Ctirad Hofr lablifeb.org LifeB – Laboratoř interakce a funkce esenciálních Biomolekul Funkční genomika a proteomika Národní centrum pro výzkum biomolekul Kvantitativní metody analýzy interakce protein-protein lablifeb .org Přehled kvantitativních metod analýzy protein-protein interakcí Vazebná křivka, rovnovážná disociační konstanta, lineární rozsah detektoru. Teorie = základ praxe 1 2 Stanovení vazebné afinity fluorescenčně značných proteinů - fluorescenční anisotropie, microscale thermophoresis, detekce vazby molekul imobilizovaných na povrchu - surface plasmon resonance; studium vazby nemodifikovaných proteinů přímo v roztoku -izotermální titrační kalorimetrie. Fluorescence počtem vede, ale jde to i bez ní 3 Shrnutí praktických výhod a nevýhod kvantitativních metod analýzy interakce protein-protein. Která je nejlepší - srovnání metod lablifeb .org 1 Vazebná křivka 1 isoterma KD disociační konstanta – koncentrace proteinu, při které je právě polovina molekul v komplexu Pro vazbu dvou proteinů A,B a vznik komplexu A.B při konstantní teplotě A +B ↔ A.B zapíšeme rovnovážnou disociační konstantu 𝐾 𝐷 = 𝐴 𝐵 𝐴 ⋅ 𝐵 % 𝑣𝑎𝑧𝑏𝑦 = 𝐵 𝐵 + 𝐾𝐷 ⋅ 100% Jestliže přidáváme postupně protein B k proteinu A, vazebnou křivku lze vyjádřit rovnicí 0 25 50 75 100 0 20 40 60 80 100%vazby Koncentrace proteinu [B] Závislost míry vazby na celkové koncentraci přidaného proteinu B KD lablifeb .org Vazebná křivka 2 odvození rovnice funkce 0 25 50 75 100 0 20 40 60 80 100 %vazby Koncentrace proteinu B Závislost míry vazby na celkové koncentraci přidaného proteinu B Míru vazby vyjádříme poměrem koncentrace komplexu A.B a celkové koncentrace proteinu A násobený 100%. Vazebná křivka je hyperbola s hodnotou disociační konstanty KD ve jmenovateli. %𝑣𝑎𝑧𝑏𝑦 = 𝐴 ⋅ 𝐵 𝐴 𝑇𝑂𝑇 ⋅ 100% Po dosazení za A.B a ATOT získáme rovnici pro vazebnou křivku 𝐴 ⋅ 𝐵 = 𝐴 𝐵 𝐾 𝐷 𝐴 𝑇𝑂𝑇 = 𝐴 ⋅ 𝐵 + 𝐴 % 𝑣𝑎𝑧𝑏𝑦 = 𝐵 𝐵 + 𝐾𝐷 ⋅ 100% Automatické fitování dat v Excel minimalizací součtu druhých mocnin odchylek měřených dat a fitovaných hodnot za použití doplňku Řešitel (Solver) si můžete vyzkoušet v souboru Videonávod, jak aktivovat doplněk Řešitel (Solver) v programu Excel je v souboru Návod vznikl na základě videa - autor Karl Zuvela https://youtu.be/4jpoCGWmfeM Vyzkoušet, jak se mění tvar vazebné křivky v závislosti na KD si můžete v souboru Vazebná křivka 3 fitování pro chytré hlavy Automat_KD_fit.xlsx KD_vliv_na_tvar_krivky.xlsx Resitel_Solver_ON.mp4 když ručně změníte hodnotu KD na řádku 16. lablifeb .org Vazebná křivka 4 logaritmus koncentrace = sigmoida 0 25 50 75 100 0.1 1 10 100 1000 vazby Logaritmus koncentrace proteinu log 10 [B] Závislost míry vazby na logaritmu celkové koncentrace přidaného proteinu B KD KD disociační konstanta – inflexní bod sigmoidy Sklon sigmoidy – míra kooperativity vazby v případě, že se váže více molekul B na jednu molekulu A. Jestliže přidáme k proteinu A protein B v dostatečně širokém rozsahu koncentrací, vazebnou křivkou závislosti míry vazby na logaritmu koncentrace B je sigmoida. % 𝑣𝑎𝑧𝑏𝑦 = 𝐵 𝐵 + 𝐾𝐷 ⋅ 100% https://en.wikipedia.org/wiki/ Hill_equation_(biochemistry) Jak mění kooperativita vazby tvar sigmoidy? lablifeb .org Poznejte svůj detektor - lineární rozsah detektoru = přesná kvantitativní měření Pro přesné kvantitativní měření je nezbytné, aby byl přírůstek signálu přímo úměrný přírůstku koncentrace komplexů protein-protein. To je splněno pro lineární rozsah detektoru – oblast detekce, kde po zvýšení koncentrace např. dvakrát zvýší hodnota signálu také dvakrát. Celkově má detekční křivka průběh sigmoidy. Oblast pod lineárním rozsahem - jsme blízko minimálnímu detekčnímu limitu = nelineární odezva. Oblast nad lineárním rozsahem – detektor je zahlcen signálem – saturován, velká změna koncentrace způsobí relativně malé a nelineární zvýšení signálu. Vždy si zjistit lineární rozsah detektoru. Při kvantitativních měřeních je nezbytné, aby se měřené hodnoty nacházely v lineárním rozsahu detektoru. Signáldetektoru Koncentrace Lineární rozsah detektoru Saturace detektoru Detekční limit 2 Fluorescenční stanovení vazebné affinity- anizotropie Anisotropie fluorescence - princip „Usměrněnost“ emitovaného světla se zvýší po vytvoření komplexu protein-protein; po excitaci lineárně polarizovaným zářením dochází k emisi fluorescence značené molekuly převážně v jednom směru. Prakticky - značíme menší z proteinů. - stačí naznačit 100 mg proteinu v kyvetě. - přidávaný protein není značený. - celková koncentrace přidávaného proteinu je minimálně 10x větší než koncentrace značeného proteinu Excitace v jednom směru nízká anizotropie vysoká anizotropie „usměrněnost“ čas od excitace po emisi fluorescence t ~ ns Emise fluorescence 0 25 50 75 100 0 20 40 60 80 100 %vazby Koncentrace přidávaného proteinuSložení roztoku v měřící kyvetě lablifeb .org Anisotropie fluorescence měření polarizátor analyzátor detektor Hodnota anizotropie r je podíl rozdílu IVV - IVH intenzity fluorescence při rovnoběžném (vertikálním) a kolmém (horizontálním) natočení analyzátoru vůči excitačnímu polarizátoru a celkové intenzity fluorescence IVV+2IVH ve 3D – všech třech směrech šíření fluorescence. Prakticky - Přístroj - fluorometr s polarizátorem excitačního světla a otočným polarizátorem = analyzátorem vyzářené fluorescence pro zjištění intenzity v různých směrech. - Potřebujeme ~ 10x vyšší koncentraci než na měření klasické fluorescence – polarizátory propouští 10x měně světla. - Hodnota anisotropie r je bezrozměrná veličina (podíl čísel). 𝑟 = 𝐼 𝛪𝛪−𝐼⊥ 𝐼 𝛪𝛪+2𝐼⊥ = 𝐼 𝑉𝑉−𝐼 𝑉𝐻 𝐼 𝑉𝑉+2𝐼 𝑉𝐻 lablifeb .org Microscale thermophoresis MST Princip MST - Vytvoříme lokální teplotní gradient – ozáříme vzorek v kapiláře infračerveným laserem. - Vzorek zároveň osvětlujeme excitačním světlem pro fluorofor, kterým je značený menší protein. - Detekujeme pohyb fluorescenčně značených molekul jako změnu fluorescence v mikrooblasti osvětlené IR laserem. - Při konstantní koncentraci fluorescenčně značeného proteinu zvyšujeme koncentraci přidávaného neznačeného proteinu = ligandu. - Sledujeme snížení míry poklesu fluorescence v čase se vzrůstající koncentrací ligandu. Čas ozařování vzorku ~ 20 s https://en.wikipedia.org/wiki/Microscale_thermophoresis Úbytekfluorescence vše navázáno polovina navázána samotný značený protein bound unbound lablifeb .org Obrázek laskavě poskytl Dr. Josef Houser, CORE FACILITY Biomolecular Interactions and Crystallization http://bic.ceitec.cz/cs Prakticky MST měření protein-protein interakce - Fluorescenčně naznačíme menší protein. - Vytvoříme ředící řadu druhého proteinu = ligandu jeho postupným ředěním 2x. - Smícháme roztoky tak, že koncentrace značeného proteinu je stejná, ale koncentrace ligandu se mění v rozsahu 5 řádů. - Vzorky nasajeme do kapilár (5uL) . - Měříme změnu fluorescence po zapnutí IR laseru. - Vyneseme změnu fluorescence v závislosti na logaritmu koncentrace ligandu. - Z inflexního bodu sigmoidy určíme disociační konstantu vzniku komplexu protein-ligand. Interakce protein-protein na povrchu Surface plasmon resonance - SPR Evanescentní vlna plazmonů - rezonujících elektronů na povrchu = surface resonance plasmons, které absorbují část světla 50 nm Rezonanční úhel, kdy vznikají plazmony 𝜃 Zdroj světla - laser Detektor Au Princip Na přechodu mezi sklem a zlatou vrstvou ideálně o o tloušťce 50 nm dochází k odrazu světla - laseru. Při rezonančním úhlu 𝜃 dochází ke zvýšené absorpci, která je zaznamenána detektorem. Vzniká evanescentní (mizející) vlna rezonančních elektronů = plazmonů, která se vzdáleností od povrchu postupně slábne. Dosah evanescentní vlny je přibližně 100 nm do prostoru roztoku. Plazmony jsou velmi citlivé na změny prostředí, ve kterém se pohybují. SPR tak umožňuje detekovat změny díky vazbě proteinů na povrchu zlaté vrstvy. Zlato je pokryto dextranem , na který se imobilizuje jeden interakční protein. Druhý protein je přidáván do pufru, kterým je promýván povrch s imobilizovaným proteinem. Po vzniku komplexu protein-protein na povrchu dochází ke změně rezonančního úhlu 𝜃, kterou detekujeme. Sledujeme kinetiku vzniku komplexů v reálném čase. Skleněný hranol průtok lablifeb .org SPR prakticky - Imobilizujeme protein na SPR čip. - Nasytíme vazebná místa na povrchu bez imobilizovaného proteinu. - Promyjeme čip pufrem. - Promýváme čip druhým proteinem. - Detekujeme změnu signálu. - Počáteční část křivky ukazuje kinetiku asociace obou proteinů. - Závěrečná část křivky popisuje kinetiku disociace obou proteinů. - Fitovaním vazebných modelů určíme hodnoty kinetické asociační a disociační konstanty a rovnovážnou disociační konstantu. Asociace Saturace Disociace průtok průtok Čas (s)RU–resonanceunits promytí Saturace KD 𝐾 𝐷 = 𝑘 𝑑 𝑘a ITC – Izotermální titrační kalorimetrie popis interakce měřením reakčního tepla R DT http://www.youtube.com/watch?v=cYj5IOELaVI https://www.youtube.com/watch?v=o_IpWcWKNXI - Princip - Měříme reakční teplo, které se uvolní nebo spotřebuje po přidání proteinu injektorem do roztoku proteinu v měřící cele. Injektor má tvar lodního šroubu, který míchá směs v měřící cele. - Teplota cely se vzorkem je srovnávána s teplotou referenční cely, která obsahuje pouze pufr. - Když dojde ke změně teploty mezi celami, dojde k zahřátí nebo ochlazení cely se vzorkem. Teplo, které je vyměněno pro vyrovnání teplot je zapsáno po každém přídavku proteinu z injektoru. Výsledkem je titrační křivka. - Ze známých molárních koncentrací a změny tepla určíme molární vazebnou entalpii - teplo vazby proteinů. lablifeb .org ITC prakticky Vazebná entalpie DH Vazebná konstanta Ka Volná energie DG vypočtena z DG = -RTlnKa Změna entropie DS vypočtena z DG = DH -TDS Stechiometrie N -2 -1 0 -10 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 Time (min) µcal/s 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 -120 -100 -80 -60 -40 -20 0 DH = -108 kcal mol -1 DS = -317 cal K -1 mol -1 K = 1.63 10 7 N = 0.25 (DNA : protein) Molar ratio [DNA:protein]kcal/molDNA N DH Ka - Určíme co nejpřesněji koncentrace proteinů. - Změříme „blank“ titraci - pufr v injektoru, protein v cele při 25°C. - Dáme do injektoru druhý protein s desetkrát vyšší koncentraci, než je první protein v cele. - Změříme titrační křiku. - Odečteme „blank“ titraci od titrační křivky. - Normalizujeme na kon centrace proteinů v cele a injektoru. - Proložíme výslednou sigmoidu vhodným modelem vazby. - Výška křivky udává vazebnou entalpii, sklon odpovídá rovnovážné asociační konstantě a inflexní bod odpovídá molárnímu poměru vazby proteinů. - Z jednoho měření lze získat kompletní termodynamický popis vazby DH, DS, DG, KA a stechiometrii vazby N. lablifeb .org Srovnání kvantitativních metod 3 3 2 1 10 5 3 4 6 10 8 7 6 8 9 7 7 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 AF MST SPR ITC Spotřeba vzorku Délka přípravy vzorku a měření Přesnost určení KD Uživatelská přívětivost Modifikace proteinu Ano - značení fluoroforem Ano – imobilizace na povrchu Ne – bez značení a modifikace Ano - značení fluoroforem lablifeb .org Kde se můžete dozvědět více? C7230 Fluorescenční metody ve vědách o životě - cesta od molekuly k buňce C7235 cvičení Teoretická vysvětlení principů fluorescence a praktická výuka aplikace fluorescenčních přístupů Podzim 2020 FE010 Experimental Methods in Biophysics - life science laboratory approaches and excursions Přednášky odborníků a exkurze do výzkumných laboratoří mezinárodně uznávaných společností Podzim 2020