Metody separace buněk Bi5220c Imunologie - cvičení 2021 Gradientová separace —Založena na rozdílné hustotě separovaných buněk ◦erytrocyty, granulocyty > lymfocyty, monocyty ◦ —Spočívá v navrstvení nesrážlivé krve na separační gradient (např. dextran, Ficoll, Histopaque) Separace buněk gradientovou centrifugací s využitím Histopaque Gradientová separace —1 ml periferní krve → 1–2x 106 agranulocytů — —Výhody ◦Cena ◦Jednoduchost ◦Buňky po centrifugaci zůstávají plně funkční — —Nevýhody ◦Čistota / výtěžek ◦V některých případech prekurzory erytrocytů v horní vrstvě s agranulocyty Izolace lymfocytů pomocí rozet —Využívá povrchových receptorů lymfocytů — —T-lymfocyty ◦CD2 reaguje s povrchovými antigeny ovčích erytrocytů za tvorby rozet — —B-lymfocyty ◦Reaguje s antigeny myších erytrocytů — —Hodnocení ◦Počítání rozet pomocí světelného mikroskopu Izolace lymfocytů pomocí rozet —Před objevem monoklonálních protilátek a průtokové cytometrie —Dnes ve spojení s gradientovou centrifugací — —Výhody ◦Cena ◦Jednoduchost — —Nevýhody ◦Aktivace buněk Imunomagnetická separace —Využívá povrchových markerů buněk —Selekční protilátky navázané na magnetické částice —Suspenze buněk prochází separační kolonou, která je umístěna v magnetickém poli —Magnetické kuličky s navázanými buňkami zůstávají v magnetickém poli, zatímco zbytek buněk projde kolonou — Imunomagnetická separace Pozitivní separace Negativní separace Imunomagnetická separace —Výhody ◦Jednoduchost ◦Rychlost ◦ —Nevýhody ◦Cena (především negativní separace) ◦Aktivace buněk v případě pozitivní separace Selekce pomocí průtokové cytometrie —tzv. třídění neboli sortrování buněk — —Sledované buňky se označí fluorescenční protilátkou —Při průchodu přístrojem jsou pak tyto buňky detekovány na základě svých optických vlastností —Elektrickým výbojem jsou vychýleny ze své dráhy a nasměrovány do sběrné zkumavky —Ostatní neoznačené buňky cytometrem projdou nevychýleny a jsou zachyceny odděleně od požadované buněčné populace Selekce pomocí průtokové cytometrie —Výhody ◦Vysoký stupeň čistoty (až 99 %) ◦ —Nevýhody ◦Cena - vysoká náročnost na přístrojové a materiálové vybavení — IV. Úloha – Izolace agranulocytů z myší krve Izolace agranulocytů —Mezistupeň před následným stanovením imunitních vlastností lymfocytů ◦proliferace buněk ◦aktivita buněčných enzymů —Zdroj DNA pro genetické analýzy —V nádorové terapii se používá izolovaných lymfocytů k určení proliferační aktivity lymfocytů po vystavení nádorovým buňkám či extraktům a pro stanovení cytotoxické aktivity výkonných buněk proti nádorům Princip —Separace buněk gradientovou centrifugací s využitím Histopaque Postup 1.Připravíme si polystyrenovou zkumavku s 300 μl vytemperovaného roztoku Histopaque. 2.Na Histopaque opatrně pipetou navrstvíme 300 μl heparinizované myší krve. 3.Centrifugujeme 15 – 30 minut při 500 g. 4.Během centrifugace si spočítáme pomocí Bürkerovy komůrky počet leukocytů v myší krvi před separací. Pro počítání buněk použijeme směs krve s Türkovým roztokem (ředění 1 : 20; 10 μl krve + 190 μl Türkova roztoku). Postup 5.Po centrifugaci pipetou opatrně sesbíráme světlou střední vrstvu obsahující mononukleární buňky (cca 1 – 2 mm). Můžeme sesbírat i celou vrchní vrstvu (plasma + trombocyty + mononukleární buňky). Pomocí automatických pipet změříme co nejpřesněji objem získané suspenze! 6.V odebrané suspenzi spočítáme pomocí Bürkerovy komůrky počet buněk – agranulocytů získaných po separaci. Buňky počítáme v 50 velkých čtvercích mřížky. 7.Ze zjištěného počtu agranulocytů, známého objemu 50 čtverců a celkového objemu odebrané suspenze určíme, kolik buněk jsme při izolaci fakticky získali. Pokud byla suspenze před počítáním ředěna, je nutno při výpočtu počtu získaných buněk toto ředění také zohlednit! Hodnocení a výstup —Uveďte počet leukocytů v původní krvi před separací. Z těchto hodnot vypočtěte, kolik agranulocytů vstupovalo do separace v původních 300 μl krve. Vycházejte z koncentrace buněk zjištěné v kroku 4 postupu, objemu krve použité pro separaci a toho, že podle fyziologických hodnot tvoří lymfocyty a monocyty 80 % všech leukocytů myši. —Uveďte počet agranulocytů po separaci v 50 čtvercích a celkový počet získaných buněk. Vycházejte z koncentrace buněk zjištěné v kroku 6 postupu a objemu získané suspenze. —Z vypočítaných hodnot určujících počet agranulocytů před a po separaci, určete výtěžnost vlastní separace v %.