FARMAKOKINETIKA VÝZKUM A VÝVOJ LÉČIV Předmět farmakologie Vztah mezi podáním léčiva a účinkem • • • Farmakokinetika •Biologická odezva - žádoucí i nežádoucí (toxicita) závisí na koncentraci léčiva na místě účinku (u cílové struktury) •Koncentraci léčiva na místě účinku určují farmakokine-tické parametry - ADME • • • Absorpce • • Distribuce • • Metabolismus • • Exkrece Změny koncentrace léčiva v organismu • Absorpce • Účinek léčiv závisí na jejich koncentraci v místě cílové • struktury. Je-li cílová struktura uvnitř buňky musí molekuly léčiva proniknout přes buněčnou membránu •Podání léčiva přímo do krevního oběhu (injekce, infuze) •Neinvazivní způsoby podání léčiva –perorální (absorpce v GI traktu) – opakující se průchod přes buněčné membrány, – další problém: první průchod játry – možnost částečné inaktivace –přes sliznice (sublingvální přípravky, čípky, nosní kapky a spreje, inhalační aerosoly) –přes kůži (masti, krémy, tinktury, lotia, náplasti) •Průnik látek do buňky: –difuze přes lipidickou dvojvrstvu buněčné membrány –difuze přes „vodní“ kanály buněčných stěn (neuplatňuje se: průměr vodního kanálu 0,4 nm; molekuly léčiv ~ 1 nm) –aktivní transport pomocí bílkovinných přenašečů (jen některá léčiva) –pinocytóza (endocytóza – velké molekuly a nanočástice) •Příliš polární léčiva – omezená difuze lipidickou dvojvrstvou –– řešení: převedení polárního léčiva na méně polární profarmaka, z nichž se účinná látka uvolní až v buňce • Pravidlo pěti •Předpoklady průniku látky přes buněčné membrány: –molekulová hmotnost do 500 –ne více než 5 protondonorových a 10 protonakceptorových skupin –log rozdělovacího koeficientu mezi n-oktanolem a vodou menší než 5 (ale ne záporný) –Užitečná pomůcka, ale idealizace: 80% používaných léčiv má logP v rozmezí 0,4-5,6; průměrná hodnota logP ~ 2,5 –Výjimky: substráty transportních bílkovin – přípravky pronikající do buněk endocytózou – antibiotika, látky s protiplísňovým účinkem • Distribuce •Distribuci léčiva v organismu zajišťuje krevní oběh. –adsorpce léčiva na plasmatické bílkoviny –rovnovážná koncentrace volného léčiva •Z krevního oběhu se léčivo dostává do tkání –distribuce v tkáních závisí na jejich zásobení krví –pronikání léčiva z krevních kapilár k cílovým buňkám v tkáních –průchod buněčnou stěnou (je-li cílová struktura uvnitř buňky) •pravidlo pěti, profarmaka –hematoencefalická bariéra, placentální bariéra –zdánlivý distribuční objem: – VD = D/CP (odvozeno ze vztahu pro koncentraci léčiva v plasmě CP = D/VD ) – D celková koncentrace léčiva •vyšší hodnota VD - léčivo se kumuluje v tkáňových buňkách •malá hodnota VD - větší množství léčiva v krevním oběhu, méně v tkáních – Distribuce: voda v organismu • Dospělý jedinec (70 kg) • celkový obsah vody v těle: 42 kg (60%) • z toho: • voda v buňkách: 28 kg (40%) • voda v mimobuněčném prostoru: 14 kg (20%) • z toho: • krevní oběh: 3,5 kg (5%) • obsah vody v tkáních: 10,5 kg (15%) • Novorozenec • celkový obsah vody v těle: 77% • voda v buňkách: 27% • voda v mimobuněčném prostoru: 50% • Metabolismus •Metabolická inaktivace •nežádoucí – snížení koncentrace léčiva ještě před interakcí s cílovou strukturou, •komplikace – odbourání léčiva enzymy v GI traktu nebo krevním oběhu, • – částečná inaktivace léčiv po absorpci z GI traktu při prvním průchodu játry •převážně potřebná – důležitá pro odstranění léčiva z organismu •Metabolická aktivace (profarmaka) •Metabolické přeměny v játrech – oxidační enzymy cytochromy P 450 • 18 rodin cytochromů (40% shoda), 43 podrodin (55% shoda) • označení: CYP-číslo (rodina), písmeno (podrodina), číslo (jednotlivý enzym) • příklad: CYP3A4, CYP2D6 –reakce fáze I – zvýšení polarity (hydrofility) •oxidace, oxidativní odštěpování alkylskupin – cytochromy •redukce (nitro a azoskupiny, reduktivní dehalogenace) – cytochrom reduktasa, oxidoreduktasy •hydrolýza esterů a amidů – esterasy a další hydrolytické enzymy –reakce fáze 2 – další zvýšení polarity tvorbou konjugátů – (glukuronidy – UDP-glukuronotransferasa, sulfáty - sulfotransferasa, konjugáty s glutathionem) –individuální rozdíly v koncentraci i aktivitě enzymů metabolizujících léčiva –ovlivnění metabolismu •lékové a potravinové interakce • • Exkrece •Organismus vylučuje léčiva v nezměněné formě i metabolicky přeměněná • •Exkrece: • močí (ledviny): –ultrafiltrace krve v glomerulách –reabsorpce z nefronu (rozhoduje polarita: původní léčivo >> metabolity se zvýšenou polaritou) • stolicí: –přechod z jater do žlučových cest a odtud do střev (+ neabsorbované léčivo) • potem: –přes pokožku může být exkretováno až 10-15% léčiva •plicní exkrece: –anestetika, těkavé metabolity •v mateřském mléce: –možnost toxického působení léčiv na kojence •Eliminace - odstranění léčiva z krevního oběhu a tkání • (zahrnuje exkreci i metabolické přeměny léčiva na neúčinné deriváty) • • • • • • • • • • Clearance a biologický poločas •Clearance = poměr rychlosti eliminace léčiva k jeho celkové koncentraci •Celková clearance CLT - eliminace léčiva z krve (krevní plasmy) • CLT = jaterní clearance CLH (metabolická + žlučová) • + ledvinová clearance CLR • + clearance ostatními orgány CLO •Čím vyšší je clearance, tím rychleji klesá koncentrace léčiva v krvi. •Biologický poločas - doba kdy koncentrace léčiva v krvi klesne na polovinu • Význam clearance •Znalost clearance je důležitá pro určení režimu dávkování léčiva, aby byla potřebnou dobu udržována jeho koncentrace v terapeutickém rozmezí. • • • • • • • • • • •AUC – plocha pod křivkou – určuje celkové množství léčiva v krevní plasmě • přímo úměrná podanému množství léčiva • nepřímo úměrná celkové clearanci Pro dosažení trvalé koncentrace léčiva v terapeutickém rozmezí je třeba podávání léčiva opakovat. Ustálený stav (s malými změnami koncentrace léčiva) se dosahuje v čase odpovídajícím čtyřnásobku biologického poločasu Rezistence •Rezistence - snižování terapeutické odezvy na podanou dávku •Příčiny: –farmakodynamické faktory •kvantitativní změny cílových struktur (nárůst nebo pokles počtu) •kvalitativní změny (mutacemi zapříčiněná změna prostorového uspořádáni cílové struktury a její dostupnosti) •kvantitativní a/nebo kvalitativní změny bílkovin transportujících léčivo ven z buňky (ABC přenašeče) –farmakokinetické faktory •zvýšení koncentrace a/nebo aktivity enzymů degradujících léčivo –selekční tlak (bakterie, nádorové buňky) •Překonávání rezistence –režim léčby (chronoterapie) –nová léčiva s nižší clearance –inhibice degradujících enzymů –potlačení tvorby nebo funkce transportních bílkovin • Výzkum a vývoj léčiv •Základní rysy VaV léčiv •Fáze VaV léčiv •Objevování nových léčiv – metodiky •Na fragmentech založený objev léčiva •Kombinatoriální syntéza • Výzkum a vývoj nových léčiv je •časově náročný (~15 let) •nákladný (~ 1,4 -2 mld. $) •rizikový: velké množství látek selhává při preklinic- kých i klinických zkouškách (úspěšnost < 0,01%) •Þ kompletní VaV nového léčiva si mohou dovolit jen velké kapitálově silné farmaceutické firmy • VaV léčiv je službou pro tyto „zákazníky“: •pacienty •lékaře •lékárníky a distributory léčiv •poskytovatele a plátce zdravotnických služeb (pojišťovny) •vedení a akcionáře farmaceutických firem, grantové agentury, vedení ústavů a vysokých škol • Trendy výzkumu, vývoje a výroby léčiv F Roste náročnost výzkumu a vývoje léčiv −Rostou požadavky na bezpečnost nových léčiv −Ve výzkumu a vývoji je 35-40 tis. kandidátů na léčiva, ale počet povolo- vaných nových léčiv („nových chemických entit“, NCE) je jen malý: v r. 1997 bylo povoleno 49 nových léčiv, v dalších letech vždy méně (jen 21 v r. 2010); rok r. 2018 rekordní: FDA: 59 , EMA: 81, z toho 42 s novými léčivými látkami – v r. 2019 pokles: FDA: 48 (35 dnů nucené dovolené 42% zaměstnanců, 4. března 2019 rezignace šéfa FDA Gottlieba); EMA: 66, z toho 30 NCE (přesun sídla EMA z Londýna do Amsterodamu vyvolaný brexitem, asi 25% klíčových pracovníků zůstalo v UK) −Stále větší měrou jsou předmětem VaV „cílená“ léčiva a „bioterapeutika“ – spojování diagnostiky s terapií, protilátky, imunoterapie, genová a buněčná terapie F Rostou náklady na výzkum a vývoj −Náklady na VaV úspěšného nového léčiva dosahují až 2 mld. $, – (při započtení nákladů na VaV neúspěšných léčiv by činily 3,7-11,8 mld. $) −Roste počet léčiv, která selhávají při klinickém zkoušení – (v poslední fázi klinického zkoušení selhávala na počátku 90. let minulého století – třetina, nyní ale až polovina nových léčiv) –Jen u cca 20% léčiv přesáhne zisk z prodeje náklady na VaV – → vysoké ceny nových léčiv – → nutnost racionalizace VaV léčiv • Trendy výzkumu, vývoje a výroby léčiv (pokračování) FMění se orientace výzkumu a vývoje léčiv −Široké zapojení informačních technologií −„Translační“ výzkum a vývoj −Do popředí se dostávají léky pro dříve opomíjené indikace a poruchy −Individualizovaná („precizní“ nebo „cílená“) terapie −Prosazuje se „biologická“ léčba – biopolymerní léčiva dnes přinášejí 20 předním farmaceutickým firmám přes 40% jejich tržeb FSnahy o zbrzdění růstu nákladů na zdravotní péči vytvářejí tlak na ceny léčiv FKončí patentová ochrana a ochrana farmaceutic-kých dat úspěšných léčiv −Nástup generik a bionapodobenin - pokles tržeb za původní přípravky (tržby za atorvastatin činily až 12,9 mld. $ ročně, po skončení patentové ochrany v r. 2011 klesaly a v r. 2018 činily jen 2,1 mld. $; v roce 2018 dosahovaly tržby výrobců za 10 originálních léčiv, jejichž patentová ochrana končila v r. 2019, celkem 21,1 mld. $ ) −Snahy o prodlužování patentové ochrany (jiné polymorfy, enantiomery místo racemátů, nové lékové formy) • Inovativnost léčiv •Základní kategorie A.Nová struktura, nové přínosy pro terapii (dosud neexistovala vhodná terapie, rozšíření možností léčby pro pacienty nereagující na dosavadní léčbu) B.Nová struktura (odlišná od dosud používaného léčiva), známé terapeutické přínosy -“me too” (vyšší účinnost, nižší vedlejší účinky, další účinky, lepší vlastnosti, výhody pro specifické skupiny pacientů, překonání/ rozšíření patentové ochrany, „bionapodobeniny“) •C. Známá struktura, nové přínosy pro terapii (“profarmaka”, účinný enantiomer místo racemátu, nový typ soli, směrování účinku, nové indikace, nové lékové formy) •D. Známá struktura, známé přínosy (generika, fixní kombinace) Fáze výzkumu a vývoje léčiv (3 x DD) vFáze objevu (Drug Discovery) –hledání prvních látek s požadovanou účinností („hity“ → vodítková látka/lead compound) vFáze návrhu (Drug Design) –modifikace vodítka – optimalizace vlastností, výběr nejlepších kandidátů pro další vývoj vFáze vývoje (Drug Development) –vývoj technologie výroby, metod hodnocení, preklinické a klinické zkoušení –Kategorie inovativnosti 1 – všechny 3 fáze VaV –Kategorie inovativnosti 2 a 3 – 2. a 3. fáze VaV –Kategorie inovativnosti 4 – jen 3. fáze VaV Časová náročnost VaV nového léčiva •Nové léčivo přichází na trh nejdříve za 8 let po objevu (průměr: 12-15 let) Objevování nových léčiv - hledání vodítka (lead compound) pro další vývoj •Šťastná náhoda – 5,8% léčiv –minulost? •Racionální přístup •Screening –Hledání účinných přírodních látek, příprava jejich derivátů –Nové syntetické látky •náhodný výběr - příklad NCI – otestováno na 100.000 látek •cílený výběr - na základě znalostí cílových struktur • vyhledávání celých molekul • na fragmentech založený objev léčiva • zkoušky účinnosti léčiv v nových indikacích (např. při terapii Covid-19) • – prvky náhodného i cíleného výběru •„translační“ výzkum • využití poznatků základního výzkumu v molekulární biologii, biochemii a lékařství ve farmakochemii a odtud přes preklinické a klinické hodnocení do praxe – „od laboratorního stolu k lůžku pacienta“ (“bench-to-bedside“) Příklad objevu a vývoje léčiva - šťastná náhoda: DIAZEPAM viz text přednášky Translační výzkum od pacienta k farmakochemikovi a zpět (bench-to-bedside) • Objevování nových léčiv - metodický přístup •Identifikace a validace cílových struktur • poznání úlohy určitých cílových struktur v patogenezi onemocnění • předpoklady ovlivnění jejich funkce •Zpracování projektu VaV a vytvoření pracovní hypotézy •Vytvoření multidisciplinárního týmu •Výběr a validace biomarkerů – měřitelných indikátorů stavu organismu • biochemické, fyzikální, fenotypické biomarkery • doložení významu biomarkeru pro kontrolu účinku/vedlejších účinků • zkoušené látky • posouzení biomarkerů z hlediska jejich stanovení i citlivosti, specifičnosti, • přesnosti, robustnosti a reprodukovatelnosti při screeningu látek •Syntéza a screening látek s předpokládanou účinností • výběr látek vycházející z dosavadních poznatků a zkušeností • počítačové modelování (při znalosti prostorové stavby cílové struktury) • (kombinatoriální) syntéza • vypracování metodiky screeningu • screening látek (klasický, virtuální, vysokokapacitní, vysokoobsahový, • screening pro včasné zjištění nežádoucích vedlejších účinků) • hity screeningu (jsou účinné, ale dosud nemusí mít charakter léčiva) • vodítková látka (vybraný hit) – základ pro optimalizaci struktury Screening – zjišťování biologické účinnosti •Screening in vitro, in vivo, in silico •Klasický a vysokokapacitní (high throughput) screening • – biomarkery umožňující posouzení účinnosti látek • – změny funkčnosti (inhibice, aktivace…), vazebné interakce (značené biomarkery) • – rozdíly v metodice •Vysokoobsahový (high content) screening • – sledování vlivu látek na celé buňky • – automatizovaná fluorescenční mikroskopie s analýzou obrazu, průtoková cytometrie • – komplexnost, avšak méně podrobností (např. ovlivnění celé signalizační kaskády) •Virtuální screening („in silico“) • – počítačové modelování (docking & scoring) • – vychází z rostoucích znalostí prostorové stavby • enzymů, receptorů atd. (rtg. krystalografie a NMR • bílkovin – dnes až 100 tis. prostorových struktur) • – zjišťuje se, zda molekula může interagovat s aktiv- • ním/s alosterickým místem cílové struktury • – návrh interagujících molekul de novo → syntéza a • otestování • – komplikace: flexibilita prostorové stavby cílové • struktury i molekul potenciálních léčiv a dynamika • jejich vzájemných interakcí za reálných podmínek Klasický přístup Syntéza a screening mnoha složitých molekul •„Hity“ •disociační konstanty komplexů látky s cílovou strukturou řádu 10-7-10-9 mol/l •obrovský počet možných struktur (až 1060 molekul s 30 atomy) •složité molekuly •obvykle ještě nemají vlastnosti léčiva • např. problémy s rozpustností, biologickou dostupností, toxicitou apod. • •výběr vhodných hitů jako „vodítek“ („lead compounds“) pro optimalizaci struktury a vlastností v další etapě • Na fragmentech založený objev léčiva (FBDD) •Fragmenty struktury budoucího léčiva • stavební kameny mnohem účinnějších látek • jednoduché látky s nižší molekulovou hmotností (do 300) interagující s cílovou strukturou • samy nemají dostatečnou účinnost (disociační konstanty komplexů s cílovou strukturou řádu 10-3-10-6 mol/l) • menší konečný počet fragmentů (řádově 102) • databáze fragmentů, privilegované struktury • - problémy s vyhledáváním fragmentů: • vazba fragmentu/inhibice, vazebné místo, • funkční screening – biochemické postupy (vysoké koncentrace) • fyzikální postupy (NMR, MS, rentgenografie) •Metodika FBDD • vyhledávání „fragmentů“ • optimalizace fragmentů • počítačové modelování fúzovaných molekul • fúze a spojování fragmentů • screening Na fragmentech založený objev léčiva (FBDD) • • • • • • • • • • • • •Vemurafenib – první povolené léčivo, k jehož objevu byla využita metodika FBDD (povolen v letech 2011-2 pro léčbu metastázujícího melanomu) Kombinatoriální syntéza •Vývoj metodiky: •Syntéza v pevné fázi •Paralelní syntéza •Kombinatoriální syntéza v pevné fázi • • • • • • • •Kombinatoriální syntéza v kapalné fázi • rozpustný polymerní nosič, odstranění nespotřebovaných reaktant ultrafiltrací Paralelní syntéza Kombinatoriální syntéza - knihovny sloučenin velký počet látek ® vysokokapacitní screening identifikace účinných kombinací Purvalanol B - 1000 x účinnější než olomoucin Využití při syntéze peptidů, ale i jiných látek Příklad: inhibitory cdk2 (analoga olomoucinu) Vysokokapacitní (high throughput) screening pro knihovny sloučenin •Využití vazebných interakcí s cílovou strukturou (enzym, receptor, strukturní bílkovina, DNA apod.) - binding assay –Zkoušení v pevné fázi – kuličky nosiče se rozdělí (mikrotitrační destičky) – cílové struktury se označí radioisotopem, chromogenní, fluorescenční nebo luminiscenční značkou – inkubace, posouzení intenzity vazby – výběr kuliček nosiče s účinnými látkami •Využití funkčních vlastností (inhibice apod.) –Zkoušení v roztoku po odštěpení látky od nosiče (mikrotitrační destičky) •Citlivost screeningu - 1 μmol/l • (kulička Ø 0,1 mm – 0,1 nmol látky – 0,1 ml činidla v jamce) –Zvýšení citlivosti - větší kuličky, destičky s 384 nebo 1536 jamkami •Automatizace vyhodnocování –až 10 mil. sloučenin za den - knihovna pentapeptidů z 20 aminokyselin •Identifikace –Analýza individuálních produktů, směsných vzorků –® určení struktury látek v mikromolárním množství – obtížný úkol DNA-kódování chemických knihoven •Kombinatoriální syntéza umožňuje rychlou přípravu rozsáhlých knihoven látek, identifikace hitů je však obtížná a zdlouhavá •Řešení problému: použití DNA jako nosiče i jako identifikační značky –„čárového kódu“ unikátního pro každou připravenou látku •DNA-recorded combinatorial chemistry – DNA slouží jen k identifikaci: • • • • • • •Po přípravě knihovny látek a oddělení látek interagujících s cílovou strukturou se DNA značka odštěpí, pomnoží polynukleázovou řetězovou reakcí a identifikuje buď sekvenováním nebo hybridizací s komplementárními oligonukleotidy v mikročipech (DNA-microarray) •DNA-directed combinatorial chemistry (DCC) – DNA využita nejen k identifikaci, ale i ke specifickému připojení určité látky na původní sloučeninu – výběr látek na základě hybridizace oligonukleotidů – bylo vypracováno několik variant této techniky DNA řízená kombinatoriální knihovna • • • • • • • • • •B.N. Tse, T.M. Snyder, Y. Shen a D.R. Liu, J. Am. Chem. Soc., 2008, 130 (46): 15611-15626). • Dynamická kombinatoriální chemie •Metoda pro vytváření knihoven nových sloučenin termodyna- micky kontrolovanými reverzibilními reakcemi a interakcemi určitých stavebních bloků. •Stavebními bloky mohou být slabě interagující fragmenty (návaznost na FBDD) •Rovnovážné zastoupení produktů dynamické kombinatoriální knihovny určuje jejich termodynamická stabilita. •Dynamická kombinatoriální knihovna může být generována v přítomnosti bílkovin nebo nukleových kyselin jako cílových struktur. Přitom se může zastoupení produktů dynamické kom- binatoriální knihovny změnit ve prospěch látek, které s těmito cílovými strukturami nejsilněji interagují. Dynamická kombinatoriální chemie • Reverzibilní vazby Bílkovinou řízená dynamická kombinatoriální knihovna • • • • • • • • • • • • • • R. Huang, I.K.H. Leung, Molecules, 2016, 21, 910-927 Vodítková látka •Vodítková látka (lead compound, lead) -výběr ze souboru „hitů“ nalezených při screeningu • (látka s nejvyšší účinností a nejlepšími vlastnostmi) • • „hit“ → vodítko • fáze návrhu ↓ (optimalizace struktury) • léčivo