Elektroforetické metody Bi5220c Imunologie - cvičení 2021 Elektroforetické metody - princip —Rozdělení proteinů na základě jejich pohyblivosti v elektrickém poli (náboj, velikost) —Gely: ◦Agar - nehomogenní směs polysacharidů z mořských řas ◦Agaróza – homogenní; polymer složený z disacharidových jednotek (agarobiózy); používá se v koncentraci 0,5 – 2% (křehký) ◦Polyakrylamid – homogenní, hydrofilní, má výborné mechanické vlastnosti, nízkou elektroosmózu a nízkou absorpci; základní monomer karcinogenní; požívá se v různých koncentracích (2 – 20 %) — Imunoelektroforéza —Elektroforetická separace následovaná imunoprecipitací rozdělených proteinů specifickými protilátkami, většinou v prostředí agarózy (imunologická reakce antigen – protilátka) — —V současnosti se nejvíce používá při stanovení paraproteinu (čili neúplných řetězců imunoglobulinů) při monoklonálních gamapatiích — —Výhody a nevýhody: metoda imunoelektroforézy je nenáročná na čas i vybavení, není drahá. Pouze proces odečítání a interpretace výsledků jsou do značné míry závislé na zkušenostech pracovníka. Imunofixace —Modifikací imunoelektroforézy —Po elektroforéze se na agarózový gel položí maska s výřezy, otvory se naplní příslušnými protilátkami anti IgG, anti IgA, anti IgM, anti kappa, anti lambda —Vzniklé precipitační linie se pak porovnávají se standardním sérem a lze tak posuzovat odchylky ve smyslu poklesu nebo nárůstu jednotlivých tříd protilátek, resp. lehkých řetězců — —Využití elektroforetických metod: —orientační vyšetření bílkovin krevní plasmy (albumin, α1 α2 β a γ globulin) —rozdělení antigenů pro imunoblotting —obecně dělení bílkovin v experimentálních studiích X. Úloha – Raketová elektroimunodifuze podle Laurella Princip —Zkoumaný antigen je stejnosměrným elektrickým proudem unášen po gelu s protilátkou — —Vazbou antigenu a protilátky vznikají imunokomplexy, které se projeví jako precipitát v podobě tzv. raket — —Putování antigenu a tvorba imunokomplexů až do vzdálenosti, ve které je veškerý antigen ze vzorku vyvázán protilátkou v gelu — —Výška raketky je úměrná koncentraci antigenu Chemikálie a roztoky —Komerční lidské sérum obsahující IgG (IgG 23 g/l) —Protilátka - sérum s anti-IgG protilátkami —Fyziologický roztok —Agaróza —Borát-fosfátový pufr (pH 6,8) —Roztok Coomassie —Barvící roztok —(225 ml CH3OH + 25 ml CH3COOH + 0,25 g amidočerni 10B) —Odbarvovací diferenciační roztok — (CH3OH : CH3COOH - 10:1) —Vzorek - komerční lidské sérum obsahující neznámé množství IgG (Orion Diagnostica) Přístroje a pomůcky —Skleněné plotny 5x5 cm —Korkovrt —Vývěva —Zdroj napětí —Elektroforetické komory —Vlhkou komůrku —Filtrační papír Postup 1.Vyvážíme podložku na nalévání do vodorovné polohy 2.Skleněnou plotnu (5x5 cm) očistíme alkoholem a necháme oschnout 3.Na plotnu naneseme 2,4 ml 1% roztoku agarózy v borát–fosfátovém pufru s anti-IgG sérem 4.Gel necháme několik minut zatuhnout na kalibrované vodorovné ploše 5.Z misky a vlhkého filtračního papíru připravíme vlhkou komůrku, do které umístíme skleněnou plotnu s agarózou, aby tato nevyschla 6. Postup 6.Ze zásobního komerčního séra o známé koncentraci IgG si připravíme další ředění podle tabulky Postup 7.Podle šablony vysekáme do gelu s protilátkou řadu pěti jamek 8.Do jamek naneseme: •do prvních čtyř jamek 5 μl ze zkumavek 1-4 •do páté jamky 5 μl séra o neznámé koncentraci 9.Do elektroforetických komor nalijeme borát-fosfátový pufr, na hranici mezi katodou a anodou položíme připravená sklíčka a ze dvou protilehlých stran (od katody a anody) přiložíme na kraj gelu filtrační papír nasátý borát-fosfátovým pufrem za účelem vedení elektrického proudu 10.Každou komoru obsahující tři sklíčka zakryjeme a zapojíme elektrický obvod tak, aby do každé elektroforetické komory vedl proud o velikosti 60 mA (20 mA na sklíčko) 11.Elektroforéza bude probíhat cca 1 hodinu, přičemž její průběh budeme sledovat na séru označeném roztokem Coomassie blue Postup 12.Po skončení elektroforézy pereme skla nejvýše 2 minuty ve fyziologickém roztoku, zabalíme je do chromatografického papíru navlhčeného fyziologickým roztokem a přes noc sušíme při pokojové teplotě 13.V dalším cvičení sejmeme ze sklíček papír, skla opereme pod tekoucí vodou a barvíme barvícím roztokem do dostatečného obarvení linií 14.Pozadí odbarvíme diferenciačním roztokem 15.Nakonec opereme v destilované vodě a usušíme bez papíru Hodnocení a výstup Hodnocení a výstup —Kalibrační graf závislosti výšky precipitačních útvarů na koncentraci kontrolního séra s rovnicí regrese a hodnotou spolehlivosti — —Tabulka s hodnotami výšky jednotlivých precipitačních útvarů, hodnotami koncentrací kontrolního séra a výpočtem koncentrace IgG ve vzorku lidského séra —