CG030 – Struktura (architektura) a
funkce proteinových komplexů
doc. Jan Paleček
jpalecek@sci.muni.cz
(garant)
UKB A2, 214
laboratoř Strukturních proteinů eukaryotních chromosomů
Osnova kurzu
• úvod – metody analýzy proteinových
komplexů, strukturní biologie
• funkce proteinů (chaperony, PTM, PPI,
signální dráhy …) a komplexů (proteasom)
největší proteinové komplexy = chromosomy
• DNA-vazebné komplexy
• Komplexy v transkripci
• Komplexy v replikaci
• Komplexy opravující poškozenou DNA
• Komplexy chromatinu
• Evoluce proteinů a komplexů
obecnéGENOM
závěrečná
proteasom
TFIIB
Rpb4/7
RNA pol II
TFIIE
TFIIF TFIIH
TBP
TFIIA
Příklady komplexů o kterých uslyšíte v tomto kurzu
chaperon
RNA polymeráza
nukleosom
RNA polymeráza + TFII…
obecné
chromatin
Molekula měsíce (PDB 101)
enhanceosom
Informační zdroje
Alberts a spol: Molecular biology of the Cell
Liljas a spol: Structural biology (2009) …
… nejnovější články z časopisů Cell, Nature, Science …
Databáze proteinových struktur: http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do,
http://www.ebi.ac.uk/pdbsum/
Primárním zdrojem strukturních informací = PDB
Interaktivní web PDB-101 - relativní velikost komplexů
voda, ATP ATP pumpa
mikrotubuly chromatinaktin-myosin
27.02.202010-11.30 hod A2-2.11 doc. Paleček Úvod, analýza komplexů
05.03.202010-11.30 hod A2-2.11 doc. Paleček Úvod, PPI, skládání komplexů
12.03.202010-11.30 hod A2-2.11 Dr. Muller Chaperony
19.03.202010-11.30 hod A2-2.11 Mgr. Adamus Ubiquitinace, ligasy (cullin, APC), proteasom
26.03.202010-11.30 hod A2-2.11 doc. Paleček DNA-proteinové interakce, vazebné motivy
02.04.202010-11.30 hod A2-2.11 Mgr. Balkoová replikace DNA
09.04.202010-11.30 hod A2-2.11 doc. Paleček DNA-proteinové interakce, transkripční komplexy
16.04.202010-11.30 hod A2-2.11 doc. Paleček Chromatinové komplexy
23.04.202010-11.30 hod A2-2.11 Dr. Šebesta Oprava DNA, homologní rekombinace
30.04.202010-11.30 hod A2-2.11 doc. Paleček Evoluce proteinových komplexů
07.05.20209-12 hod A2-2.11 doc. Paleček Zkouška - test
14.05.2020 Dies academicus
Program přednášek 2017
- Pohled na vybrané procesy probírané v biochemii a molekulární biologii z
hlediska proteomiky a především z hlediska proteinových komplexů
- výběr komplexů majících vztah k tématům studovaným v laboratořích
„chromatinových molekulárních komplexů“, NCBR a dalších skupin z MU
GENOMobecné
Související: Cvičení z modelování proteinových komplexů (CG031),
Struktura a funkce eukaryotických chromozomů (C9041, prof. J. Fajkus),
Metody proteomiky (CG090) …
Zkouška: - test + přednáška
• Úvod - Analýza proteinu
– Domény
• fold-struktura (ss, PDB)
• v PyMolu připravit 3D strukturu
• Interakce (IntAct)
– Komplexy
• Funkce
• Lokalizace
– evoluce
• Konkrétní nová data – článek (< 5 let)
Ujasnit si souvislosti, rozšířit si znalosti, aplikovat
poznatky z přednášek …
~1000 komplexů v kvasince Saccharomyces cerevisiae
Bertero et al, Cell, 2010
Nejčastější postup charakterizace
proteinových komplexů
Nový gen/protein – charakterizace funkce a funkčního kontextu =>
1. - identifikace partnerů tzn. PPI, respektive izolace komplexu
2. - charakterizace komplexu
- vzájemné PPI podjednotek - architektura/struktura komplexu
- funkce podjednotek (genetická analýza, lokalizace v buňce)
3. - rekonstituce a analýza aktivit celého komplexu in vitro
Prolínají se analytické a izolační:
- ultracentrifugace, gelová filtrace
- TAP-tag (a jiné tagy) purifikace a MS analýza
- ko-imunoprecipitace, pull-down, ko-purifikace …
- crosslink MS, X-ray, (cryo) elektronová mikroskopie …
(Prolínají se i metody pro komplexy a PPI - viz MePro – 30.3.2020)
… visualizační metody
Metody izolace a analýzy
proteinových komplexů
Metody analýzy a izolace PKxů
Ultracentrifugace – analytická (preparativní – malé objemy)
Cukerný/hustotní gradient
Čím hustší je roztok tím více „brzdí“ částice => těžší („hustější“) částice projdou dál
přesně vyvážit!
Cukerný/hustotní gradient
A. Hrubší pouze rozdělí na
kompartmenty/organely - lokalizace
B. Jemný - cukerný gradient - izolace
Lee et al, Plant Cell Phys, 2004
T – total
S – soluble
M – membranové
frakce (… jaderná
…)
Metody analýzy a izolace PKxů
Čím hustší je roztok tím více „brzdí“ částice => těžší („hustější“) částice projdou dál
Ultracentrifugace – analytická (preparativní – malé objemy)
- Gelová filtrace (size exclusion chromatography)
- Za nativních podmínek (komplexy zůstávají pohromadě)
Lze poznat zda proteiny tvoří oligomery, agregáty
Metody izolace a analýzy PKxů
Tayloretal,MCB,2008
GF: frakce lyzátu
lidských buněk –
podjednotky SMC5-6
komplexu identifikovány
pomocí protilátek
Příklad: SMC5/6 komplex – v buněčném lyzátu (nebo
purifikované proteiny)
- TAP-tag („Tandem-affinity purification“,
jiné tagy a protilátky)
Tandem-affinity purification
(vícestupňové – vyšší čistota)
1. Protein A (váže IgG beads)
2. TEV-proteasové místo (tobacco
etch virus) – uvolnění z matrice
3. calmodulin-binding
(CBP) – eluce EDTA
Zaintegrované v genomu (přirozená
hladina proteinu, přirozený výskyt
partnerů/komplexu …)
Protein CBP A
Puig et al, Methods, 2001
I jiné kombinace
(HBH – His-biotin-His)
Metody izolace a analýzy PKxů
známe jeden protein – hledáme další
podjednotky
Gavin et al., Nature, 2006
Izolace komplexů z kvasinky Saccharomyces cerevisiae
2
Velmi vhodný HALO tag pro izolaci komplexů: kovalentně vázaný ligand (silnější
vazba, více oplachů)
Metody izolace a analýzy PKxů
Uvolnit lze pouze proteolytickým štepením (nevýhoda) – vs štěpení specificky uvolní
pouze komplex z matrice (nespecificky navázané proteiny zůstanou na matrici)
Lambertetal,JProt,2015
Různé přístupy charakterizace komplexů
Biotinylace na
vzdálenost
<20nm
MS identifikace
biotinylovaných
proteinů
klasický alternativní
Metoda BioID
Roux, CMLS, 2013
BirA biotin ligása (fusovaná k proteinu)
Biotinylované proteiny jsou purifikovány pomocí streptavidinu
Přidání biotinu v
určitém čase (rychlé
připojení) – pulsechase
– lze sledovat
interakce v čase
(např. buněčný
cyklus)
Např. chromatinasociované
komplexy
jsou hůř rozpustné –
izolace za
denaturačních
podmínek
Citlivá metoda
(kovalentní značka
zústává i po oddálení
interakčního partnera
– slabé/transientní
interakce (více než
komplex –
„sousedící“ proteiny
<20nm)
Lambert et al, J Prot, 2015
Histon chaperony
(16.4.2020)
Metoda BioID
PPI v čase
Přidání biotinu v
určitém čase (rychlé
připojení) – pulsechase
– lze sledovat
interakce v čase
(např. buněčný
cyklus)
Např. chromatinasociované
komplexy
jsou hůř rozpustné –
izolace za
denaturačních
podmínek
Citlivá metoda
(kovalentní značka
zústává i po oddálení
interakčního partnera
– slabé/transientní
interakce (více než
komplex –
„sousedící“ proteiny
<20nm)
Metoda BioID – organizace komplexů
Dosah biotinylace je 10-20nm – lze využít
k mapování „blízkých“ proteinových
sousedů ve velkých komplexech
Kimetal,PNAS,2014
Jednoduché tagy/značky:
Myc, FLAG, V5, S-tag, GFP (vazba přes protilátky)
GST, Streptactin (biotin-streptavidin), MBP … (vazba přes ligandy)
Známe-li více podjednotek - značky na různé
podjednotky komplexu (vs TAP na jedné
podjednotce) – postupná purifikace => kompletní
komplex (vychytaný přes různé podjednotky)
Ko-imunoprecipitace
MS analýza SDS-PAGE
nebo roztoku
Pozor na kontaminace
(např. chaperony)
SDS-PAGE
blot
Sergeantetal,MCB,2005
protilátky
Kompetičníeluce(peptidyneboligandy)
SMC6
SMC5
Nse4
Ko-purifikace
Silné interakce/komplexy – proteiny lze ko-exprimovat (může
pomoci s jejich rozpustností) a následně ko-purifikovat
Totalextract
FT
Solublefraction
25
35
40
55
70
1.
Input
15
10
25
35
40
55
70
15
10
2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10.
FT
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11.
Elution fractions – 10ml Elution fractions – 1,5ml
Nse3
Nse1
Nse4
1. His-tag Nse3
(Nse3 více než Nse4)
2. Strep-tag Nse4
(srovnal se poměr Nse3:Nse4)
Strep
Strep
6xHis
Nse4Nse3Nse1
Nse4 protein se samostatně exprimuje málo a je málo rozpustný
Značky na různých podjednotkách komplexu –
postupná purifikace => kompletní komplex
(přirozený poměr podjednotek v komplexu)Zabrady et al, NAR, 2016
Ko-purifikace
0.00
0.25
0.50
0.75
1.00
1.25
1.50
1.75
0.0
10.0
20.0
30.0
40.0
50.0
60.0
70.0
80.0
90.0
100.0% Buffer B
60.00 120.00
Tube #:2 4 6 8 10 13 16 19 22 25 28 31 34 37 40 1 3 5 7 9 11 14 17 20 23 26 29 32 35 38 41
15
25
35
40
55
70
input
29A
30A
31A
32A
33A
34A
35A
36A
37A
38A
39A
40A
41A
42A
1B
2B
3B
4B
5B
6B
7B
8B
9B
10B
11B
12B
Nse1-3-4 Nse1-3 Nse1
Nse1,-3,-4
Nse1,-3
Nse1
3. Gelová filtrace – lze ještě dočistit subpopulace komplexů
Nse3
Nse1
Nse4
agregáty
Roux, CMLS, 2013
Sinz, MS Reviews, 2006
Identifikace
podjednotek
komplexu
Mapování
interakcí
podjednotek
Mapování komplexů - crosslinking
crosslink propojí podjednotky - stabilizuje komplex
Na purifikovaných komplexech nebo komplexu XL v buňce a poté purifikace za
denaturačních podmínek (tag-ligand interakce musí být odolná vůči denaturačnímu
činidlu – např. 6xHis-tag váže Ni-kuličky i v 8M močovině nebo HALO-tag)
- estery reagují s Lys (ε-amin)
- homofunkční - spojí proteiny
dohromady v jednom kroku
- heterofunkčních - postupná aktivace
Leitner et al., Trends in BS, 2015
Adamus et al, JMB, in revision
- krosslink vypurifikovaných
částí komplexu SMC5/6
- 3 hotspots silně
prokroslinkované –
ramena proteinů SMC5SMC6
jsou vedle sebe
(nikoli kroužek)
Schilbach et al, Nature, 2017
- crosslink data podpoří/doplní strukturní
informace z krystalografie nebo
kryoEM
analýza PIC-MED komplexu
(~50 podjednotek - ~2MDa)
crosslink uvnitř a mezi proteiny
Schilbachetal,Nature,2017 analýza PIC-MED komplexu
(~50 podjednotek - ~2MDa)
- způsob sběru dat, klasifikace
a rekonstrukce struktury
komplexu pomocí kryoEM
Schilbach et al, Nature, 2017
Lossl et al, EMBO J, 2016
Lossl et al, EMBO J, 2016
Marsh et al, ARB, 2015
Použití metod strukturní biologie
pro studium proteinových
komplexů
- krystalografie – nejvhodnější
(boom v minulé dekádě díky
sekvenačním projektům)
- NMR je limitována velikostí
- cryoEM je vhodná pro velké
komplexy (boom v současnosti)
Doksani et al, Cell, 2013
Mikroskopie
Gallego et al, EMBO J, 2016
Konfokální mikroskopie vs
super-resolution
mikroskopie
(STED=stimulated emission
depletion microscopy –
rozlišení 60nm)
+ AFM (atomic force
microscopy)
Lokalizace
proteinových
komplexů
Gallego et al, EMBO J, 2016
Bax protein vytváří póry v
mitochondriální membráně
(apoptósa)
Lokalizace
proteinových
komplexů
Uchihashi et al,
Nat Prot, 2012
AFM
atomic
force microscopy
Speranzini et al, EMBO J, 2016
Analýza proteinových komplexů
více Metody GP
více doc. Hofr 6.4.2020 + C7230
Ozeretal,COinSB,2015
Analýza proteinových komplexů
Johnson et al., Nat Meth, 2015
Existuje mnoho
nástrojů na
visualizaci
komplexů (i v
buněčném
prostředí)
od PyMOL pro
přímou visualizaci
krystalových
struktur
… až po CellPACK
pro interaktivní
náhled do buňky a
jejích procesů
…vychází z herních
a animačních
algoritmu …
Visualizace proteinových komplexů
Johnson et al., Nat Meth, 2015; Iwasa, CO in SB, 2015
Visualizace proteinových komplexů
Pro lepší představu (virové částice) se integrují … (nakopírované) struktury,
data z molekulární dynamiky (simulací), koordináty pohybu „objektu“ ve
světelném mikroskopu … animovat i buněčný kontext – namíchat v „reálných“
poměrech do „organel“ a na „membrány“ – CellPack …
Lze použít k testování modelů …
Visualizace proteinových komplexů - CellPACK
CellPACK poskytuje vhled do
buněčných procesů – použit
na simulaci distribuce proteinů
virové částice (např. R-noMa:
random-bez interakcí)
Env clusterGag-Env náhodné Gag-Env interagují
PočetEnvohnisek
1
2
>2
Experimentální výsledek
Johnson et al., Nat Meth, 2015
Visualizace proteinových komplexů
Existuje mnoho
nástrojů na
visualizaci
komplexů
od PyMOL pro
přímou visualizaci
krystalových
struktur … 3D tisk