Fagocytóza a metody jejího sledování Bi5220c Imunologie - cvičení 2021 Fagocytóza —Profesionální fagocyty ◦Přímá likvidace škodlivin ◦Zpracování a prezentace antigenu Stanovení chemotaxe —Pro průběh chemotaxe je nutný: —1) podnět (chemokiny, leukotrieny apod.) —2) receptory pro výše uvedené signální molekuly (podněty) —3) cytoskelet umožňující lokomoci buněk — —Boydenova komůrka — průchodu fagocytů přes nitrocelulózovou membránu — —Rebuckovo kožní okénko — migrace leukocytů do místa zánětu (poškození tkáně) Stanovení míry ingesce —MSHP test —Mikrosférické hydrofilní partikule —Hodnocení: krevní nátěr — —Výhody: Jednoduchost, přístrojová a časová nenáročnost, nízká cena —Nevýhody: Nutná zkušenost s vyhodnocováním, krev musí být čerstvá, měřit lze pouze snížení hodnot — —Ke snížení fagocytózy dochází pouze za velmi vážných stavů, jako jsou například konečná stádia nádorových onemocnění nebo těžké imunodeficence Celkový průběh fagocytózy —Baktericidní test — —Stejný princip jako u MSHP, ale využívá živých bakterií — —Hodnocení: výsev bakterií na živnou půdu, počítání bakteriálních kolonií — —Výhody: Vyhodnocení celkového průběhu fagocytózy pomocí přirozených patogenů —Nevýhody: Metoda je náročná na práci a těžko standardizovatelná Detekce oxidativního vzplanutí —NBT test —substrát nitroblue-tetrazolium chlorid > formazán (modrý) —schopnost fagocytů tvořit kyslíkové radikály aktivací NADPH oxidázy — —Hodnocení: mikroskopicky, spektrofotometricky — —Výhody: Metoda je levná, nenáročná V. Úloha – Stanovení fagocytárních schopností leukocytů in vitro metodou chemiluminiscence Princip —Fagocyty > oxidativní vyplanutí > ROS > baktericidní účinek — —Luminiscence — —luminofor + energie → přirozeně nestabilní excitovaný luminofor → luminofor + světlo (425 nm) — —Měření pomocí luminometru —Výsledkem je hodnota vzniklého světelného kvanta, která je přímo úměrná míře fagocytózy Chemikálie a roztoky —Hanksův roztok (HBSS, Hanks Ballanced Salt Sollution) pH 7,4 —zásobní roztok zymosanových partikulí (ZP; 2,5 mg/ml). —0,01 M luminol —Tűrkův roztok —Měřený vzorek – lidská krev Přístroje a pomůcky —Bürkerova komůrka —luminometr —šablona s jednorázovými stripy Postup 1.Pipetujeme na desku v pořadí dle následujícího schématu: 2. 2. 2. 2. 2. 2. 2. 2. 2. 2.Ihned po napipetování všech jamek měříme destičku na luminometru v režimu: ◦interval mezi jednotlivými měřeními: 60 s ◦počet měřících cyklů: 130 ◦teplota: 37 °C ◦bez třepání Postup —Pomocí Bürkerovy komůrky koncentraci leukocytů ve zkoumaném vzorku lidské krve v ředění 1 : 20 — (10 μl krve + 190 μl Türkova roztoku) Hodnocení —Ze získaných výsledků vytvořte zjednodušenou tabulku ◦Průměrné hodnoty duplikátů ◦Přepočet na 1000 fagocytujících leukocytů (CPS/103 leu) ◦Pozor – v každé jamce 2 ul krve — —Ze získaných hodnot vytvořte graf kinetiky ◦průběh CL v čase pomocí křivky Výstup Výstup —Graf kinetiky — —Tabulka ◦Maximum CL ◦Čas dosažení maxima ◦Intergrál (přepočtený na 1000 leukocytů) ◦