Bezpečnost práce Kultivační půdy ÚVOD Jaro 2021 Bezpečnost práce  Příchod a odchod z laboratoře  MYTÍ RUKOU, DEZINFEKCE PLOCHY  Kahany pouze pokud jsou používány a jste v místnosti  Nesahat na kultury do misky  Na stole 3 nádobky – dezinfekce, kelímek na použité špičky, kelímek na použité sirky  Lékárnička, hasicí přístroj, hasicí deka  Laboratorní sklo a pomůcky (misky, kličky, sklo x umělá hmota)  KONTAMINACE (sebe i kultur) - snažit se jí předcházet!!! Pokud by se něco rozbilo či rozlilo (miska/bujon s kulturou), NEJPRVE MÍSTO DEZINFIKUJEME!! Zásady bezpečné práce v mikrobiologické laboratoři  1. Vstup do laboratoře je povolen pouze osobám vykonávajícím cvičení.  2. V laboratoři vykonávejte pouze práci stanovenou obsahem cvičení.  3. V laboratoři je zakázáno jíst, pít a kouřit.  4. V laboratoři je nutné používat laboratorní plášť a přezůvky.  5. V laboratoři je zakázáno otevírat okna. Větrání je zajištěno pomocí větracího zařízení.  6. Před příchodem do laboratorního cvičení se seznamte s jeho obsahem.  7. Před započetím a po ukončení práce je třeba desinfikovat pracovní plochu (Incidur). Zásady bezpečné práce v mikrobiologické laboratoři  8. Na pracovní plochu pokládejte co nejméně osobních věcí. Na pracovní ploše může snadno dojít k jejich kontaminaci. Oblečení, batohy a tašky odkládejte v šatně.  9. Pracujte pečlivě a opatrně. Zabráníte tím kontaminaci materiálu a náhodnému potřísnění pracovní plochy a sebe bakteriálními kulturami.  10. Nedotýkejte se zbytečně rukama obličeje, nenanášejte v laboratoři kosmetiku, nemanipulujte s kontaktními čočkami.  11. Při barvení mikroorganismů používejte jednorázové ochranné rukavice a pracujte v digestoři. Při fixaci preparátů používejte ochranné brýle. Ochranné rukavice není nutné používat při manipulaci s mikroorganismy, pokud se však budete cítit bezpečněji, použijte je. Výjimkou je příprava nativního preparátu pro mikroskopii, v tomto případě určitě použijte rukavice. Zásady bezpečné práce v mikrobiologické laboratoři  12. Kahany nechávejte hořet pouze po dobu, kdy je užíváte.  13. Použité sklo a zbytky bakteriálních kultur odkládejte na určená místa. V žádném případě nevylévejte kultury do odpadu! Veškerý kontaminovaný materiál je před likvidací a mytím nutno desinfikovat nebo sterilizovat (týká se i rozbitého skla), případně vyhodit do koše na nebezpečný odpad (např. buničitá vata použitá k likvidaci rozlité kultury).  14. Dojde-li k náhodnému potřísnění pokožky bakteriální kulturou či poranění pokožky, oznamte tuto skutečnost ihned školiteli. Pokožku je nutno ošetřit vhodným desinfekčním prostředkem (ajatin, Spitaderm), aby nedošlo k infekci. Zásady bezpečné práce v mikrobiologické laboratoři  15. Stejné zásady jako v bodě 14 platí i v případě znečištění pracovní plochy nebo pracovního oděvu.  16. V případě jakékoli nejistoty se informujte o správném postupu u svého školitele.  17. Označte všechna média a kultury ve zkumavkách, baňkách a Petriho miskách názvem média a kultury, svým jménem a pracovní skupinou. Misky popisujte na dno! K označení používejte fixy na sklo.  18. Všechny pracovní postupy, obzvláště pak použité bakteriální kultury, množství pipetovaných roztoků a postupy při ředění si pečlivě zaznamenávejte.  19. Po ukončení práce odneste použité pomůcky na určené místo, ukliďte pracovní plochu a vydesinfikujte ji desinfekčním roztokem (Incidur ve spreji). Zásady bezpečné práce v mikrobiologické laboratoři  20. Před odchodem ze cvičení si dobře umyjte ruce a vydesinfikujte desinfekčním prostředkem (Spitaderm). V případě, že potřebujete krátkou přestávku v průběhu cvičení, umyjte a vydesinfikujte si ruce před opuštěním laboratoře.  21. Práce v mikrobiologické laboratoři je zakázána těhotným ženám do konce 9. měsíce. Posluchačka je povinna vedoucímu cvičení oznámit graviditu.  22. Připojování přístrojů do elektrické sítě je nutno provádět pod dohledem. Provádění jakýchkoliv změn na elektrickém zařízení není dovoleno. Opravovat elektrické instalace smějí jen osoby tím zvláště pověřené, s příslušnou kvalifikací. Závady v instalaci (voda, plyn, elektřina) ihned hlaste. Pokyny k zápočtu  Protokoly  pozn.: závěr = stručné shrnutí, úvaha nad výsledky pokusu, případně odpovědi na otázky  Docházka  povinná účast v praktické části semestru  Zápočet  docházka, protokoly, zápočtový test S sebou do laboratoře PLÁŠŤ, PŘEZŮVKY, PERMANENTNÍ FIX NA SKLO Sylabus Cvičení - Základy mikrobiologie cvičení Bi2060c - JARO 2021 Cvičení Týden Úloha 1 1.3. - 5.3. Metody sterilní práce, očkování a uchovávání mikroorganismů. Technika křížového roztěru. Očkování do tekutého media a na pevné medium. 2 8.3. - 12.3. 3 15.3. - 19.3. Makro - a mikroskopické pozorování mikroorganismů. Gramovo barvení, demonstrační pokus nativního preparátu. 4 22.3. - 26.3. 5 29.3. - 2.4. Přímé stanovení počtu buněk v Bürkerově komůrce, vitální test, kvasinky. 6 5.4. - 9.4. 7 12.4. - 16.4. Průkaz a izolace některých půdních mikroorganismů. 8 19.4. - 23.4. 9 26.4. - 30.4. Stanovení citlivosti bakterií k antibiotikům, stanovení koncentrace antibiotik. 10 3.5. - 7.5. 11 10.5. - 14.5. Termín vypsán zvlášť TEST Půdy pro růst mikroorganismů  Agar x Bujon  Agar – tuhý, izolace jednotlivých kolonií, přímý průkaz MO, pozorování makroskopických znaků  Bujon – tekutý, pomnožení, nerozeznáme směs MO  Kultivovatelné mikroorganismy tvoří asi 1,5 – 5 %  Půdy si připravíme dle cílového MO → směs z prostředí, sbírková kultura (katalog), klinika…  Viry – kultivace na tkáňových kulturách, fágy na nárůstu bakterií  Intracelulární paraziti – buněčné kultury Média  Živná média slouží ke kultivaci, přímému průkazu a izolaci MO, sledování fyziologických vlastností (vztah k O2, rychlost růstu,…)  Jejich složení odpovídá požadavkům MO (pH, zdroj C, N)  Sterilná příprava  Dle účelu: univerzální x selektivní x selektivně diagnostická  Dle složení: syntetická x přirozená x základní x obohacená  Dle konzistence: tekutá x polotekutá x tuhá x ztužená  Transportní Média  Půdy univerzální neboli základní - slouží pouze k pomnožení mikrobů. MPB, sladinový agar  Půdy diagnostické - obsahují indikátory, které obvykle mění barvu v závislosti na změně podmínek okolí (nejčastěji pH) v důsledku pochodů vyvolaných mikroby. Podle odlišných vlastností poté můžeme odlišovat jednotlivé mikroby. Např. na krevním agaru kolem kolonií některých druhů vzniká zóna hemolýzy; v tekuté půdě s určitým sacharidem a barevným indikátorem pH lze odhalit schopnost kmene fermentovat tento sacharid.  Půdy selektivní - potlačují růst nežádoucích mikrobů. Ashbyho agar  Půdy selektivně diagnostické - sdružují v sobě vlastnosti obou předchozích skupin. Příklad: MacConkey agar umožňuje růst nenáročných G- tyček a současně identifikuje jejich schopnost fermentovat laktózu. Endo agar  Půdy speciální - slouží pro kultivaci konkrétního druhu nebo rodu bakterie. Příklad: půda BCYE pro legionely. MPA, krevní agar, čokoládový agar Masopeptonový agar Krevní – 5-10% savčí krve Čokoládový – zlyzované krevní buňky Živný (masopeptonový) agar (ŽA, MPA) - Základní směs - bujónem a peptonem s agarem. Pěstují se na něm nenáročné bakterie. Obvykle se používá spíše jako základ pro přípravu složitějších půd. Krevní agar (KA) Je nejpoužívanějším pevnou půdou, vyrábí se přidáním beraních krvinek k chladnoucím agaru (56°C). Slouží pro zachycení Gram + bakterií. Je částečně diagnostickou půdou - mohou se na něm projevit hemolytické vlastnosti bakterie. Čokoládový agar (ČA) Vyrábí se podobně jako KA přidáním beraních krvinek k agaru (ten má však vyšší teplotu 80°C) - a tak dojde k hemolýze. Ta způsobí čokoládové zbarvení. Používá se pro pěstování náročnějších baktérií jako jsou Neisserie a Hemofily. Hemolýza je porušení cytoplazmatické membrány červených krvinek stafylokoky Hemolýza streptokoky Endův agar E. coli Endova půda je světle růžová a na světle dále růžoví, nerostou na ní G+ bakterie ► dělí bakterie na laktóza-pozitivní, které metabolizují laktózu – tvoří se aldehydy, které reagují s fuchsinem obsaženým v Endově půdě za vzniku Schiffových bazí a kolonie se zbarvují tmavorůžově laktóza-negativní bakterie mají svou standardní barvu ► Pro koliformní bakterie Shifovo reagens(vyvážená směs bazického fuchsinu s kyselým siřičitanem sodným) - selektivní složka a indikátor štěpení laktózy MacConkey agar L+ LInhibiční složkou v médiu je speciální směs žlučových solí. Okyselení, které vzniká rozkladem laktózy, indikuje neutrální červeň. Inhibiční rozsah má téměř shodný s Endovým agarem. Obě média umožňují růst gramnegativním nenáročným bakteriím z čeledi Enterobacteriaceae, Vibrionaceae, Aeromonadaceae a některým dalším rodům (Pseudomonas, Alcaligenes). Deoxycholát – citrátový agar  Inhibiční složku v médiu tvoří žlučové soli, avšak ve vyšší koncentraci než v MCA.  Obsahuje citronan železitý, který indikuje tvorbu sirovodíku.  Indikátorem okyselení je neutrální červeň.  DCA je zvláště vhodný pro izolaci salmonel a yersinií. Podobný je Salmonella-Shigella agar Agar s briliantovou zelení  Inhibiční složkou je briliantová zeleň, indikátorem pH fenolová červeň.  Používá se hlavně pro selektivní izolaci salmonel.  Dnes je průmyslově vyráběna řada tzv. chromogenních půd, na kterých lze rozlišit podle typického zabarvení kolonií vybrané rody z čeledi Enterobacteriaceae. Jako přiklad lze uvést Rambachův agar, který je určeny pro izolaci salmonel. Chromogenní půdy - Candida a – Candida albicans b – Candida dubliniensis c – Candida tropicalis d – Candida glabrata e – Candida krusei Chromogenní půdy dokáží odlišit jednotlivé mikroby na základě specifické barvy jejich kolonií Mueller Hinton agar  Používá se pro test citlivosti na antibiotika, sulfoamidy (disková, difuzní Kirby-Bauer metoda) a pro primární izolaci neisserií.  Neisseria je rod bakterií charakterizovaný jako gramnegativní aerobní diplokoky. Organismy jsou parazitické, ve volné přírodě se nevyskytují. Některé druhy jsou primárně patogenní pro člověka a nacházíme je na sliznicích respiračního a genitálního traktu. Nepatogenní druhy osídlují ústní dutinu a horní dýchací cesty. Polotuhý agar, Proteus  Polotuhé médium vhodné pro Proteus mirabilis  Proteus má typický plazivý růst = Raussův fenomén = fenomén příbojové vlny Proteus mirabilis je gramnegativní fakultativně anaerobní bakterie, pro níž je charakteristický plazivý růst a ureázová aktivita. Proteus mirabilis způsobuje 90 % infekcí rodu Proteus, které lze považovat za komunitní získané infekce. Proteus mirabilis je součástí normální gastrointestinální flóry. Vyskytuje se také v půdě, ve vodě, na rostlinách, ve stolici lidí a zvířat. Proteus je nalezený v mnoha ekologických stanovištích, včetně dlouhodobých zdravotnických zařízení a nemocnic. Kombinovaná půda dle Hajny  Indikuje zkvašovaní cukrů a produkce CO2 a sirovodíku  Substrátem pro tvorbu H2S je tiosulfát sodný a indikátorem citrát železito-amonný. Sirovodík vytvořený redukcí tiosulfátu reaguje s ionty železa za vzniku sulfidu železitého.  Produkce H2S se projeví zčernáním spodní části půdy.