VÝZNAM NEKOVALENTNÍCH INTERAKCÍ V BIOLOGICKÝCH SYSTÉMECH Iveta Třísková Biologické jevy závislé na nekovalentních interakcích 2 • 1) biopolymery (bílkoviny, nukleové kyseliny) – základní strukturní i funkční aparát biologických systémů – lineární polymery tvořené stavebními jednotkami (AMK, nukleotidy) svinuty do trojrozměrného tvaru – tzv. nativní struktura - o svinutí lineárního řetězce do správné podoby rozhodují slabé meziatomové interakce nekovalentní povahy(intramolekulární, intermolekulární) • 2) přenos informace: a) přenos genetické informace ve směru DNA→RNA→protein, kdy rozhodující roli hraje párování komplementárních bází prostřednictvím vodíkových vazeb b) přenos informace mezi buňkami pomocí hormonů a neurotransmiterů, které se komplexem nekovalentních interakcí váží na receptorové struktury c) chemická komunikace mezi organismy d) imunita 3 Biologické jevy závislé na nekovalentních interakcích • 3) enzymová katalýza – vazba substrátu do aktivního místa enzymu, jeho správné umístění ve vztahu ke katalytickým skupinám a sled konformačních změn v molekule enzymu podmíněny souborem nekovalentních interakcí mezi enzymem a substrátem • 4) na nekovalentních interakcích založeny i všechny biologické děje, jejichž podstatou je vznik nadmolekulárních útvarů (kvarterní struktura bílkovin,multienzymové jednotky, nukleosomové komplexy histonů s DNA, ribosomy, lipoproteinové částice, biomembrány) 4 Proč nekovalentní interakce? Vznik a rozštěpení kovalentních vazeb (vysoká vazebná energie či vysoké aktivační energie rozpadu) – IREVERSIBILNÍ děje Pro biologické děje je nutné, aby intramolekulární či intermolelulární interakce zůstaly REVERSIBILNÍ PROČ?  vnitřní dynamika molekul biopolymerů oddělování a spojování vazebných míst při přenosu informace oddělení molekuly z vazebného místa enzymu u nadmolekulových útvarů korelace mezi pevností vazeb a biologickou funkcí Typy nekovalentních interakcí v živých systémech 5 Typ interakce Příklad Vazebná energie* (kJ/mol) Vodíkové vazby: voda (led) -O- H…O= 17 Peptidové vazby =N H…O=C 15 Mezi neutrální a nabitou skupinou -COO-…HO -CH2 15 Elektrostatické interakce** ion-ion -COO-…+H3N- 20-30 Interakce dvou permanentních dipólů 2 Londonovy disperzní inetrakce Mezi dvěma alifatickými atomy C 0,11 Patrové interakce Mezi dvěma aromatickými kruhy Phe 6 Hydrofobní interakce Mezi dvěma methylovými skupinami 1,2 Mezi dvěma postranními řetězci valinu 6 *Pro srovnání, střední hodnota energie vazby C-H v molekule methanu je 416 kJ·mol-1 ** Pro prostředí s hodnotou relativní permitivity 4, pibližně odpovídající nepolárnímu prostředí uvnitř bílkovinné globule Rozdělení a charakterizace nekovalentních interakcí 6 • Elektrostatické (coulombické) interakce • Vodíkové vazby • Van der Waalsovy interakce • Hydrofobní interakce Elektrostatické interakce 7 • Interakce, které se řídí Coulombovým zákonem • Dvě podskupiny: jak ovlivňují stabilitu terciární struktury bílkovin • Klasické (nespecifické) elektrostatické interakce • Specifické elektrostatické interakce 2 21 0 r qq 4 1 F   ε0: permitivita vakua (8,854.10-12 C2.N-1.m-2) ε: relativní permitivita prostředí Klasické (nespecifické) elektrostatické interakce 8 • Bílkovina - polyelektrolyt nesoucí ve svém řetězci nabité funkční skupiny, jejichž náboj závisí na pH; vliv náboje se projeví v extrémních hodnotách pH – v molekule převažují kladné náboje (kyselá oblast) nebo záporné (zásaditá) oblast – elektrostatické odpuzování; tento efekt mizí pouze v okolí isoelektrického pH • s klesajícím nebo rostoucím pH destabilizující vliv na nativní bílkovinu (ve sbalené struktuře se zvyšuje hustota náboje jednoho znaménka) → dochází k rozbalení nativní struktury v silně kyselé nebo zásadité oblasti – souhlasně nabité skupiny se od sebe vzdálí Specifické elektrostatické interakce 9 • Iontové páry (solné můstky) • opačně nabité skupiny v sousedství → elektrostatické interakce → výsledná elektrostatická síla má stabilizující vliv na nativní strukturu bílkoviny • solný můstek má ještě další význam – elektrochemie – vodivé spojení dvou poločlánků pomocí nasyceného roztoku elektrolytu Vodíkové vazby 10 • klasický model: slabě kyselý donor D-H interaguje prostřednictvím atomu vodíku s volným elektronovým párem akceptoru A → uspořádání D-H…A; obvykle lineární, ale existuje i pojem ohnutá vodíková vazba – není rigidní struktura • nejdůležitější biogenní atomy schopné podílet se na vodíkové vazbě: O, N a S • vodíkové vazby ovlivňují strukturu vody • Význam vodíkových vazeb pro strukturu a stabilitu bílkovin: • 1) intramolekulární vodíkové vazby: zpevňující detaily sekundárních struktur, helixů nebo skládaných listů • 2) intermolekulární vodíkové vazby s okolními molekulami vody Intermolekulární vodíkové vazby 11 • molekula vody má zde výjimečnou schopnost poskytnout dva atomy vodíku a dva volné elektronové páry atomu kyslíku – donory (resp. akceptory) pro vodíkové vazby • tvorba vodíkových vazeb s nativní molekulou bílkoviny i její rozbalenou formou (stabilizace proti sbalení) Vodíkové vazby 12 • nejsou dominantními pro stabilizaci molekuly bílkoviny; naopak významnější pro denaturovanou (rozbalenou) formu • po vytvoření trojrozměrné nativní struktury (pro vodu nepropustné) – stabilizující vliv vodíkové vazby • vliv rozpouštědla na vodíkové vazby v molekule bílkoviny: záleží na interakci přidané sloučeniny s bílkovinou: např. kyselina mravenčí: váže se na peptidovou vazbu, rozbalení řetězce • malé alifatické alkoholy – podporují tvorbu helixu • alkoholová denaturace - destabilizace molekuly jako celku; stabilizace pouze jejích helixů  vodíkové vazby nejsou dominantní při vzniku nativní struktury, ale jakmile se tato struktura vytvoří, přispívají k její stabilitě  bílkoviny x NK – u NK vodíkové vazby součástí rozpoznávacího mechanismu mezi bázemi Van der Waalsovy interakce 13 • a) Interakce permanentní dipól – permanentní dipól (interakce van der Waalsovy-Debyeovy) • dipolární charakter molekul; v permanentním dipólu převažuje v jedné části molekuly (funkční skupiny) dílčí kladný náboj q+, na opačné části kompenzován stejně velkým dílčím záporným nábojem q• dipólový moment: µ = q·l (1D – Debye); 1D = 3,3·10-30 C·m-1 • Př. dipólový moment vody µ = 1,84 D, plynný chlorovodík 1,03 D • orientace dvou dipólů navzájem opačnými konci k sobě – interakce • energie interakce Ed-d dána vztahem: • Četný výskyt těchto interakcí v biomolekulách 62 0 2 2 2 1 dd kTr)4(3 2 E    µ1, µ2: elektrické dipólové momenty; ε0: permitivita vakua; r: vzdálenost; k: Boltzmannova konstanta Van der Waalsovy interakce 14 • b) Interakce permanentní dipól – indukovaný dipól (interakce van der Waalsovy – Keesomovy) • podstatně slabší interakce, než interakce permanentní dipól – permanentní dipól • Molekula, která je dipólem, indukuje dipól v jiné molekule • Energie interakce Ed-id je poté dána vztahem: • Př. karbonylová skupina indukující dipól v methylové skupině. V ní je indukována převaha kladného náboje na vodících, záporného na atomu uhlíku 62 0 2 21 2 12 idd r)4( E     µ1, µ2: elektrické dipólové momenty; ε0: permitivita vakua; r: vzdálenost; α: polarizovatelnost molekuly Van der Waalsovy interakce 15 • c) Londonovy disperzní interakce (interakce van der Waalsovy – Londonovy) • Nastává i tehdy pokud žádná z molekul není permanentním dipólem • Disperzní energie Edisp. je dána přibližným vztahem: • Velmi slabé, zcela nespecifické interakce – při těsném přiblížení, k němuž dochází v jádrech bílkovinných struktur, může každý atom interagovat se svými nejbližšími „nekovalentními“ sousedy – obrovská četnost interakcí, nezanedbatelný vliv na stabilitu struktury bílkovin • Značný podíl v interakcích bílkoviny se stericky komplementárními ligandy • Př.: interakce v molekule bílkoviny – dvě methylové skupiny -CH3…H3C- v daném postavení. Jedna z nich zde může mít dočasně převažující záporný náboj na uhlíku, druhá na vodících 6 21 21 2 0 21 .disp r)II()4(2 II3 E      I1, I2: ionizační energie molekuly; ε0: permitivita vakua; r: vzdálenost; α: polarizovatelnost molekuly Van der Waalsovy interakce 16 • d) π – π interakce (patrové interakce) • Vzájemná interakce π – elektronových systémů, které jsou lokalisovány nad i pod aromatickými kruhy • Stabilizace dihelixů DNA i některých úseků RNA Hydrofobní interakce 17 • Klíčový význam pro stabilitu bílkovinné molekuly • Dnes stále předmětem výzkumu • Podstata – jedním z partnerů v těchto interakcích je voda • Aminokyseliny (AMK) s hydrofobním postranním řetězcem : fenylalanin, leucin… • AMK s hydrofilním postranním řetězcem: kyselina glutamová, asparagová, lysin… • Pokusy s jednoduchými sloučeninami – tendence hydrofobních sloučenin vytvářet ve vodě agregáty (snížení kontaktu s „nepřátelským“ rozpouštědlem, vytvoření termodynamicky stabilních struktur) • Bílkoviny : hydrofobní AMK soustředěny uprostřed klubka (globule) – vytváří zde tzv. hydrofobní jádro („hydrofobic core“) Co jsou hydrofobní interakce a jak jsou řízeny? 18 • Tři základní přístupy: • 1) hydrofobita – přenos nepolární sloučeniny do vodného roztoku; hydrofobní je ta částice, která dává přednost nepolárnímu prostředí před vodným • 2) hydrofobita – přenos nepolární sloučeniny do vodného prostředí pouze tehdy, pokud se přitom pozoruje charakteristická teplotní závislost termodynamických veličin • 3) hydrofobita vztahována k určitým typům modelů, jejichž obecným rysem je vyšší uspořádanost molekul vody v okolí molekul rozpuštěné látky Teplotní závislost hydrofobních interakcí – jak se liší od normálních roztoků? 19 •Vycházíme z formulace ad 2) •Představa ideálního roztoku – kapalné složky A a B, při mísení A do B nedochází k výrazné změně struktury kapaliny B a energie interakce dvojic molekul A-A, A-B a B-B jsou stejné •Většina systémů odlišná od ideálního chování: extrémní případ dvě nemísitelné kapaliny A a B - Gibbsova energie přenosu B do A (ΔG > 0) má velký kladný enthalpický člen (ΔH) vyšší než entropický (T ΔS)(je kladný vždy) – viz. obrázek A → malá změna tepelné kapacity cp → změna enthalpie a entropického členu nezávisí na teplotě; ani změna Gibbsovy energie na teplotě nezávisí. Schematické znázornění 20 Schematické zobrazení teplotní závislosti energetických veličin pro mísení dvou jednoduchých málo mísitelných kapalin (panel A) a pro mísení oleje (nepolární sloučenina) s vodou (panel B) Panel A: malá změna tepelné kapacity (Δcp)→ změna enthalpie a entropického členu nezávisí na teplotě; ani změna Gibbsovy energie na teplotě nezávisí. Panel B: velká a kladná změna tepelné kapacity →závislost změn enthalpie a entropie na teplotě, hodnota ΔG se s teplotou mění nelineárně-prochází maximem a na obě strany klesá; při 140 °C (minimální rozpustnost nepolární látky ve vodě) – nejpozitivnější ΔG – největší hydrofobita Hydrofobní interakce 21 • I polární skupiny (peptidová vazba) se mohou podílet na vzniku hydrofobní vazby Poly –L – Ala (viz. schéma)-homopolymer tvořen opakující se sekvencí [(-NH – CH(CH3)-CO-], kde skupiny >C=O a >NH jsou partnery pro vznik vodíkových můstků (neuspořádaná konformace A). Může také vzniknout α – helikální struktura (konformace B), kde >C=O a >NH jsou vysyceny tvorbou intramolekulárních vodíkových můstků Obecné znaky prostorového uspořádání biopolymerů 22 • Lineární řetězce biopolymerů s výjimkou mRNA, částečně zásobních polysacharidů uspořádány do unikátního prostorového tvaru, který podmiňuje jejich biologickou funkci • Dva fenomény: • 1) biopolymery vybudovány z chirálních stavebních jednotek • 2) prostorové uspořádání molekul není určeno pouze geometrickým uspořádáním center, z nichž vycházejí jednotlivé kovalentní vazby . Jednoduché vazby se mohou volně otáčet a molekula zaujímá různé konformace Zákonitosti prostorového uspořádání biopolymerů 23 • a) prostorové uspořádání biopolymeru zakódováno v jeho kovalentní struktuře – řetězec polymeru svinut tak, aby jeho konformační Gibbsova energie byla co nejmenší • b) hierarchické prostorové uspořádání biopolymerních řetězců – sekundární, supersekundární, doménová, terciární, kvarterní a nadmolekulární struktura • c) prostorové uspořádání biopolymerů závisí na interakcích s okolím: • 1) hydrofobní interakce (podstatná role pro energetiku svinování polymerů) závislé na struktuře a entropických vlastnostech rozpouštědla • 2) hydratace povrchových struktur biologických makromolekul ve vodných prostředích → komplexy hydrofilní skupina – voda (posunovány směrem k asociaci díky vysoké koncentraci vody) Zákonitosti prostorového uspořádání biopolymerů 24 • d) kooperativita struktury biopolymerů – makromolekuly tvoří kompaktní vysoce stěsnané částice, které jsou svými povrchovými strukturami oddělené od okolí. • Průměrná kooperativita – pravděpodobnost s jakou změní (n+1)tý zbytek (amk, nukleotid) svou konformaci jako důsledek změny konformace zbytku n-tého • Zcela nekooperativní systémy – nulová pravděpodobnost (náhodná změna konformací); naopak ideální krystal je struktura, která má při tání kooperativitu rovnu 1 (roztaje celý krystal) • Molekuly biopolymerů (DNA a rozpustné bílkoviny) se blíží chování ideálního krystalu • Významnou charakteristikou kooperativity je náhlá změna prostorového uspořádání (denaturace biopolymerů) • e) biopolymery jako konformačně – dynamické struktury (molekulová dynamika): funkce makromolekul spojena se změnami jejich prostorového uspořádání – posuny podjednotek na úrovni kvarterní struktury (hemoglobin, allosterické enzymy); změny terciární struktury (jednoduché enzymy , receptory); silné konformační změny spojené s transkripcí nebo replikací DNA Stabilita, svinování a denaturace biopolymerů 25 • ztráta nativní konformace biopolymeru pod vlivem denaturačního tlaku (zvýšení teploty; iontové síly; změna pH; přítomnost denaturačních činidel – močovina, guanidinhydrochlorid) a přechod do jiné konformace • denaturace: každá podstatná změna prostorového uspořádání biopolymeru, která vede ke ztrátě jeho biologické aktivity • 1) Podstatná změna prostorového uspořádání: vlivem denaturačního tlaku mění biopolymery svou konformaci; ideální fyzikálně – chemická denaturace (plně denaturovaný stav) – tzv. neuspořádané (statistické) klubko (random coil); vyloučení všech nekovalentních stabilizujících interakcí a stejně jsou pravděpodobné všechny konformace neodporující van der Waalsovým prostorovým požadavkům pro jednotlivé atomy či skupiny; existence denaturovaných stavů, kde biopolymer nemá již nativní strukturu (nemůže plnit svou biologickou funkci), ale jeho struktura je do určité míry stabilizovaná→ neúplně denaturované stavy • 2) Nevratné změny kovalentní struktury vyvolané UV zářením, fotooxidací, chemickou modifikací – nejsou zahrnuty do kategorie fyzikálně-chemické denaturace, ale jsou příčinou ztráty biologických funkcí Stabilita, svinování a denaturace biopolymerů 26 • 3) Ztráta biologické aktivity: konformační změny spojené s rozpletením DNA při replikaci nebo transkripci; vazba nekompetitivního inhibitoru na enzym (nelze mluvit o denaturaci) • přechod mezi nativním a denaturovaným stavem biopolymeru lze v důsledku kooperativity popsat rovnováhou: N ↔ D, charakterisovanou rovnovážnou konstantou KD dle vztahu: • denaturační dvoustavový přechod výsledkem souhry protichůdných stabilizujících a destabilizujících stavů • stabilizující: všechny typy nekovalentních interakcí, van der Waalsovy a vodíkové vazby • destabilizující: růst entropie v důsledku poklesu neuspořádanosti molekuly bílkoviny jako celku; se vznikem náhodně svinutého řetězce roste počet možných konformací; hydratační obal v okolí nepolárních skupin • denaturační přechod biopolymerů N ↔ D dobře experimentálně přístupný (cirkulární dichroismus, fluorescence, absorpční spektrofotometrie, viskozimetrie)    N D KD  Svinování bílkoviny 27 • C. Levinthal – pokus o prokázání, že svinování není náhodný proces; předpoklad, že v proteinu s n AMK má každý z 2n torzních úhlů 3 možné stabilní konformace – protein (peptidový řetězec) má 10n možných konformerů • Ve skutečnosti: mnohem více konformerů, neboť Levithalova úvaha pomíjí postranní řetězce • Př.: Kdyby bílkovina o 100 AMK zkoušela při svém vzniku všechny možné konformace rychlostí 1013 konformací/sec, pak by všechny dostupné možnosti byly otestovány za 1087 sec. Stáří vesmíru je však pouze cca 6.1017 sec. → Levinthalův paradox → konformace vzniká cíleně ve více krocích • Na počátku vznik krátkých periodických segmentů (α-helixy, β-struktury) (8-15 AMK, v rychlém sledu vznikají a zase zanikají); zůstávají pouze ty úseky se strukturou podobnou nativní, a kolem nich se peptidový řetězec formuje do konečné podoby • Bílkoviny s doménovou strukturou procházejí po spojení více domén, podobou „roztavené globule“ („molten globule“) (hydrofobní postranní řetězce jsou v kontaktu s rozpouštědlem) • Následují malé konformační změny → nativní struktura Kalorimetrie bílkovin 28 • Energetická bilance nekovalentních interakcí • Kalorimetrie – jediná experimentální technika umožňující získat přímo termodynamická data • Teplotní (tepelná) denaturace bílkovin – nejběžnější biofyzikálně – chemické měření (jasná souvislost mezi enthalpií a teplotou) • Informaci o energetické podstatě struktury bílkoviny lze získat pouhou změnou teploty dle vztahu: • Diferenciální skenovací mikrokalorimetrie (differential scanning microcalorimeters, DSM) – eliminace vlivu tepelné kapacity rozpouštědla p p T H c          Definice tepelné kapacity při konstantním tlaku Záznam DSM (závislost specifické tepelné kapacity při konstantním tlaku) lysozymu z vaječného bílku při pH 4,5 Diferenciální mikrokalorimetr 29 • Dvě identické cely (Au kapiláry) – při měření se jedna cela naplní roztokem bílkoviny, druhá stejným objemem použitého rozpouštědla; kontinuální zahřívání na stejnou teplotu • Mikrokalorimetry poskytují údaje o rozdílu tepelných kapacit obou cel vzhledem ke standardu (použité rozpouštědlo) Provedení experimentu DSM 30 • 1) dokonale stejný objem roztoků; chyba v náplni kalorimetrických cel nesmí přesáhnout 10-6 ml; nepřítomnost bublinek plynu (měření při přetlaku dusíku) • 2) zředěné roztoky bílkovin (eliminace interakcí mezi molekulami bílkovin) • 3) volba pufru: vhodné jsou takové pufry, jejichž disociační tepla jsou co nejmenší, aby příliš neovlivňovala naměřené hodnoty ΔH • 4) bílkovina musí být v daném rozpouštědle rozpustná v celém zkoumaném teplotním rozsahu; přechody bílkoviny mezi různými konformačními stavy vyvolané rostoucí teplotou by měly být reversibilní – nejlépe malé bílkoviny s molekulovou hmotností do 40 kDa s jednou doménou • 5) v těchto kalorimetrech nelze dosáhnout dokonalou tepelnou rovnováhu; roztok není možné míchat – problém – roztok bílkoviny má vyšší viskozitu než voda a mechanickým mícháním by vznikalo nekontrolovatelné množství Jouleova tepla, které by mohlo přesáhnout naměřený tepelný efekt • 6) kontinuální měření tepelné kapacity • 7) výhodou kapilární cely: teplotu lze po dosažení zvolené hodnoty opět definovaně snižovat – je možné zabývat se reversibilitou denaturačního přechodu • Metoda přináší dobré výsledky i při studiu tepelné stability nukleových kyselin (ostrý denaturační přechod) Interakce bílkovin s ligandy 31 • Molekula bílkoviny na sebe většinou dočasně a více či méně specificky váže ligandy (enzym substráty a efektory; receptor agonisty; transportní bílkoviny přenášené látky) • Nevytváří se kovalentní vazba bílkovina – ligand (vratná vazba) • Ligand – molekula nebo ion, pro kterou je na molekule bílkoviny vhodné vazebné centrum; nejjednodušší ligandy – ionty H+ a OH- (velmi specifická interakce s bílkovinou→jednoznačně definované disociovatelné funkční skupiny); vysoce specifická interakce enzym – substrát • typické ligandy – malé anorganické ionty, které mohou elektrostaticky interagovat s jakoukoli opačně nabitou skupinou v molekule bílkoviny nebo s polárním uskupením → přidáme – li k roztoku bílkoviny elektrolyt, lze předpokládat, že jeho ionty se budou vázat na bílkovinu Interakce bílkovin s ligandy 32 • Prof. G. Scatchard – shrnutí problematiky týkající se interakcí biopolymer – ligand do čtyř otázek: 1) Kolik? 2) Jak pevně? (hodnota vazebné konstanty) 3) Kde? 4) Proč? Ad 1) a 2) lze vysvětlit fyzikálně – chemickými metodami Ad 3) buď triviální (vazba kyslíku na hemoglobin); často je třeba znát prostorové uspořádání molekuly biopolymeru-sterické i energetické možnosti jednotlivých vazebných center Ad 4) nestačí pouze znalost struktury interagujících partnerů, ale je třeba se zamyslet nad funkčními vztahy v celém organismu Interakce bílkovin s ligandy 33 • Bílkovina (P) s jedním vazebným místem pro ligand (L), ustavení rovnováhy P + L ↔ PL • Asociační konstanta KA, převrácená hodnota KD • Bílkovina s n vazebnými centry pro ligand P + L ↔ PL1 PL1 + L ↔ PL2 ……………………. PLn-1 + L ↔ PLn      D A K 1 PL PL K  Interakce bílkovin s ligandy 34 • Pokud se vazebná místa neovlivňují: lze stanovit rozsah vazby r • a stupeň asociace β (vyjadřuje frakci vazebných míst obsazených ligandem) • Pro asociační konstantu KA platí: Pmolůcelkem Lvázanéhomoly r    n r nC LC systémuvmístavazebná Lvázanéhomoly P L    CL a Cp: výchozí koncentrace ligandu a bílkoviny; [L]: koncentrace volného ligandu v rovnovážném systému  LK 1místýchlnvofrakce místobsazenýchfrakce A     Interakce bílkovin s ligandy 35 • kombinací předchozích vztahů získáme: • a z toho rovnice vazebné izotermy: • Scatchardův výnos r/[L] proti r  LK n r 1 n r A     LK1 LnK r A A     rKnK L r AA  Scatchardův výnos 36 • V případě neovlivňujících se vazebných center získáme přímku (panel B, křivka 1), jejíž směrnice je rovna záporné hodnotě společné asociační konstanty KA, úsek na ose r/[L] součinu KA a počtu vazebných center n a úsek na ose r přímo hodnotě n • Lze se setkat i s tím, že uvedená Scatchardova závislost není lineární – obtížnější vyhodnocení, může mít dva různé jevy: 1) Křivka je prohnutá směrem nahoru (panel B, křivka 2) – molekula bílkoviny nese více druhů vazebných center, které se liší vnitřní asociační konstantou; v každé skupině se však dají centra považovat za navzájem nezávislá  Nejčastěji se setkáváme se dvěma typy vazebných center, ojediněle se třemi (lidský albumin) Scatchardův výnos 37 Panel A: Závislost rozsahu vazby r na koncentraci volného ligandu [L] pro různé vazebné modely. 1 – biopolymer obsahuje 2 ekvivalentní vazebná centra, KD = 5.10-3; 2 biopolymer obsahuje dva typy vazebných center, n1 = n2 = 1, KD,1 = 5.10-4, KD,2 = 2.10-2; 3- vazebná místa posititvně kooperují, n = 2, k = 0,07047, αH = 2 Panel B: Scatchardův výnos (r/[L] proti r) pro tytéž vazebné závislosti; pro křivku 3 platí pravá osa Interakce bílkovin s ligandy 38 • 2) Křivka je prohnutá směrem dolů nebo prochází maximem (panel B, křivka 3) - vazebná centra nejsou nezávislá, tedy jestliže navázání/uvolnění jednoho ligandu mění afinitu bílkoviny vzhledem k následující molekule L. Jeden typ vazebných center, jimž nemůžeme přiřadit jedinou asociační konstantu; vycházíme ze základního stavu charakterizovaného konstantou k0 pro situaci, kdy r = 0. Změna hodnoty r mění hodnotu k. • Lze vyjádřit vztahem: • U těchto kooperativních systémů (vyskytují se v biologických systémech velmi často) se volí semiempirické vztahy: )r( 0ekk   φ(r) vyjadřuje vliv interakce mezi vazebnými místy; při r = 0, φ(r) = 0     HH HH Lk1 Lnk r     αH: Hillova konstanta • platí, že 1 ≤ αH ≤ n • αH = n → dokonale kooperativní systém • αH = 1 → absence kooperativity Interakce bílkovin s ligandy 39 • chování bílkoviny závisí na pH, což je významné při studiu interakce nabitých ligandů, a zkoumané děje závisí na teplotě • několik základních možností pro studium interakcí: a) řada bílkovin mění své fyzikální vlastnosti při vazbě na nosič; může dojít ke změně absorpčních vlastností v UV/Vis oblasti spektra, změně fluorescence či chiroptických vlastností. Pokud známe hodnoty této veličiny pro ligand v roztoku a ligand navázaný i celkovou koncentraci ligandu, lze snadno zjistit koncentraci volného ligandu [L] a rozsah vazby r b) studium interakcí dvou makromolekulárních látek v roztoku – metody citlivě reagující na změnu relativní molekulové hmotnosti: polarizace fluorescence, elektroforetické a ultracentrifugační techniky c) metoda izotermální titrační kalorimetrie (ITC; analogie DSC) – do jednoho ze dvou kompartmentů obsahujících stejnou koncentraci makromolekuly se postupně přidává určité množství ligandu a měří se množství tepla uvolněného nebo spotřebovaného v důsledku vazby ligandu na makromolekulu. Přímo experimentálně lze získat hodnoty vazebných konstant, reakčních entalpií a počtu navázaných molekul ligandu Interakce bílkovin s ligandy 40 • d) metoda dialyzačních rovnovah pro zjištění závislosti r na [L]využití dialyzačních komůrek. Konstruované nádobky, kde dva prostory (stejného objemu) jsou odděleny polopropustnou membránou, přes kterou prochází pouze rozpouštědlo a nízkomolekulární látky (ligand), ale makromolekuly neprochází. Na začátku pokusu se do jednoho prostoru A umístí roztok ligandu a do druhého prostoru B roztok makromolekulárního nosiče. Po ustavení rovnováhy jsou stejné koncentrace volného ligandu v obou částech nádobky→ stačí určit koncentraci ligandu v prostoru bez nosiče a ze znalosti celkového množství ligandu snadno vypočteme rozsah vazby