PROVOZ A BEZPEČNOST PRACE PRI PRAKTICKÝCH CVIČENÍCH Z MOLEKULÁRNÍ BIOLOGIE V laboratoři se: 1. pracuje v ochranném oděvu, tj. v plášti + prezuvky 2. Na pracovních stolech jsou pouze pomůcky určené k provádění zadaných úkolů + návody + kalkulačka 3. Během cvičení je zákaz kouření, konzumace potravin a pití nápojů 4. Je třeba dbát pokynů vyučujících, aby nedošlo k poškození zařízení, pomůcek a znehodnocení chemikálií 5. Při práci s chemikáliemi typu žíravin, hořlavin a mutagenů používat rukavice, při práci s UV zářením používat ochranné brýle, při práci s horkým roztokem v kádince používat ochranné rukavice 6. Udržovat čistotu na pracovních stolech a v prostorách laboratoře, důsledně třídit použitý materiál 7. JAKÝKOLI ÚRAZ IHNED NAHLÁSIT VYUČUJÍCÍMU ZÁSADY PRO PRÁCI V MOLEKULÁRNĚ BIOLOGICKÉ LABORATOŘI 1. Je třeba pracovat s ohledem na vlastní bezpečnost a na prevenci kontaminace pracovních pomůcek. 2. Při práci s nastavitelnými automatickými pipetami je třeba dbát toho, aby byly nastaveny v rozmezí povolených hodnot objemů (nepřetáčet nad ani pod limitní rozsah objemu). Ke každé pipetě použít vhodnou plastovou špičku. 3. U zmražených vzorků zásobních roztoků se musí nejprve rozpustit celý objem a pak teprve provést náběr sterilní špičkou. 4. Při každém náběru enzymů (roztoků) ze zásobního roztoku je třeba používat vždy nové sterilní špičky! Špičky po použití vyhazujeme do určených odpadních nádobek. 5. Zásobní roztoky enzymů se uchovávají při -20 °C a při použití je třeba je mít uložené na ledu. Po náběru lehce otřít špičku o vnitřní stěnu zkumavky (takto se zbaví přebytečného enzymu zachyceného vně špičky). Zkumavky s enzymy a zásobními roztoky po odebrání ihned uzavřít. Přehled úloh řešených v praktiku Izolace plazmidové DNA Stanovení koncentrace DNA spektrofotometricky Reštrikční štěpení plazmidové DNA Elektroforéza + reštrikční mapování genomové DNA Transformace E. coli plazmidovou DNA Příprava sacharózového gradientu a PCR Izolace genomové DNA Zápočtový test a zápočet Kritéria pro zápočet Absolvování všech úloh Úspěch u malých testů během jednotlivých cvičení Odevzdané správné protokoly -jméno, datum, název úlohy, stručně princip, „postup", výsledek, závěr Zápočtový test Příklady Příprava roztoků Ředění roztoků Procenta versus molarita Počítání nejen roztoků Jak připravíte 50 ml 2M roztoku NaCI (MW-58)? Jak z tohoto 2M roztoku připravíte 100ml 0,5M? Kolika procentní (w/v) je 2M roztok NaCI? Určete jaké množství zásobního roztoku ampicilinu o koncentraci 100 mg/ml, se musí přidat do 100 ml LB bujónu, aby byla jeho výsledná koncentrace 100 |jg /ml. V mikrozkumavce máte krev s 8 miliony leukocyty/1ml. Kolik ul krve použijete pro reakci, ve které musíte pracovat s 1 milionem leukocytu? Plazmidy Extrachromozomální molekuly dsDNA Replikace nezávisle na bakteriálním chromozomu Pro replikaci potřebují enzymy a proteiny hostitelské buňky Udržují se v bakteriích v určitém počtu (1 až mnoho) Při buněčném dělení přechází nezávisle do dceřiných buněk Nesou geny poskytující bakteriím nějakou selekční výhodu (rezistence) ori- počátek replikace inc- připojení na membránu Využití - přenos dědičné informace - ovlivnění genové exprese - konstrukce mutantů _w =00 —__> (4-\ FSV ^ = -g^ČE><^>