Aglutinační metody Bi5220c Imunologie - cvičení 2021 Aglutinační metody —Aglutinace = shlukování —Sérologické —Reakce protilátky s korpuskulárním antigenem (x precipitace) —Hemaglutinace —Důležitou roli má vzájemný poměr reagujících složek —Hodnocení vizuálně tzv. na čtyři křížky —Průkaz antigenů erytrocytů a celé řady bakteriálních antigenů VII. Úloha – Stanovení antigenů krevních skupin za použití bromelinu Princip —Antigeny krevního systému AB0 jsou molekuly glykoproteinů vázané v membránách erytrocytů —Podstatou sérologického stanovení těchto antigenů je aglutinace – shlukování erytrocytů —Bromelin je proteolytický enzym z ananasu používaný pro usnadnění aglutinace erytrocytů ◦redukuje negativní náboj na povrchu erytrocytů a odštěpuje určité polypeptidové řetězce, které vyčnívají z membrány erytrocytů Chemikálie a roztoky —3% suspenze erytrocytů krevních skupin A, B, 0 ve fyziologickém roztoku —fyziologický roztok pro červené krvinky – 0,85% NaCl —0,5% bromelin —zásobní roztok protilátky anti A, anti B (budou připraveny v ředění 1:16) a lektinu (anti H; bude připraven v ředění 1:2) Postup 1.Připravíme si 3% suspenze erytrocytů hydrolyzovaných (natrávených) bromelinem. •do tří eppendorfek s 20 μl 0,5% bromelinu přidáme 180 μl zásobní erytrocytární suspenze krevní skupiny A, B a 0 •inkubujeme 10 – 15 minut při 37 °C •centrifugujeme při 1000 rpm cca 30 s •opatrně odsajeme supernatant a k sedimentu erytrocytů na dně eppendorfky přidáme 180 μl fyziologického roztoku •opět centrifugujeme a odsajeme – celkem 3x, čímž ze suspenze erytrocytů důkladně vymyjeme bromelin •po posledním promytí přidáme 180 μl fyziologického roztoku a tímto máme připravenou 3% suspenzi natrávených erytrocytů Postup 2.Připravíme si zkumavky s protilátkami, ve kterých budeme provádět aglutinaci. Protilátky anti A a anti B ředíme geometrickou řadou 1:16, 1:32, 1:64, 1:128, 1:256; lektin ředíme 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32. Celkem si tedy připravíme 2 sady (jedna bez a jedna s bromelinem) po 15 aglutinačních zkumavkách: •anti A (5 zkumavek), anti B (5 zkumavek), lektin (5 zkumavek) pro krvinky bez bromelinu •to samé pro krvinky s bromelinem —Zkumavky značíme vždy A 1 až A 5, B 1 – B 5, H 1 – H5; jednotlivé sady bez a s bromelinem pak -/+. Postup —Z páté zkumavky vždy odebereme 200 μl, aby objem byl ve všech zkumavkách stejný a to 200 μl. Obsah obrázku stůl Popis byl vytvořen automaticky Postup 3.Do naředěných protilátek přidáme vždy po 20 μl příslušné erytrocytární suspenze. Dáváme erytrocyty A do anti A, B do anti B, 0 do lektinu (anti H). Do prvních tří řad (A, B, 0) přidáváme erytrocyty bez bromelinu, do druhých tří (A, B, 0) s bromelinem. Pořádně promíchat!!! 4.Zkumavky inkubujeme 10 min při 37 °C a poté centrifugujeme 30 s při 1000 rmp. Po lehkém protřepání odečítáme aglutinaci. Zde třepat velmi citlivě a hlavně stejně ve všech zkumavkách. Zajímá nás, zda aglutinace „drží“ či nikoli. 6. Hodnocení —Vyhodnotíme citlivost reakce, tj. uvedeme, při kterém ředění byla reakce ještě pozitivní. Používáme hodnocení na čtyři křížky: Výstup —Tabulka hodnocení na čtyři křížky pro jednotlivé skupiny a reakce s a bez bromelinu. — —Zhodnoťte vliv bromelinu na citlivost reakce srovnáním míry aglutinace erytrocytů ošetřených bromelinem s aglutinací neovlivněných erytrocytů.