kampus Bohunice 1 1 1 laboratoř cvičení z biochemie úvodní cvičení – sestrojení kalibrační přímky pro stanovení koncentrace hexakyanoželezitanu draselného F:\praktikum-fotky\uloha.00\P_20160222_111348.jpg koncentrace hexakyanoželezitanu draselného : 1 = 0,0 mmol/l (slepý vzorek) 2 = 0,1 mmol/l 3 = 0,2 mmol/l 4 = 0,3 mmol/l 5 = 0,4 mmol/l 6 = 0,5 mmol/l fotometrické stanovení A420 1 2 3 4 5 6 úvodní cvičení – sestrojení kalibrační přímky pro stanovení koncentrace hexakyanoželezitanu draselného A420 c(K3[Fe(CN)6]) [mmol.l-1] úloha č. 1 - kvalitativní stanovení sacharidů – thymolová reakce 130_3082 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 1 = arabinosa 2 = ribosa 3 = glukosa 4 = galaktosa 5 = fruktosa 6 = sacharosa 7 = trehalosa 8 = maltosa 9 = laktosa 10 = cellobiosa 11 = rafinosa pozitivní reakci poskytují všechny sacharidy, reakční produkty se liší zbarvením úloha č. 1 - kvalitativní stanovení sacharidů – Fehlingova reakce 130_3086 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 1 = arabinosa 2 = ribosa 3 = glukosa 4 = galaktosa 5 = fruktosa 6 = sacharosa 7 = trehalosa 8 = maltosa 9 = laktosa 10 = cellobiosa 11 = rafinosa pozitivní reakci poskytují redukující sacharidy, reakční produkty jsou tmavě zbarvené – hnědorezavý odstín vyredukované mědi (negativní reakce – světle modré zbarvení) úloha č. 1 -kvalitativní stanovení sacharidů – Somogyiho reakce 130_3094 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 1 = arabinosa 2 = ribosa 3 = glukosa 4 = galaktosa 5 = fruktosa 6 = sacharosa 7 = trehalosa 8 = maltosa 9 = laktosa 10 = cellobiosa 11 = rafinosa pozitivní reakci poskytují redukující sacharidy, reakční produkty jsou tmavě zbarvené, modrý až zelenomodrý odstín (negativní reakce – světle modré zbarvení) úloha č. 1 - kvalitativní stanovení sacharidů – Bialova reakce 130_3088 1 = arabinosa 2 = ribosa 3 = glukosa 4 = galaktosa 1 2 3 4 pozitivní reakci poskytují pentózy, reakční produkty jsou modře až modrozeleně zbarvené úloha č. 1 - kvalitativní stanovení sacharidů – Selivanova reakce 130_3084 1 2 3 4 5 6 1 = glukosa 2 = galaktosa 3 = fruktosa 4 = sacharosa 5 = rafinosa 6 = inulin pozitivní reakci poskytují ketózy resp. sacharidy obsahující podjednotku s ketózovou strukturou, reakční produkty jsou červeně zbarvené kvalitativní stanovení sacharidů – Rothenfusserova reakce 130_3092 1 = glukosa 2 = galaktosa 3 = fruktosa 4 = sacharosa 5 = rafinosa 6 = inulin 1 2 3 4 5 6 pozitivní reakci poskytují ketózy resp. sacharidy obsahující podjednotku s ketózovou strukturou, reakční produkty jsou tmavomodře zbarvené úloha č. 1 - kvalitativní stanovení sacharidů – reakce s jódem 130_3090 1 2 3 4 5 6 1 = glukosa 2 = galaktosa 3 = fruktosa 4 = škrob 5 = glykogen 6 = inulin pozitivní reakci poskytují polysacharidy, barva reakčních produktů je tím tmavší, čím delší jsou polysacharidové řetězce úloha č. 1 - rozdělovací chromatografie sacharidů (vyvíjení chromatogramu v chromatografické komůrce) chromatografie sacharidů mobilní fáze Silufol úloha č. 1 - rozdělovací chromatografie sacharidů (vyvíjení chromatogramu pod infralampou) •1 = ribosa •2 = 2´-deoxyribosa •3 = glukosa •4 = galaktosa •5 = mannosa •6 = fruktosa •7 = maltosa •8 = laktosa •9 = cellobiosa 1 2 3 4 5 6 7 8 9 cukry I úloha č. 1 - rozdělovací chromatografie sacharidů (hotový chromatogram) •1 = ribosa •2 = 2´-deoxyribosa •3 = glukosa •4 = galaktosa •5 = mannosa •6 = fruktosa •7 = maltosa •8 = laktosa •9 = cellobiosa • 1 2 3 4 5 6 7 8 9 8 úloha č. 1 - rozdělovací chromatografie sacharidů •interpretace chromatogramu: • Všechny sacharidy jsou silně polární sloučeniny (přítomnost –OH skupin), jako hlavní dělící faktor se proto uplatňuje velikost molekuly. Polarita molekuly se uplatňuje teprve v rámci jednotlivých skupin sacharidů lišících se molekulovou hmotností (pentózy vs. hexózy vs. disacharidy). úloha č. 1 - kvantitativní stanovení redukujících sacharidů (Somogyiho – Nelsonova reakce) praktika 016 koncentrace glukosy: 1 = 0,00 mmol/l (slepý vzorek) 2 = 0,02 mmol/l 3 = 0,04 mmol/l 4 = 0,06 mmol/l 5 = 0,08 mmol/l 6 = 0,10 mmol/l fotometrické stanovení A740 1 2 3 4 5 6 úloha č. 1 - glukosaoxidasová elektroda (měřící systém) elektroda notebook nádobka s pracovním pufrem převodník míchačka enzymová elektroda úloha č. 1 - glukosaoxidasová elektroda (stanovení koncentrace glukosy - záznam proudové odezvy) proud (µA) čas (s) základní proudová odezva ustálení proudové odezvy ustálení proudové odezvy přídavek glc přídavek glc změna proudu úměrná koncentraci glc změna proudu úměrná koncentraci glc úloha č. 2 - kvalitativní stanovení aminokyselin – Sakaguchiho reakce praktika 023 1 = arginin 2 = histidin 3 = tyrosin 4 = tryptofan 5 = cystein 6 = methionin 7 = BSA 1 2 3 4 5 6 7 BSA obsahuje všechny aminokyseliny a proto poskytuje pozitivní reakci, červené zbarvení reakčního produktu argininu úloha č. 2 - kvalitativní stanovení aminokyselin – xanthoproteinová reakce praktika 019 1 = arginin 2 = histidin 3 = tyrosin 4 = tryptofan 5 = cystein 6 = methionin 7 = BSA 1 2 3 4 5 6 7 BSA obsahuje všechny aminokyseliny a proto poskytuje pozitivní reakci, žluté až žlutočervené zbarvení reakčního produktu tyrosinu a tryprofanu úloha č. 2 - kvalitativní stanovení aminokyselin – Paulyho reakce praktika 024 1 = arginin 2 = histidin 3 = tyrosin 4 = tryptofan 5 = cystein 6 = methionin 7 = BSA 1 2 3 4 5 6 7 BSA obsahuje všechny aminokyseliny a proto poskytuje pozitivní reakci, červené zbarvení reakčního produktu histidinu a tyrosinu úloha č. 2 - kvalitativní stanovení aminokyselin – reakce na síru praktika 025 1 = arginin 2 = histidin 3 = tyrosin 4 = tryptofan 5 = cystein 6 = methionin 7 = BSA 1 2 3 4 5 6 7 BSA obsahuje všechny aminokyseliny a proto poskytuje pozitivní reakci, černé zbarvení reakčního produktu cysteinu úloha č. 2 - kvalitativní stanovení aminokyselin – Folinova reakce praktika 039 1 = arginin 2 = histidin 3 = tyrosin 4 = tryptofan 5 = cystein 6 = methionin 7 = BSA 1 2 3 4 5 6 7 BSA obsahuje všechny aminokyseliny a proto poskytuje pozitivní reakci, modré zbarvení reakčního produktu aminokyselin s redukčními vlastnostmi úloha č. 2 - kvalitativní stanovení aminokyselin – ninhydrinová reakce praktika 026 1 9 4 6 7 8 5 3 2 kapkovací reakce 1 = glycin 2 = prolin 3 = arginin 4 = histidin 5 = tyrosin 6 = tryptofan 7 = cystein 8 = methionin 9 = BSA pozitivní reakci poskytují všechny aminokyseliny, skvrny se liší zbarvením, přítomností okraje apod. úloha č. 2 - kvalitativní stanovení aminokyselin – biuretová reakce praktika 040 1 = glycin 2 = prolin 3 = arginin 4 = histidin 5 = tyrosin 6 = tryptofan 7 = cystein 8 = methionin 9 = BSA 1 2 3 4 5 6 7 8 9 pozitivní reakci (fialové zbarvení) poskytuje pouze BSA obsahující peptidové vazby úloha č. 2 - rozdělovací chromatografie aminokyselin (vyvíjení chromatogramu v chromatografické vaně) vana chromatografický papír mobilní fáze úloha č. 2 - rozdělovací chromatografie aminokyselin (hotový chromatogram) •1 = glycin •2 = alanin •3 = valin •4 = leucin •5 = kyselina asparagová •6 = kyselina glutamová •7 = fenylalanin •8 = tyrosin •9 = tryptofan •10 = histidin •11 = lysin •12 = arginin • chromatografie aminokyselin 1 2 3 4 5 5 6 7 8 9 10 11 12 úloha č. 2 - rozdělovací chromatografie aminokyselin •interpretace chromatogramu: Aminokyseliny se značně liší svou strukturou, tedy i polaritou. • •glycin vs. alanin vs. leucin vs. valin: s rostoucí délkou řetězce klesá polarita molekuly, roste pohyblivost molekuly v nepolární mobilní fázi •kys. asparagová vs. kys. glutamová: s rostoucí délkou řetězce klesá polarita molekuly, roste pohyblivost molekuly v nepolární mobilní fázi •alanin vs. fenylalanin: přítomnost benzenového jádra snižuje polaritu molekuly a zvyšuje pohyblivost molekuly v nepolární mobilní fázi •glycin vs. kys. asparagová, alanin vs. kys. glutamová: přítomnost karboxylové skupiny v postranním řetězci zvyšuje polaritu molekuly a snižuje její pohyblivost v nepolární mobilní fázi •fenylalanin vs. tyrosin: přítomnost hydroxylové skupiny na benzenovém jádře zvyšuje polaritu molekuly a snižuje její pohyblivost v nepolární mobilní fázi •alifatické aminokyseliny vs. lysin, arginin: přítomnost aminoskupiny resp. guanidinové skupiny v postranním řetězci zvyšuje polaritu molekuly a snižuje její pohyblivost v nepolární mobilní fázi •histidin vs. tryptofan: : přítomnost benzenového jádra snižuje polaritu molekuly a zvyšuje pohyblivost molekuly v nepolární mobilní fázi • úloha č. 2 - kvantitativní stanovení aminokyselin (neutralizační titrace glycinu) praktika 033 bod ekvivalence (indikátor: fenolftalein) úloha č. 2 - kvantitativní stanovení aminokyselin (reduktometrická titrace glycinu) praktika 034 1 2 1)zbarvení vzorku před titrací 2)bod ekvivalence (indikátor: škrob) úloha č. 3 – UV-absorpční spektra aromatických aminokyselin 2,5 mmol/l fenylalanin λmax = 257 nm 0,25 mmol/l tyrosin λmax = 274 nm 0,1 mmol/l tryptofan λmax = 279 nm úloha č. 3 – UV-absorpční spektra bílkovin hovězí sérový albumin 1 mg/ml λmax = 277 nm hovězí krevní sérum 100 x zředěné λmax = 278 nm úloha č. 3 - kvantitativní stanovení bílkovin (biuretová reakce) praktika 001 koncentrace BSA: 1 = 0,0 mg/ml (slepý vzorek) 2 = 0,5 mg/ml 3 = 1,0 mg/ml 4 = 1,5 mg/ml 5 = 2,0 mg/ml 6 = 2,5 mg/ml fotometrické stanovení A550 1 2 3 4 5 6 úloha č. 3 - kvantitativní stanovení bílkovin (Folinova reakce) praktika 003 1 2 3 4 5 6 koncentrace BSA: 1 = 0,0 mg/ml (slepý vzorek) 2 = 0,05 mg/ml 3 = 0,10 mg/ml 4 = 0,15 mg/ml 5 = 0,20 mg/ml 6 = 0,25 mg/ml fotometrické stanovení A745 úloha č. 3 - stanovení koncentrace proteinů podle Kjeldahla (mineralizace proteinů) mineralizace odsávací nástavec vývěva mineralizační tuby mineralizační přístroj úloha č. 3 - stanovení koncentrace proteinů podle Kjeldahla (uvolnění amoniaku z mineralizovaného vzorku hydroxidem sodným) kejdal I poloautomatický Kjeldahlův přístroj dávkovací pumpa pro hydroxid sodný tuba obsahující mineralizovaný protein předloha obsahující kyselinu boritou a indikátor zásobník hydroxidu sodného úloha č. 3 - stanovení koncentrace proteinů podle Kjeldahla (vydestilování amoniaku do předlohy) kejdal II poloautomatický Kjeldahlův přístroj parní ventil tuba obsahující mineralizovaný protein předloha obsahující kyselinu boritou a indikátor úloha č. 4 – izolace nukleoproteinu z bakteriálních buněk F:\praktikum-fotky\uloha.04\P_20160324_094646.jpg F:\praktikum-fotky\uloha.04\IMG_20160324_183157.JPG F:\praktikum-fotky\uloha.04\P_20160324_085227.jpg 1 - lýze buněk 2 - deproteinace 3 - precipitace nukleoproteinu 2 1 3 úloha č. 4 - identifikace DNA obsažené v nukleoproteinu pomocí barevné reakce (s difenylaminovým činidlem) •1 = fyziologický roztok •2 = 2´-deoxyribosa •3 = ribosa •4 = DNA •5 = RNA •6 = nukleoprotein 1 2 3 4 5 6 praktika 003 úloha č. 4 - UV – absorpční spektrum DNA (0,025 mg/ml) ds-DNA (nativní) ss-DNA (denaturovaná) λmax = 263 nm úloha č. 4 – denaturace DNA úloha č. 5 – enzymové reakce •S enzym P • • •stanovení enzymové aktivity: 1) rychlost úbytku substrátu 2) rychlost přírůstku produktu úloha č. 5 – amylázová reakce n glc-glc-glc-glc-glc glc-glc škrob maltosa amyláza amyláza stanovení aktivity amylázy: 1) úbytek substrátu – Lugolova reakce, detekce úbytku škrobu 2) přírůstek produktu – Fehlingova reakce, detekce vzniku maltózy (redukující sacharid) H2O H2O úloha č. 5 – amylázová reakce čas (min.) 0 zbarvení vzorku po přidání Lugolova roztoku 60 zbarvení vzorku po přidání Lugolova roztoku 60 zbarvení vzorku po Fehlingově reakci zkumavka A 1 3 5 zkumavka B 2 4 6 2 1 3 4 6 5 úloha č. 5 – lipázová reakce + R-COOH lipáza lipid (triacylglycerol) glycerol + mastná kyselina lipáza stanovení aktivity lipázy: přírůstek produktu – detekce vzniku mastných kyselin pomocí změny zbarvení acidobazického indikátoru H2O H2O úloha č. 5 – lipázová reakce A B C D E A - neutralizované mléko B - okyselené mléko C – neutralizované mléko po působení lipázy, teplota 37 oC D – neutralizované mléko po působení lipázy, teplota 0 oC E – neutralizované mléko po působení lipázy, teplota 80 oC úloha č. 5 – proteázová reakce NH2- R – C = O NH - R – C = O NH - R – C = O NH - R – C = O NH - R – C = O OH -------------atd. NH2- R – C = O OH n protein volné aminokyseliny proteáza stanovení aktivity proteázy: úbytek substrátu – stanovení koncentrace proteinu pomocí biuretové reakce H2O úloha č. 5 – proteázová reakce A´ B´ C´ D´ A´ - biuretová reakce po působení proteázy v neutrálním prostředí B´ - biuretová reakce po působení proteázy v kyselém prostředí C´ - biuretová reakce po působení proteázy v alkalickém prostředí D´ - biuretová reakce bez působení proteázy úloha č. 5 – nitritreduktázová a nitrátreduktázová reakce • C,D • NO3- nitrátreduktáza NO2- nitritreduktáza NxO N2 • • A,B • NO2- nitritreduktáza NxO N2 • •stanovení aktivity nitrátreduktázy: přírůstek meziproduktu – detekce dusitanu pomocí kopulační reakce •stanovení aktivity nitritreduktázy: úbytek substrátu – detekce dusitanu pomocí kopulační reakce • úloha č. 5 – nitrátreduktázová a nitritreduktázová reakce A – redukce dusitanu B – redukce dusitanu v přítomnosti antimycinu A C – redukce dusičnanu D – redukce dusičnanu v přítomnosti antimycinu A úloha č. 6 – sacharáza z kvasnic + H2O sacharóza glukóza fruktóza sacharáza neredukující redukující stanovení aktivity sacharázy: přírůstek produktu – redukujících monosacharidů H2O úloha č. 6 – enzymový minireaktor (příprava enzymového minireaktoru) F:\praktikum-fotky\uloha.06\reaktor\P_20160406_084034.jpg kvasničný extrakt v alginátu sodném míchaný roztok chloridu vápenatého F:\praktikum-fotky\uloha.06\reaktor\P_20160406_083956.jpg F:\praktikum-fotky\uloha.06\reaktor\P_20160404_103601.jpg částice alginátového gelu v kádince kolonka naplněná alginátovým gelem úloha č. 6 – enzymový minireaktor (odběr frakcí z enzymového minireaktoru – detekce redukujících monosacharidů Somogyi-Nelsonovou metodou) odběr frakcí po 0 (kontrolní vzorek), 1, 2, 5, 10, 15, 20 minutách úloha č. 6 – substrátová specifita sacharázy (detekce redukujících monosacharidů Somogyi-Nelsonovou metodou) 1 2 3 4 5 6 7 1 - kontrolní vzorek 2 - sacharóza 3 - sacharóza 4 - trehalóza 5 - trehalóza 6 - rafinóza 7 - rafinóza sacharóza trehalóza rafinóza sacharáza úloha č. 6 – stanovení aktivity sacharázy v kvasnicích (detekce redukujících monosacharidů Somogyi-Nelsonovou metodou) 1 – kontrolní vzorek 2-6 – paralelní stanovení aktivity sacharázy v = Δn/Δt úloha č. 7 – amylázová reakce n glc-glc-glc-glc-glc glc-glc škrob maltosa amyláza amyláza stanovení aktivity amylázy: 1) úbytek substrátu – Lugolova reakce, detekce úbytku škrobu 2) přírůstek produktu – Somogyi-Nelsonova reakce, detekce vzniku maltózy (redukující sacharid) H2O H2O úloha č. 7 – stanovení aktivity slinné amylázy ve slinách (detekce redukujících monosacharidů Somogyi-Nelsonovou metodou) 1 – kontrolní vzorek 2-6 – paralelní stanovení aktivity amylázy v = Δn/Δt úloha č. 7 - pH optimum slinné amylasy (detekce redukujících monosacharidů Somogyi-Nelsonovou metodou) praktika 009 pH 3 4 5,5 6 6,5 7 7,5 8 8,5 9 úloha č. 7 - pH optimum slinné amylasy (detekce škrobu Lugolovým roztokem) praktika 002 pH 3 4 5,5 6 6,5 7 7,5 8 8,5 9 úloha č. 8 – stanovení počáteční rychlosti trypsinové reakce •P-CO-NH-lys-CO-NH-P´ •trypsin • •g •P-CO-NH-lys-COOH + NH2-P´ titrace úloha č. 8 – stanovení počáteční rychlosti trypsinové reakce t t v n n v teoretický průběh - ideální situace skutečnost https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/1/1f/BAPNA_assay.jpg úloha č. 9 – stanovení Michaelisovy konstanty trypsinové reakce úloha č. 9 – stanovení Michaelisovy konstanty trypsinové reakce vlim KM ½ vlim úloha č. 10 – ureázová reakce úloha č. 10 - stanovení koncentrace močoviny (kalibrační přímka pro stanovení koncentrace amonných iontů Nesslerovým činidlem) praktika 001 koncentrace amonných iontů: 1 = 0,00 mmol/l (slepý vzorek) 2 = 0,04 mmol/l 3 = 0,08 mmol/l 4 = 0,12 mmol/l 5 = 0,16 mmol/l 6 = 0,20 mmol/l fotometrické stanovení A436 1 2 3 4 5 6 úloha č. 10 – substrátová specifita alkoholdehydrogenázy (kinetické měření, Warburgův test – A340) A340 etanol propanol butanol metanol úloha č. 11 - substrátová specifita fenoloxidasy (zbarvení vzorků po 60 min. působení fenoloxidázy) praktika 005 substrát: 1 = fenol (hydroxybenzen) 2 = pyrokatechol (1,2-dihydroxybenzen) 3 = resorcinol (1,3-dihydroxybenzen) 4 = hydrochinon (1,4-dihydroxybenzen) 5 = 1-naftol 6 = 2-naftol 1) 1 2 3 4 5 6