Metody sledování imunity bezobratlých Bi5220c Imunologie - cvičení 2021 Imunita bezobratlých —(immune priming) —Vrozená (inátní) imunita —Rychlá, nespecifická — —Buněčná – fagocytóza, nodulace, enkapsulace —Humorální – AMP, PO, koagulace —Signální dráhy - Toll, Imd, JAK/STAT IX. Úloha – Stanovení aktivity enzymu fenoloxidázy Princip —Fenoloxidáza (PO) - přítomna v hemolymfě a hemocytech (profenoloxidáza) —Aktivace - např. lipopolysacharid nebo zymosan —Metanol mění konformaci profenoloxidázy a uvolňuje aktivní místo enzymu pro vstup substrátu —Substráty fenoloxidázy - tyrozin a další fenolické látky (DOPA), které jsou přeměňovány až na pigment melanin —Fenylthiomočovina (PTU) využívána pro inhibici melanizace —Stanovení PO spočívá ve sledování přeměny substrátového roztoku na barevné produkty —Měříme spektrofotometricky (tmavnutí vzorku je přímo úměrné aktivitě PO) Chemikálie a roztoky —fosfátový pufr (PBS; 10 mM; pH 7,0) —substrátový roztok DOPA (3,4-dihydroxyfenylalanin; 3 mg/ml fosfátového pufru) —roztok fenylthiomočoviny (PTU) ve fosfátovém pufru —suspenze zymosanu o koncentraci 5 mg/ml fosfátového pufru —metanol —Vzorek - hemolymfa hmyzu (Galleria mellonella) Přístroje a pomůcky —96-jamkové mikrotitrační destičky —spektrofotometr Postup 1.Ve zkumavce si připravíme směs hemolymfy s fosfátovým pufrem (ředění hemolymfy 1:10): ◦20 μl hemolymfy + 180 μl pufru → mírně promícháme otočením zkumavky ◦ 2.Po 40 μl ředěné hemolymfy napipetujeme do třech jamek (A-C) na mikrotitrační destičce. 3. 3.Dalších 40 μl směsi hemolymfa-pufr přeneseme do nové zkumavky, ve které máme připraveno 40 μl metanolu. Směs důkladně promícháme a 10 μl z ní napipetujeme do čtvrté jamky (D) na mikrotitrační destičce. Postup Postup 5.Těsně před měřením přidáme ke vzorkům roztok DOPA: do jamek A-C pipetujeme 150 μl DOPA a do jamky D 190 μl DOPA, tak aby výsledný objem ve všech jamkách byl 200 μl. 6. 6.V pětiminutových intervalech měříme absorbanci vzorků při 492 nm po dobu 30 min. 4. Výstup Výstup —Graf závislosti absorbance na čase ◦kontrola ◦spontánně aktivovaná PO ◦zymosanem aktivovaná PO ◦celková PO ◦ —Tabulka