„Biotransformace“ = metabolismus cizorodých látek a regulace hladin biotransformačních enzymů ENZYMY METABOLISMU CIZORODÝCH LÁTEK EEnzymy 1. fáze biotransformace xenobiotik, steroidních hormonů a mastných kyselin – monooxygenázy (CYP, AKR, FMO); - reduktázy (AKR, NQO); - hydrolázy (esterázy, epoxidhydrolázy); - další reakce: hydratace, isomerace, dehalogenace. E2. fáze biotransformace – transferázy (GST, UDPGT, SULF, acetylázy aj.); antioxidační enzymy (SOD, CAT, GPx, GR). E E3. fáze biotransformace (ABC transportéry) BIOTRANSFORMACE CIZORODÝCH LÁTEK A STEROIDŮ, EIKOSANOIDŮ AJ. ENDOGENNÍCH LÁTEK 1. FÁZE BIOTRANSFORMACE: monooxygenázové reakce (substrát) R-H + O2 + NADPH R-OH + NADP+ + H2O (produkt) CYP enzymy Funkce cytochromů P450 (CYP): - Nejprve je nutný přenos elektronů z NADPH na CYP enzym (NADPH:P450- oxidoreduktáza) - Aktivace molekuly kyslíku, „roztržení“ vazby - Oxidace substrátu (hydroxylace, N-demethylace, epoxidace, dehalogenace...) R-H R-OH O - C = C - - C –- C - N-CH3 N-H + HCHO ROLE CYP1A1/CYP1A2/CYP1B1 A EPOXIDHYDROLÁZ V METABOLICKÉ AKTIVACI POLYCYKLICKÝCH AROMATICKÝCH UHLOVODÍKŮ Obr-07 Vlastnosti cytochromů P450 Cytochromy P450 = hemoproteiny; v UV-VIS spektru maximum při 450 nm (v redukovaném stavu a navázaný oxid uhelnatý); výjimka mezi enzymy: široká substrátová specifita, různé katalytické aktivity, výskyt nejvíce v játrech, GIT, plicích, ledvinách, ale i v dalších tkáních). Klasifikace podle podobnosti sekvencí: genové rodiny CYP1, CYP2, CYP3, CYP4 atd., podrodiny CYP1A, CYP1B atd. (cca 60% sekvence), jednotlivé isoformy CYP1A1, CYP1A2, CYP1B1; polymorfismus. CYP3A4 s navázaným inhibitorem Aktivní místo CYP1A2 s navázaným b-naftoflavonem (modrá barva) CYKLUS CYTOCHROMU P450: AKTIVACE KYSLÍKU A MONOOXYGENACE Obr_01 Přenos elektronů: NADPH NADPH:P450 oxido- reduktáza cytochrom P450 (substrát RH, produkt ROH, produkce ROS) Aktivace kyslíku: ROS = vedlejší produkty interakcí se substrátem vzniká vysokospinová forma Fe3+-hemu a dochází k přenosu elektronů Seznam nejvýznamnějších cytochromů P450, které jsou zodpovědné za biotransformaci cizorodých látek: E CYP1A1, CYP1A2, CYP1B1 (metabolizuje polycyklické aromatické uhlovodíky); E CYP2C9 (metabolizuje nesteroidní antiflogistika a další léčiva), CYP2D6 (beta-blokátory, kodein); CYP2E1 (org. rozpouštědla jako ethanol, benzen, toluen) E CYP3A4 (metabolizuje asi 30% všech xenobiotik, především léčiv včetně antibiotik); E CYP4A11 a další CYPs metabolizující mastné kyseliny (CYP4A = PUFA hydroxylázy; CYP2C a CYP2J = PUFA epoxygenázy) a některá xenobiotika. Další desítky CYP enzymů jsou zapojeny do biosyntézy a metabolismu endogenních látek, např. CYP7A (hydroxylace cholesterolu), CYP17 (hydroxylace steroidů), CYP19 (aromatáza – přeměna androgenů na estrogeny). E SPECIFICKÉ SUBSTRÁTY CYP1 ENZYMŮ Obr-01 Obr-03 Obr-04 7-ethoxyresorufin-O- deethyláza (EROD) – „umělý“ substrát CYP1 BaP-hydroxyláza (produkty: BaP-OH) Kofeindemethylázy SPECIFICKÉ SUBSTRÁTY CYP1 ENZYMŮ fotometrická nebo fluorometrická detekce produkce resorufinu STEROIDY: substrátová specifita CYP enzymů (s výjimkou aromatázy monooxygenázové reakce inaktivují steroidní hormony) Obr-02 Obr-06 Obr-09 Hydroxylace steroidů v různých pozicích (v závorkách isoformy CYP enzymů) 6b-hydroxylace = specifická reakce CYP3A aromatáza METABOLISMUS POLYCHLOROVANÝCH BIFENYLŮ (PCB) – příklad 1. fáze metabolismu persistentních organických sloučenin Met_PCB_mikrob 02-pcb Mikrobiální degradace včetně arom. jádra Metabolismus u vyšších živočichů: oxidativní metab. (hl. cesty A-D, C) Persistetní arom. sloučeniny: obsahují Cl v sousedních pozicích – bariéra vzniku epoxidu monooxygenázovou reakcí REGULACE CYPs: nukleární a cytosolové receptory kontrolují expresi CYP proteinů CYP01 expozice a indukce CYP enzymů ovlivňuje metabolismus endogenních látek! (společné enzymy CYP pro biotransformaci cizorodých i endogenních látek) expozice ciz. látkami indukuje hladiny CYP enzymů XENOBIOTIKA, STEROIDY AJ. LÁTKY INDUKUJÍ VLASTNÍ METABOLISMUS AKTIVACÍ RECEPTORŮ/TRANSKRIPČNÍCH FAKTORŮ, KTERÉ KONTROLUJÍ EXPRESI BIOTRANSFORMAČNÍCH ENZYMŮ A ABC TRANSPORTÉRŮ - vazba xenobiotika na receptor (aktivace receptoru) - dimerizace receptoru - vazba receptoru na specifické responsní elementy v promoterových oblastech cílových genů NUKLEÁRNÍ A CYTOSOLOVÉ RECEPTORY _NR08 nukleární receptory cytosolový receptor dimerizační partner specif. responsní element v promoterech ligand receptoru NUKLEÁRNÍ A CYTOSOLOVÉ RECEPTORY KONTROLUJÍCÍ EXPRESI CYP ENZYMŮ CYP02 Cizorodé nebo endogenní látky, které indukují hladiny CYP enzymů SEZNAM CYTOCHROMŮ P450 (CYP) ZODPOVĚDNÝCH ZA BIOSYNTÉZU / METABOLISMUS STEROIDŮ A METABOLISMUS XENOBIOTIK q CYP1A1, CYP1A2, CYP1B1: genová exprese regulována AhR (indukce dioxiny, PAH; endogenní ligandy?); monooxygenace PAH, estradiolu; q CYP2B: exprese regulována GR/CAR, indukce steroidy, fenobarbitalem, monooxygenace velké řady xenobiotik, testosteronu aj. q CYP2A, CYP2C, CYP2D q CYP2E: indukce především stabilizací proteinu (indukují etanol, pyrazol aj.), monooxygenace etanolu, (w-1)-hydroxylace mastných kyselin q CYP3A: exprese regulována GR/PXR; indukce dexametazonem aj. steroidy, monooxygenace velké řady xenobiotik (nejdůležitější enzym biotranformace), 6b-hydroxylace testosteronu q CYP4A: exprese regulována PPARa, indukce peroxisomálními proliferátory (clofibrate, dialkylestery kyseliny ftalové), w-hydroxylace mastných kyselin q CYP7A, CYP11A, CYP17, CYP19 (aromatáza): enzymy steroidogeneze q další důležité CYP metabolismu vitamínu D3 a kyseliny retinové REGULACE EXPRESE BIOTRANSFORMAČNÍCH ENZYMŮ: CYTOSOLOVÝ Ah (aryl hydrocarbon) RECEPTOR AhR (Aryl hydrocarbon receptor) biotransformačních enzymů CYP1A1/1A2/1B1, UGT1A1, GSTA2, NQO1, ALDH3A1 ... regulátorů bun. cyklu / apoptózy (p27, Bax,...) přímé interakce (ER?,..) AhR kontroluje genovou expresi další funkce AhR-dependentní genové exprese AKTIVACE Ah RECEPTORU A INDUKCE CYP1A1 SUBSTRÁTEM CYP1A obr_09 AhR/ARNT nasedá na XRE = DRE = xenobiotic (dioxin) response element substrát S je ligandem AhR monooxygenázová reakce LIGANDY / INDUKTORY AhR Strukturní podobnost (šířka, výška, molekulární objem, planarita molekuly) Nekoplanární látky (např. PCB se dvěma chlóry v pozici ortho) nevykazují planární pozici aromatických jader a nejsou agonisty AhR TCDD = nejsilnější agonista AhR = modelový dioxinový toxikant Koplanární PCB (podobný dioxinům, agonista AhR) ENDOGENNÍ AGONISTÉ AhR obr_08 dosud nejsou přesně určeny (deriváty tryptofanu ?) Fyziologické funkce AhR: nezbytný v řadě procesů vývoje tkání, differenciace buněk aj. (viz myší AhR- deficientní modely) AKTIVACE Ah RECEPTORU / AhR-DEPENDENTNÍ GENOVÁ EXPRESE obr_11 Produkty genové exprese: -detox./bioaktiv. enzymy - apoptóza; - bun. cyklus; - ? - Přímé interakce AhR („cross-talk“ s ER, ...) Regulace AhR: - degradace AhR po navázání ligandu - AHRR = AhR represor REGULACE AhR (2) obr_26 Negativní regulace AhR: - AhR represor, - degradace - XME = xenobiotic metabolizing enzymes (CYP, UGT, ALDH...) „Toxic genes“ = indukce genů, která vede k „dioxinové“ toxicitě REGULACE CYTOCHROMU P4501B1 (CYP1B1) DRE = dioxin response element (je velmi komplexní – několik responsních elementů) MĚŘENÍ AKTIVACE Ah RECEPTORU (transgenní model - luciferázový reportérový gen) REGULACE EXPRESE BIOTRANSFORMAČNÍCH ENZYMŮ: NUKLEÁRNÍ RECEPTORY NUKLEÁRNÍ RECEPTORY (NR) _NR01 NUKLEÁRNÍ RECEPTORY: struktura domén receptorů _NR06 vazba ligandu aktivace MAPK NUKLEÁRNÍ RECEPTORY MOHOU BÝT AKTIVOVÁNY TAKÉ PROTEINKINÁZAMI _NR05 Ligand-independentní modulace transkripčního faktoru (MAPK, PKA,..) NUKLEÁRNÍ RECEPTORY - KLASIFIKACE _NR02 _NR02a Ligandy (agonisté) jaderných receptorů NUKLEÁRNÍ RECEPTORY, jejich ligandy a cílové geny _NR04 NUKLEÁRNÍ RECEPTORY _NR03 = „xenosensory“ a „lipidní sensory“ (aktivace transkripce po expozici xenobiotiky resp. lipidy) NUKLEÁRNÍ RECEPTORY: vazba antagonistického a agonistického ligandu _NR07 Antagonisté: vazba bez transaktivace transkripčního faktoru REGULACE TRANSKRIPČNÍHO FAKTORU CAR FENOBARBITALEM obr_27 Ovlivněny další faktory modulující aktivaci transkripce, např. HAT vs. HDAC FENOBARBITAL (PB) – agonista CAR (a induktor biotransformačních enzymů), ale také indukce metabolismu endogenních látek obr_03 Biotransformace: enzymy 1. fáze enzymy 2. fáze Modulace endogenního metabolismu REGULACE GR / PXR / CAR obr_13 aktivace nízkou vs. vysokou koncentrací ligandu REGULACE GR / PXR / CAR obr_12 Více úrovní regulace; aktivace nízkou vs. vysokou koncentrací ligandu PPARa (Peroxisomal Proliferator- Activated Receptor alpha) Induktory: mastné kyseliny, hypo- lipidemika (fibráty), environ. látky (ftaláty) PPAR_Obr-01 kontroluje expresi CYP4A11 a enzymů metabolismu lipidů LIGANDY PPARa PPAR_substraty_Obr-05 Farmaka (hypolimidemika) Environmentální kontaminanty (Endogenní) lipidy DŮSLEDKY AKTIVACE PPARa PPAR02 Nerovnoměrná indukce CYP4A (vedl. produkt: H2O2) a dalších enzymů (např. CAT) dependentních na PPARalfa DALŠÍ ENZYMY 1.FÁZE BIOTRASFORMACE A JEJICH REGULACE -flavinmonooxygenázy (FAD enzymy, NADPH přímo reaguje s enzymem); -peroxidázy (hemoproteiny oxidující 2-aminofluoren, PAH, fenoly; radikálové jednoelektronové reakce); -alkoholdehydrogenázy (koenzym NADH, oxidace prim. a sek. alkoholů); -aldehyddehydrogenázy (oxidace= detoxikace aldehydů a ketonů); -aldoketoreduktázy (AKR, oxidační reakce alkoholů – NAD+; redukce aldehydů a ketonů na alkoholy za účasti NADPH); -reduktázy xenobiotik (aldoketoreduktázy AKR, dehydrogenázy s krátkým řetězcem SDR, dehydrogenázy se středně dlouhým řetězcem, NADPH/chinonoxidoreduktáza - dvouelektronová redukce chinonů); -hydrolázy (štěpení substrátu za účasti vody; acetylcholinesterázy, karboxyesterázy, epoxidhydrolázy) FLAVINMONOOXYGENÁZY (obsahuje flavinový koenzym FAD) NAPDH + H+ + O2 NADP+ + H2O ALKOHOLDEHYDROGENÁZY Metabolismus etanolu třemi enzymovými systémy ALDOKETOREDUKTÁZY -většinou monomerické NAD(P)(H)-dependentní oxido- reduktázy; konvertují karbonyl alkohol - dosud 115 enzymů ve 14 „genových rodinách“; - substrátová specifita: cukerné aldehydy; steroidní hormony; prostaglandiny a lipidové aldehydy; metabolizují také některé chemické karcinogeny (NNK, PAH-trans-dihydrodioly, aflatoxindialdehyd) Příklady lidských AKR: AKR1A1 (aldehydreduktáza) AKR1B1 (aldosareduktáza) AKR1C1-1C4 (20a-, 3a-, 3a/17a-, 3a-HSD) AKR1D1 (5b-reduktáza) 1. fáze biotransformace PAH: účast CYP1A1/1A2/1B1 (monooxygenace), EH (hydroláza) a AKR (reduktáza) katecholy = - metabolity PAHs, - podobně metabolity steroidů (E2) Detoxikace versus bioaktivace ALDOKETOREDUKTÁZY: příklady detoxikačních reakcí) Obr-11 Obr-10 Detoxikace NNK (redukce) Biotransformace (detoxikace) aldehydů vzniklých v průběhu lipidní peroxidace REGULACE ALDOKETOREDUKTÁZ Obr-12 KLASICKÝ POHLED NA INDUKCI GENOVÉ EXPRESE KONTROLOVANOU XRE A ARE: transkripční faktor Nrf2 je indukován reaktivními metabolity a ox. stresem Miao et al., Biochem. Pharmacol., 2004 XRE = xenobiotic (dioxin) respons element; ARE = antioxidant response element Bifunkční induktory = xenobiotika aktivující AhR a Nrf2 GST, NQO = enzym 2. fáze biotransformace TRANSKRIPČNÍ FAKTOR Nrf2 JE REGULOVÁN OXIDATIVNÍM STRESEM / ELEKTROFILNÍMI METABOLITY A TAKÉ AKTIVACÍ AhR Miao et al., JBC, 2005 Keum, Biomol Ther, 2012 NQO: NADPH/CHINONOXIDOREDUKTÁZA (DT-DIAFORÁZA) Chinon Kofaktory NADPH nebo NADH EPOXIDHYDROLÁZY Funkce: - metabolismus lipidů (epoxidů) v živočišných a rostlinných buňkách - metabolismus intermediátů xenobiotik s epoxidovou skupinou - - celkem 7 forem EH: - savčí solubilní (cytosolová) EH – inaktivace epoxy-mastných kyselin - mikrosomální EH – inaktivace BaP-dihydrodiolepoxidu - leukotrien A4 hydroláza etc. Regulace např. aktivací Nrf-2 EPOXIDHYDROLÁZY Funkce: - metabolismus lipidů (epoxidů) v živočišných a rostlinných buňkách - metabolismus intermediátů xenobiotik s epoxidovou skupinou - - celkem 7 forem EH: - savčí solubilní (cytosolová) EH – inaktivace epoxy-mastných kyselin - mikrosomální EH – inaktivace BaP-dihydrodiolepoxidu - leukotrien A4 hydroláza etc. Regulace např. aktivací Nrf-2 ROLE CYP1A1/CYP1A2/CYP1B1 A EPOXIDHYDROLÁZ V METABOLICKÉ AKTIVACI POLYCYKLICKÝCH AROMATICKÝCH UHLOVODÍKŮ Obr-07