka: 0,04M kys. octová (5 ml)+1 ml kaseinu v 0,1M octanu sodném; V celk. = 6 ml. Ve 4. zkumavce se vysráželo nejvíce kaseinu. Jaký je pI kaseinu v izoelektrické precipitaci? Izoelektrická precipitace: každý protein má jiné pI a vysráží se ze směsi proteinů v roztoku, který má pH = pI. Složení 4. zkumavky: 0,04M kys. octová (5 ml) 1 ml kaseinu v 0,1M octanu sodném V celk. = 6 ml Koncentrace 0,04M CH[3]COOH (5 ml) v 6 ml: 0,033 M CH[3]COOH Koncentrace 0,1M CH[3]COONa (1 ml) v 6 ml: 0,0166M CH[3]COOH = = 4,45 pH = pI = 4,45 Př. 6.11 Popište přípravu 1 litru 0,2M acetátového pufru o pH 5,0, vycházíme-li z pevného trihydrátu octanu sodného (RMH = 136) a 1 M kyseliny octové (pK[a] = 4,75). → → → → → 1,77 c[a] = c[s] c[s] + c[a ]= 0,2 mol/l → 1,77 c[a]+c[a] = 0,2 → 2,77c[a] = 0,2 → c[a] = 0,072 mol/l CH[3]COOH c[s] = 1,77 c[a ] → c[s] = 1,77∙0,072 = 0,127 mol/l c[1]∙V[1] = c[2]∙V[2] 1∙V[1] = 0,072∙1 V[1] = 0,072 l = 72 ml CH[3]COOH m = c∙V∙Mr m = 0,127∙1∙136 m = 17,3 g CH[3]COONa Pro přípravu 1 l 0,2M acetátového pufru je potřeba 72 ml CH[3]COOH a 17,3 g CH[3]COONa, které se doplní vodou na objem 1 litr. Př. 6.13 Vypočítejte iontovou sílu pufru složeného z lysinu (c= 0,03 mol∙dm-3, pK1 = 2,18) a HCl o pH 2,18. Lysin vytváří 4 disociované formy HCl o pH 2,18 pH = -log [H^+] 2,18 = -log [H^+] [H^+] = 10^-2,18 [H^+] = 6,6∙10^-3M → I = 0,067 M