Metody sledování komplementového systému Bi5220c Imunologie - cvičení 2021 Komplement —Spouštěč – navázané protilátky, LPS —Aktivace jednotlivých složek odštěpením krátkého bílkovinného řetězce —Membranolytické, opsonizační, chemotaktické —Klasická, alternativní lektinová dráha — —Stanovení jednotlivých složek je problematické ◦Krátký poločas rozpadu ◦Nízké koncentrace v séru —C3, C4 – ELISA, radiální difúze Komplement fixační reakce —Sledujeme přítomnost protilátky proti danému antigenu VIII. Úloha – Bioluminiscenční stanovení bakteriolytické aktivity komplementu Princip —Založeno na měření světelné emise (bioluminiscence), která je výsledkem reakce: — — —Bakteriální luciferáza (Lux) katalyzuje oxidaci aldehydu s dlouhým řetězcem a redukovaného flavin mononukleotidu (luciferin) za současného vzniku jejich oxidovaných forem a produkce světla s maximem při vlnové délce 490 nm. Pro tvorbu luciferinu je zapotřebí velkého množství ATP, který je produkován pouze živými buňkami - míra bioluminiscence je tedy přímo úměrná viabilitě bakterií. — —Čím větší je aktivita komplementu, tím více bakterií zlyzuje a tudíž je nižší bioluminiscence Chemikálie a roztoky —Suspenze baktérií (Escherichia coli K12 s plasmidem pEGFPluxABCDEamp) v PBS (pH 7), koncentrace cca 100 000 bakterií/jamku —HIS (Sigma Aldrich, CZ) tepelně inaktivované fetální bovinní sérum —EGTA (EthyleneGlykol-bis-(beta-aminoethylether)-N,N´-Tetraacetic Acid) (100 mM) —Měřený vzorek – rybí plazma (pstruh) Přístroje a pomůcky —Luminometr —Šablona s jednorázovými stripy Postup 1.Do dvojice se připraví 2 zkumavky s HIS: ◦pro celkovou aktivitu komplementu: 80 μl HIS + 120 μl PBS (poměr 2 : 3) ◦pro alternativní cestu: 80 μl HIS + 40 μl PBS + 80 μl EGTA (poměr 2 : 1 : 2) — 2.Do dvojice si připravíte 2 zkumavky s rybí plazmou (vzorek): ◦pro celkovou aktivitu komplementu: 40 μl plazmy + 60 μl PBS (poměr 2 : 3) ◦pro alternativní cestu: 40 μl plazmy + 20 μl PBS + 40 μl EGTA (poměr 2 : 1 : 2) Postup 3.Pipetovat na desku v pořadí dle následujícího schématu (zleva doprava – viz poslední řádek): Postup 4.Ihned po přidání bakteriální suspenze měříme v luminometru po dobu 2 hodin při laboratorní teplotě ◦Interval: 10 s ◦Počet cyklů: 720 Výstup —2 grafy závislosti bioluminiscence na čase: ◦Celková aktivita komplementu ◦Alternativní dráha ◦ —2 grafy závislosti viability bakterií (2 hodiny) po začátku měření (%) na množství plazmy v μl ◦Celková aktivita komplementu ◦Alternativní dráha ◦ —IC50 tedy množství plazmy, které je potřebné k usmrcení 50 % bakterií během dvou hodin měření - 1 U (unit) komplementu ◦Celková aktivita komplementu ◦Alternativní dráha — —Celková aktivita komplementu (U/ml) —Aktivita alternativní cesty (U/ml) —