- komplexy podílející se na replikaci DNA
- komplexy účastnící se přepisu informace
- komplexy opravující poškozenou DNA
cover popup
TFIIB
Rpb4/7
RNA pol II
TFIIE
TFIIF
TFIIH
kvasinkový PIC komplex
Gibbons et al, PNAS, 2012
TBP
TFIIA
TRANSKRIPCE
[USEMAP]

- komplexy podílející se na replikaci DNA
- komplexy účastnící se přepisu informace
- komplexy opravující poškozenou DNA
- komplexy vytvářející strukturu chromosomu
- samotný chromosom je obrovským dynamickým nukleoproteinovým komplexem (nikoli holá DNA)
TRANSKRIPCE
OPRAVA DNA
Co zde schází??
Chromatin = histony …
figure 6-16
[USEMAP]

- Samotný chromosom je obrovským dynamickým nukleoproteinovým komplexem s mnoha odlišnými částmi
- DNA makromolekula asociovaná s různými proteinovými komplexy – (lidský genom 3x109bp – natažený
řetězec 1chromosomu cca 4cm!!)
Average human chromosome:
DNA molecule: ~4 cm
Mitotic chromosome ~4 µm
-
chromosomy
10 000x
Genome sizes:
human 3 billion bp (x2 dipl) 2 m
field bean 13 billion bp 9 m
trumpet lilly 90 billion bp 60 m
salamander <120 billion bp 80 m
[USEMAP]

- Samotný chromosom je obrovským dynamickým nukleoproteinovým komplexem s mnoha odlišnými částmi
- DNA makromolekula asociovaná s různými proteinovými komplexy – (lidský genom 3x109bp – natažený
řetězec 1chromosomu cca 4cm!!)
- komplexy vytvářející strukturu chromosomu
- vytváří základní strukturu
- nukleosomy – chaperony, remodelační komplexy
- histon H1, HP1 protein
- vytváří specializované domény
- centromery, telomery
- podílí se na dynamice struktury
- SMC komplexy - kohesin, kondensin a SMC5/6
chromosomy
přednášky prof. Fajkuse:
Struktura a funkce eukaryotických chromozomů (C9041)
[USEMAP]

- 146bp – histon fold - centrální část DNA váže tetramer H3-H4
- okraje DNA vážou dimery H2A-H2B
- 10bp konce DNA vážou N-koncové šroubovice H3 (acetylovaný K56)
PDB: 1KX5
[USEMAP]

Skládání histonů do nukleosomu (komplexu)
-
-
- 146bp - centrální část DNA váže tetramer H3-H4
- H3 dimerizuje přes postraní šroubovici
- okraje DNA vážou dimery H2A-H2B
- 10bp konce DNA vážou šroubovice H3
(acetylovaný K56)
-
-
Ransom et al, Cell, 2010
[USEMAP]

Figure 4-26 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
figure 4-26
Sestavování nukleozomu:
- Silnější je interakce mezi H3-H4
- H3 dimerizuje přes postraní šroubovici a vytváří tetramer který asociuje s DNA
- dimery H2A-H2B se vážou následně z obou stran tetrameru (H3-H4)2
-
-
- při uvolňování odpadají nejdříve dimery H2A-H2B
- H2A a H3 existují ve více variantách, které mohou být zaměněny v nukleosomu
Ransom et al, Cell, 2010
sbalování a rozbalování nukleosomů
[USEMAP]

H3-H4
Wang et al, Prot Cell, 2015
PDB: 5C3I
ASF1 (antisilencing function)
- interferuje s tetramerizačním povrchem
- skládání (assembly i disassembly)
[USEMAP]

H3-H4
CAF-1 (chromatin assembly factor)
Složen ze 3 podjednotek (p55 podjednotka)
interferuje s vazbou H3/H4 na DNA
Song et al, G&D, 2008
PDB: 3C9C
[USEMAP]

H3-H4
Hondele et al., Nature, 2013
Kemble et al, Mol Cell, 2015
PDB: 4KHA
FACT (facilitates chromatin transcription)
složen ze 2 podjednotek (Spt16 a Pob3/SSRP1)
interferuje s vazbou H2A/H2B …
[USEMAP]

FACT (facilitates chromatin transcription)
pomáhá při assembly …
Liu et al., Nature, 2020
[USEMAP]

- 10bp konce DNA vážou N-koncové šroubovice H3 (acetylovaný K56)
- Asf1 moduluje H3K56 acetylaci …
- H3K56Ac interferuje s vazbou na DNA (cca 8x slabší) – nestabilní pozice nukleosomu je následně
„upravená“ pomocí remodelačních komplexů (a teprve poté je H3K56 deacetylován a nukleosom
stabilizován)
[USEMAP]

Ransom et al, Cell, 2010
Histon chaperony - replikace
- na ssDNA nukleosomy nejsou: replikace, transkripce, oprava DNA ...
- před těmito procesy se musí histony odstranit a poté zase nabalit … (feedback: inhibice chromatin
assembly inhibuje disassembly nukleosomů)
- ASF1 (váže MCM, disassembly) + CAF1 (váže PCNA, assembly) pro H3-H4, FACT (váže MCM -
disassembly)
250-300bp – cca nukleosom
H3K56Ac
[USEMAP]

Histon chaperony
- funkce při replikaci … popsané na předchozím slide
- funkce při opravě DNA (napomáhá výměně H2A za specifický fosfo gH2AX
- … další chaperony a remodelační faktory … specifické varianty H3 a H2A
Ransom et al, Cell, 2010
[USEMAP]

figure 4-41
Figure 4-41 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)     Mattiroli et al, EMBO Rep,
2015
Histonové varianty
(u kvasinek gH2A
fosforylovaný H2A)
[USEMAP]

- 10bp konce DNA vážou N-koncové šroubovice
- CENP-A (H3 varianta) má kratší šroubovici
-vazba na DNA je slabší tj. otevřenější struktura
-… jiný interakční povrch pro specifické interakční partnery …
PDB: 3AN2
[USEMAP]

- 10bp konce DNA vážou N-koncové šroubovice
- CENP-A (H3 varianta) má kratší šroubovici
-vazba na DNA je slabší tj. otevřenější struktura - přístupnější
-… jiný interakční povrch pro specifické interakční partnery …
[USEMAP]
Yan et al., Nature, 2019
Takizawa et al, Structure, 2020

Yan et al., Nature, 2019
CENP-A(H3) nukleosom a další CENP proteiny tvoří vnitřní kinetochoru … kotví vnější kinetochoru a
mikrotubuly
[USEMAP]

Variantní histony mohou vyznačovat hranice chromozomálních domén. (A) Typický chromozom vykazující
doménové členění. (B) V kvasinkách brání H2A.Z šíření umlčeného chromatinu do sousedních oblastí…
(D) Centromerické nucleozómy obsahují centromerickou variantu H3.
Varianty histonů
- CenH3/CENP-A … specificky v centromerách
- H2A.Z - v regulaci transkripce, opravě DNA, hranice chromatinu (integrita centromer a telomer)
[USEMAP]

Bednar et al, Mol Cell, 2017
Cutter a Hayest, FEBS Let, 2015
Nukleosom může být stabilizován H1/H5 histony
[USEMAP]
H1 WHD doména

Machida a spol, Mol Cell, 2018
Jacobs, Science, 2002
Heterochromatin protein – HP1
obsahuje chromodoménu, která se váže na 3x-metylovaný lysin (H3K9me3) – dimer spojuje dva
„metylované“ nukleosomy – kondenzovanější a rigidnější struktura chromatinu
dimer
chromodomena
H3K9me3
[USEMAP]

Chromatinová struktura?
figure 4-72
PDB: 6L49
Ekundayo et al, JMB, 2017
[USEMAP]

Ou a spol, Science, 2017
https://players.brightcove.net/53038991001/Byx2STOH0_default/index.html?videoId=5522198641001
[USEMAP]

Ohno, Cell, 2019
2 typy sbalení (4) nukleosomů: pyramidální (jako a-šroubovice)
je kompaktnější; kosočtverec (jako b-list plochý) je otevřenější
kombinace Hi-C a mapování pozic nukleosomů = Hi-CO
[USEMAP]

Nukleosomy jsou také více vzdáleny na začátku a konci genových oblastí
(pyramidální a je kompaktnější)
kosočtverec b je otevřenější –
na počátcích a koncích genových oblastí
a
b
[USEMAP]

Heterochromatin – vysoce spiralizovaný (kompaktní) chromatin;
transkripčně neaktivní geny, repetitivní sekvence,
transpozony; oblast centromer, pericentromer a telomer
Konstitutivní a fakultativní heterochromatin
Euchromatin – rozvolněné
uspořádání, obsahuje
transkribující se geny
[USEMAP]

Takahashi, CO in CB, 2019
Kondensované
Mitotické
chromosomy
cell
cycle
Interfázní chromatinová vlákna
[USEMAP]

Billon a Cote, BBA,
2012
    Bao, Snapshot-Cell, 2010
Remodelovací komplexy
- ATP-dependentní remodelace (SWI2/SNF superrodina)
- „sklouznutí“ (INO80), rozložení, odstranění nukleosomu nebo „výměna“ histonových dimerů
SWR komplex specificky zaměňuje (exchange) H2A-H2B dimer za H2A.Z-H2B
[USEMAP]

RSC remodelovací komplex
RSC (SWI/SNF) komplexy obklopí nukleosom (rozvolní se vazba s DNA a posouvá se)
[USEMAP]

- „sklouznutí“, rozložení, odstranění nukleosomu nebo „výměna“ histonových dimerů
Bao a Shen, Snapshot in Cell, 2010
- INO80 komplex sliding + zaměňuje H2AZ-H2B dimer zpět za H2A-H2B
[USEMAP]

Gerhold a Gasser, TiCB, 2014
- RSC (SWI/SNF) komplexy obklopí nukleosom (rozvolní se vazba s DNA a posouvá se)
- nukleosom je zavěšen na SWR-C komplexu – komplex váže ještě H2… dimer, který je schopen vyměnit
- nukleosom je uchopen INO80 komplexem (přes podobné složení podjednotek – fungují odlišně)
[USEMAP]

Ohno, Cell, 2019
figure 4-72
Strukturní úrovně uspořádání chromatinu
Nukleosomy
Strukturní proteiny
[USEMAP]

Komplexy SMC
SMC dimery (homo- a hetero-) - konzervovanější (starší) než histony
non-SMC podjednotky (2 – 6)
Prokaryota                        Eukaryota (esenciální)
[USEMAP]

SMC6     SMC5
-  SMC jsou nezbytné pro vytváření chromatinových smyček
- podílí se na segregaci, kondenzaci chromosomů, chromatinových struktur (TAD) … a na opravě DSBs
-  složení SMC komplexů
- dlouhá ramena SMC, dimerizace přes hinge, ATPase heads přemostěny ATP a kleisinovou podjednotkou
- SMC proteiny vytváří kroužky, které drží DNA
Haering and Jessberger, Exp Cell Biol, 2012
[USEMAP]

Carlsten et al., TiBS, 2013
kohesin interaguje s mediatorem
- mediator interaguje s GTFs a RNA polymerázou (zprostředkuje interakce mezi GTFs a aktivátory
transkripce)
- kohesin interaguje s mediátorem a napomáhá tvorbě transkripčních smyček
[USEMAP]

Bonora et al, CO in GD, 2014
Pugacheva et al., PNAS, 2020
Li et al., Nature, 2020
Kohesin interaguje s CTCF
- CTCF (zinc-finger) „izoluje“ transkripční faktory a reguluje trankripci
- interakce vymezuje kohesinové smyčky
- utváření vyšších chromatinových struktur (TAD – topologically associated domains)
[USEMAP]

Bodnar and Specter, Cell, 2013
Phillips-Cremnis et al, Cell, 2013
Schoborg et al, CMLS, 2014
Full-size image (43 K) Full-size image (52 K)
kohesin se podílí na regulaci „cell-specific“ transkripce a chromatinové struktury (např.
diferenciace kmenových buněk)
TAD – topologicky asoc. domény
[USEMAP]

4. smyčky tvoří TADs
2. nucleosomy
1. DNA
3. krátké smyčky
5. TADs klastrují do kompartmentů
kompartmenty A a B (hetero- and euchromatin) …
Interfáze
nový model struktury chromatinu
6. Chromatinové vlákno (1 chromosomu)
 okupuje určité teritorium
Kompartmenty (A a B) – do jisté míry se překrývají s oblastmi euchromatinu a heterochromatinu
v interfázi okupují jednotlivé chromosomy určité oblasti jádra (ve formě chromatinových vláken)
[USEMAP]

Full-size image (52 K)
v interfázi okupují jednotlivé chromosomy určité oblasti jádra (ve formě chromatinových vláken) – v
průběhu mitózy chromosomy kondenzují do typických X-struktur (kvůli snadnější segregaci)
interfáze vs mitoza
figure 4-20
[USEMAP]

Dynamika chromatinu
Dr. Gorbsky
Kondensace chromatinu = kondensin
Držení sesterských chromatid = kohesin
[USEMAP]

kohesin
-„navlékání“ SMC komplexů na chromatin v průběhu buněčného cyklu
-kohesin obepíná 2 vlákna a drží je až do anafáze – otevře se proteolyticky
[USEMAP]

Kondensin II vytváří lineární smyčky (osová komprese),
kondensin I kondensuje laterálně
Kschonsak a Haering, BioEssays, 2015
[USEMAP]

Ganji et al, Science, 2018
Takahashi, CO in CB, 2019
konce molekuly DNA uchyceny
přidán kondenzin + vazba a hydrolýza ATP – vytvoření smyčky („loop extrusion)“
[USEMAP]

in vitro rekonstrukce chromosomů
Shintomi et al, NCB, 2015
chromatin
DNA + H3/H4/H2A/H2B … FACT … TopoII … kondensin I (+ATP)
kondensin I a TopoII
postačovaly pro rekonstrukci mitotických chromatid (z chromatinu obsahujícího H2A/H2B/H3/H4
nukleosomy)
[USEMAP]

Zkouška: - test + přednáška
•Úvod - Analýza proteinu
–Domény
•fold-struktura (ss, PDB)
•v PyMolu připravit 3D strukturu
•Interakce (IntAct)
–Komplexy
•Funkce
•Lokalizace
–evoluce
•Konkrétní nová data – článek (< 5 let)
•
•Ujasnit si souvislosti, rozšířit si znalosti, aplikovat poznatky z přednášek …
[USEMAP]