Metody stanovení antioxidantů Bi5220c Imunologie - cvičení 2021 Antioxidanty —Enzymatické: —superoxid dismutáza (SOD) —kataláza (CAT) —glutathion peroxidáza (GPX) — —Neenzymatické: —Vitamíny (A, E, C) —kofaktory enzymů (koenzym Q10, ubiquinol) —dusíkaté sloučeniny (kys. močová) —peptidy (GSH, melatonin, flavonoidy, karotenoidy či fenolové sloučeniny rostlin) Trolox Equivalent Antioxidant Capacity (TEAC) —Spektrofotometrická metoda —Tmavě modrý oxidant ABTS●- —Naředěn na OD734 = 0,7 a následně je k němu přidán vzorek o různých koncentracích či Trolox jako antioxidační standard —Koncentrace vzorku dávající stejnou procentuální změnu absorbance roztoku jako 1mM Trolox je považována za TAEC. Ferric Reducing Ability of Plasma (FRAP) —Spektrofotometrická metoda —Využívá redukčního potenciálu antioxidačních látek v působení na tripyridyltriazin železitý (FeIII-TPTZ), který je za nízkého pH redukován na svou železnatou formu (FeII) spolu s tvorbou intenzivního modrého zbarvení —Změna absorbance po přidání vzorku je měřena při 593 nm a výsledky jsou následně porovnávány proti změně absorbance standardního roztoku železnaté formy TPTZ —Jedna jednotka FRAP je definovaná jako redukce 1 mol FeIII na FeII. Total Radical-trapping Antioxidant Parameter (TRAP) —Luminometrická metoda —založena na termální dekompozici látky ABAP, která při 37 °C produkuje stálou hladinu peroxylového radikálu > odstraňování peroxylových radikálů antioxidanty ve vzorku > po vyčerpání antioxidantů oxidace luminolu > skokový nárůst signálu —Pro hodnocení se používají různé koncentrace Troloxu (standard) —Hodnotí se čas potřebný k dosažení nejvyššího bodu křivky (píku) VI. Úloha – Stanovení antioxidační kapacity metodou ORAC Princip —Fluorescenční metoda —Měření vychytávání peroxylového radikálu antioxidanty obsaženými ve vzorku —ABAP – produkuje peroxylové radikály při 37°C —Fluorescein – peroxylové radikály neodstraněné antioxidanty oxidují fluorescenční próbu > úbytek signálu —Trolox – antioxidant, standard (1 molekula Troloxu vychytává 2 molekuly peroxylového radikálu) Chemikálie a roztoky —PBS —Trolox (6-hydroxy-2,5,7,8,-tetramethyl-chroman-2-carboxylic acid; Mr = 250,29); 400 μM zásobní roztok v PBS —ABAP (2,2′-azobis(2-methylpropionamidine) dihydrochloride; Mr ꞊ 271,2); 0,1 M roztok v PBS —Fluorescein (Fluorescein sodium salt; Mr = 376,27); 100 nM v PBS —Měřený vzorek – myší plazma, hemolymfa z bource morušového ♂ Přístroje a pomůcky —Fluorimetr —Černá plastová 96-jamková destička —10 ml zkumavky, … Postup 1.Rozpustíme 27,1 mg ABAP v 1 ml PBS a do použití uchováváme při 4 °C. Do jamek jej pipetujeme až těsně před započetím měření ve fluorimetru. 2. 2.K 37 mg fluoresceinu napipetujeme 10 ml PBS a rozmícháme na vortexu. Vzniklý 10mM zásobní roztok dále 100x ředíme v Eppendorf zkumavce na 100μM (10 μl zásobního roztoku + 990 μl PBS). Nakonec 100μM roztok zředíme ve třetí zkumavce 1000x na pracovní 100nM fluorescein (10 μl zásobního roztoku + 9990 μl PBS). Do použití uchováváme ve tmě. Postup 3.Podle následujícího schématu si připravíme několik ředění Troloxu pro vytvoření kalibrační křivky: 200; 100; 50; 25; 12,5; 6,25 a 3,125 μM standard. 4. 4. 4. 4. 4. 4. 4.Připravíme si čtyři testovací ředění měřených vzorků (10x, 100x, 500x a 1000x). Celkem budeme potřebovat 20 μl roztoku od každého ředění. 3. Postup 5.Do jamek na černé destičce napipetujeme po 10 μl standard Trolox v duplikátech, PBS jako blank bez antioxidantů a jednotlivé vzorky. Řídíme se následujícím schématem uspořádání jamek na destičce: Postup 6.Do každé jamky přidáme 170 μl 100nM fluoresceinu. Destičku po přidání fluoresceinu držíme ve tmě, např. přikrytou alobalem! 7. 7.Zapneme a vytemperujeme fluorimetr na 37 °C (bude připraveno vyučujícím před cvičením). Destičku umístíme do fluorimetru a inkubujeme 10 min při 37 °C. 8. 8. Postup 6.Měření bude probíhat při 37 °C po dobu 2 hodin v pravidelných intervalech cca 30 s. Využijeme nastavení pro ORAC s následujícími parametry: ◦Počet měřících cyklů: 240 ◦Excitační vlnová délka: 460 nm ◦Emisní vlnová délka: 535 nm 7. 7.Do všech jamek napipetujeme 20 μl roztoku ABAP a zapneme měření. — Hodnocení a výstup —Pro každou jamku známe hodnoty fluorescence měřené v relativních fluorescenčních jednotkách (RLU) v závislosti na čase a integrál, tj. plochu pod křivkou — 1.Zprůměrujte hodnoty duplikátů jednotlivých ředění Troloxu a blanku (+ integrály) 2.Graf – závislost fluorescence na čase (Trolox + blank) 3.Graf – závislost fluorescence na čase (měřené vzorky + blank) 4.Graf – kalibrační křivka Trolox (závislost integrálu fluorescence na koncentraci Troloxu) 5.Tabulka - dosazením hodnot integrálu fluorescence vzorků do rovnice kalibrační přímky dopočtěte množství antioxidantů v měřených vzorcích (pozor na ředění!)