Testování biokompatibility materiálů Jiřina Medalová jipro@sci.muni.cz > Co všechno lze nahradit?? •Organické náhrady •Kůže a kožní deriváty oKůže, Vlasy, zuby, boltce, nos •Orgány oledviny, srdce, játra, plíce, pankreas, penis •Tkáně oRohovka, mozková plena, céva, kost, šlacha, srdeční chlopeň, končetina, prst •Buňky oKostní dřeň, naprogramované T buňky, spermie, vajíčka o •Neorganické náhrady oFalešné oko oKloub, kost oKončetina, prst oZub oCévní stent oMeziobratlová ploténka oSrdeční chlopně • •Kombinace buněk a neorganických nosičů - biomateriálů oKůže oCévy o3D modely tkání osídlené buňkami (srdce, ledviny…) o o o o o • • • Výsledek obrázku pro oční náhrady Výsledek obrázku pro transplantace jater Historie - Náhrady končetin, zubů 2500 př.n.l. Mexiko 800 př.n.l Egypt https://epochaplus.cz/egyptske-protezy-palcu-u-nohy-obstoji-i-v-dnesni-konkurenci/ http://www.lpdental.cz/p91/prvni-zubni-nahrady 1500 n.l. Japonsko 300 n.l Italie Umělé náhrady 1938 - První totální náhrada kyčelního kloubu 1940 – Zavádění polymerů do medicíny - PMMA pro nápravu zlomených kostí - celulóza pro dialýzu - stehy z nylonu 1952 – první mechanická srdeční chlopeň 1953 – první náhrada cévy z polymerního dacronu 1976 – první arteficiální srdce 1975 - Založení společnosti pro biomateriály Vývoj materiálů a cíl dané generace materiálů: 1.generace – od 1950 – inertnost materiálů 2.generace – od 1980 – bioaktivita materiálů 3.generace – od 2000 – obnovení funkčních tkání http://www.technicalmuseum.cz/wp-content/uploads/2019/02/kosti_02.jpg http://www.technicalmuseum.cz/akce/az-na-kost/ http://www.technicalmuseum.cz/wp-content/uploads/2019/02/kosti_02.jpg Nejpoužívanější materiály https://slideplayer.cz/slide/2315119/ Nejpoužívanější materiály https://slideplayer.cz/slide/2315119/ Nejpoužívanější materiály Biomateriály Žádoucí vlastnosti - biokompatibilita: dobrá smáčivost, volná povrchová energie, povrchový náboj, konstantní drsnost, neimunogennost nekarcinogennost, nepyrogennost samodegradovatelnost x vysoká stabilita - musí být sterilizovatelný - výroba musí být ekonomicky, časově i ekologicky nenáročná Postup testování - in vitro – cytotoxicita (cytokinetické parametry), mutagenita, imunogenita - buněčné kultury – analogická tkáň, buněčné modely - in vivo – pyrogenita, systémová a akutní toxicita, imunogenita karcinogenita, mutagenita - myši prasátka lidé • Biomateriály a plazma Osteoartritida – kostní implantáty pokryté hydroxyapatitem pomocí plazmy https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28254288 - CaO-SiO2 plazmou nasprejovaný na keramiku https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18771893 Kardiovaskulární systém - chlopně s nepřilnavými vrstvami - hydrogely s imobilizovanými kmenovými buňkami https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25778713 Intervertebral disc – plazmou naspreovaný titan nebo titan + fosforečnan vápenatý https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15541680 Arteficiální cévy - nejrůznější polymery funkcionalizované plazmou https://www.mdpi.com/1996-1944/12/2/240 Plazma •čtvrté skupenství hmoty •kvazineutrální ionizovaný plyn • Fúze to není jen vtip II: Čtvrté skupenství hmoty Hutota prostředí Plazma elektrických výbojů • • • • • • Zapálení výboje Text_Template • • Materials | Free Full-Text | Perspective on Plasma Polymers for Applied Biomaterials Nanoengineering and the Recent Rise of Oxazolines | HTML plasma-polymerisation-reactor Cyclopropylamine + Ar Plazmová funkcionalizace povrchů Nerezový reaktor s diagnostickými metodami pro plazmu Schéma kapacitně vázaného plazmového výboje 13.56 MHz Plazmová polymerace X-ray Photoelectron Spectroscopy (XPS) X-Ray Photoelectron Spectroscopy (XPS) :: ChemViews Magazine :: ChemistryViews Obsah obrázku objekt Popis byl vytvořen automaticky XPS is typically accomplished by exciting a samples surface with mono-energetic Al kα x-rays causing photoelectrons to be emitted from the sample surface. An electron energy analyzer is used to measure the energy of the emitted photoelectrons. From the binding energy and intensity of a photoelectron peak, the elemental identity, chemical state, and quantity of a detected element can be determined. Testování biomateriálu •1. Adekvátní modelová linie oKůže – fibroblasty, keratinocyty, melanocyty oCéva – endoteliální buňky, b. hladké svaloviny oKrevně-mozková bariéra – endoteliální buňky, astrocyty o •2. Typ kultivace o2D monokultura o2D kokultivace o3D monokultura o3D kokultivace oOrgan-on-chip oOrganismus-on-chip o 3.Testování kompatibility oBiokompatibilita – testování cytokinetických parametrů + mutagenity oImunokompatibilita – testování aktivace imunitního systému • Proliferace oJak růst v přítomnosti nového materiálu ovlivní růst buněk? oKvantifikace ATP – čím více ATP v buněčném lyzátu, tím více buněk tam bylo oMetabolická aktivita – kvantifikace barevného nebo fluorescenčního produktu metabolizmu •Formazánové metody – do média se přidá tetrazoliová sůl (MTT, WST1, XTT, MTS), která je činností mitochondriálních enzymů redukována na barevný formazán •Resazurin – resazurin je dehydrogenázami redukován na červeněfluoreskující rezorufin •Calcein AM – esterázy odštěpí acetoxymethyl ester a calcein začne fluoreskovat (a není už prostupný pro membránu) o Přímé nabarvení buněk – nafocení povrchu a spočítání b. pomocí ImageJ https://imagej.net/Fiji/Downloads •DAPI, Hoechst – barviva, která prostupují membránu živých buněk Buněčná smrt •Na testovaném povrchu je méně buněk, proč? • 1.Umírají – apoptóza 1.Annexin V (zvýšení koncentrace fosfatidylserinu na vnější ostraně membrány 1.DNA žebřík (štěpení DNA mezi nukleosomy) 2.7-Aminoactinomycin D barvení (živé, umírající a mrtvé b.) 3.Štěpení caspáz, PARPu 2. 2.Nerostou 1.Blok v průchodu buněčného cyklu (Vindelovův roz., DAPI) 2.Spadnou do G0 3.Diferencují?? 4. 3. 3. 3. https://ars.els-cdn.com/content/image/1-s2.0-S0022202X15402088-gr1.gif Blok v S fázi https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0022202X15402088 Diferenciace •Diferenciace bývá často doprovázena poklesem proliferace oKožní buňky – Keratin 1, 10, Involukrin, E Cadherin o oEndoteliální buňky – při de novo tvorbě z kmenových buněk se zvyšuje exprese markerů – Pecam1, VWF, KDR, CD34 a VE Cadherin o oFibroblasty – aSMA, collagen 1 – aktivace do myofibroblastů o oVSMC – aSMA v kontraktilní fázi, collagen 1 – přechod do syntézní fáze • •Detekce qRT-PCR nebo průtoková cytometrie Imunokompatibilita By Jana Bartošíková Testujeme reakci makrofágů na daný materiál – prozánětlivá (nežádoucí) - proregenerační (žádoucí) Postup •Vyhodnocení exprese cytokinů oELISA assay – ukotvení cytokinu v sendviči protilátek a jeho kvantifikace oqRT-PCR – detekce počtu mRNA pro jednotlivé cytokiny By Jana Bartošíková Testovaný povrch Kokultivace buněk •Model cévy – různé uspořádání obuňky na protějších stranách membrány oSměsná populace na jedné straně membrány oJedny buňky na dně jamky, druhé na membráně o oKokultivace vede ke snížení proliferace VSMC buněk, patrně vlivem TGF • •Model krevně-mozkové bariéry oDůležitá je tvorba konfluentní monovrstvy endoteliálních buněk •XCELLigence – zvýšení impedance při zvýšení konfluence oAnalýza exprese ABC transportérů •qRT-PCR (MDR1, MRP1, BCRP) •Dye exclussion assays Diagram of the components in the blood-brain barrier (BBB). ABCB1 (purple) and ABCG2 (green) are expressed on the luminal side of endothelial cells. They prevent xenobiotics (blue and pink) from entering the brain and frequently share common substrates. ABC, ATP-binding cassette. https://www.researchgate.net/figure/Diagram-of-the-components-in-the-blood-brain-barrier-BBB-ABCB1- purple-and-ABCG2_fig1_321322613 https://www.youtube.com/watch?v=FcvDvCXyF4k https://www.youtube.com/watch?v=3s8zQKHQsOI Dynamická kultivace https://boku.ac.at/fileadmin/_processed_/c/c/csm_ILL_mechanicalforces_v2_8aeba6eb38.png https://boku.ac.at/dbt/ictct/dynamic-cultivation Cellular stress can arise from mechanical forces acting on the cells, with excessive forces causing rupture of the cell membrane and ultimately cell death. However, below this upper limit, mechanical stress is an important environmental stimulus, defined by physical forces that have a magnitude and most importantly a direction, so called vectors. The most basic forms are compression, tension, bending and torsion. More complex forms include hydrostatic pressure and shear stress. Mechanical forces are an essential component of the cellular microenvironment, which in vivo is gradually changing its physicochemical properties. This dynamic nature is closely related to tissue/organ development, regeneration, wound healing, and disease progression. Mechanical stress can guide the cells during differentiation or proliferation and trigger secretion of different extracellular matrix (ECM) molecules. Forces also help cells to organize spatially, to align like we see in muscle and tendon or build layered structures e.g. in skin. Therefore, in vitro platforms that mirror dynamic in vivo signalling may improve the understanding of essential biological processes and help to advance tissue engineering and regenerative medicine. Therefore, unlike in static culture conditions, the use of bioreactors for dynamic culture provides the physical cues and an improved nutrient supply which bears the potential to achieve a more organ- or tissue-specific environment for the cells. https://ibidi.com/img/cms/applications/culture_under_flow/FL_vessel_vs_channel.jpg https://ibidi.com/content/303-why-cell-culture-under-flow Liquids are a crucial component of every living species. Many cell types are surrounded by moving fluids. Examples are: •vascular endothelial cells that form the inner layer of blood vessels, •lymphatic endothelial cells that form the inner layer of lymphatic vessels, •epithelial cells of the kidney and the lung. This liquid flow causes shear stress, a mechanical force that influences the cell morphology and behavior in many ways. In many standard in vitro experiments, cells are cultured without flow. Under these static conditions, shear stress-dependent cellular changes cannot be taken into account. In contrast, in vitro cell culture under flow simulates this mechanical stimulus and induces a more physiological, in vivo-like behavior. Working under flow conditions can be especially important when using cells that occur in biofluidic systems, such as endothelial or epithelial cells. Schematic diagram of the organ-on-a-chip device for 3D culture and differentiation of brain organoids. (A) The key factors of the brain microenvironment in vivo, including fluid flow, extracellular matrix and growth factors. (B) The development process of brain organoids derived from hiPSCs in vitro. (C) Configuration of the brain organoids-on-a-chip device. (D) Enlarged view of the procedures for brain organoids generation on the chip. The EBs formed by hiPSCs were embedded in Matrigel and the mixtures were infused into the culture channel. The EBs were differentiated and self-organized into brain organoids in 3D Matrigel under perfused culture conditions. Brain-on-chip https://www.researchgate.net/figure/Schematic-diagram-of-the-organ-on-a-chip-device-for-3D-culture- and-differentiation-of_fig1_322277944 Schematic diagram of the organ-on-a-chip device for 3D culture and differentiation of brain organoids. (A) The key factors of the brain microenvironment in vivo, including fluid flow, extracellular matrix and growth factors. (B) The development process of brain organoids derived from hiPSCs in vitro. (C) Configuration of the brain organoids-on-a-chip device. (D) Enlarged view of the procedures for brain organoids generation on the chip. The EBs formed by hiPSCs were embedded in Matrigel and the mixtures were infused into the culture channel. The EBs were differentiated and self-organized into brain organoids in 3D Matrigel under perfused culture conditions. https://www.researchgate.net/figure/Schematic-diagram-of-the-organ-on-a-chip-device-for-3D-culture- and-differentiation-of_fig1_322277944 GAČR projekt: Plazmové polymery připravené na nanovlákenných membránách pro inženýrství cévní tkáně Povrchy tvořené polykaprolaktonem spřadeným do nanovláken a funkcionalizované aminy jsou vhodnými nosiči pro náhrady cév Výsledek obrázku pro cevní náhrada •Plazmatem aktivovaný cyklopropylamin vytváří aktivní aminové (+) funkční skupiny na povrchu polystyrenových misek a nanovlákenných membrán z polykaprolaktonu -Hlavní změna fenotypu buněk - zvýšení odolnosti vůči trypsinu -Studované buněčné linie -Myoblasty kosterní svaloviny (C2C12) -Keratinocyty (HaCaT) -Fibroblasty (LF) -Buňky hladké svaloviny z cévy (VSMC) -Endotelové buňky (HUVEC, HSVEC, CPAE) -3 studované povrchy - 10 W, 30 W a 150 W • - Petriho misky • - nanovlákna z polykaprolaktonu -Imunologická odpověď – RAW makrofágy + ELISA •- Kokultivace endotelových buněk a VSMC • Membrány •Cell crowns (Scaffdex) – s membránami v 24 W desce - nejsou průsvitné, nutné fluorescenční barvení • • Výsledek obrázku pro biomaterials for tomorrow Odolnost buněk vůči trypsinu https://lh6.googleusercontent.com/bS3m9WQESCmi5iFNIzJsa0iImBAsaNGWIxdWr2c1SQB2K6SBDKGtxDaPxCp9EpLGi pcDiT7M394eq5a98XrDfwmSuHCfkWRxU915KfQ5tJdDB7SUIC2VSWrpxuk4vgJx6LwQx2o7 P. Černochová, et al. 2020, Cell type specific adhesion to surfaces functionalized by amine plasma polymers, Scientific Reports (in revision) Time lapse video, HSVEC, Pav 10 W, t=3h Rychlost pohybu Rychlost přisedání Imunokompatibilita CPA membrán • Shrnutí 2D testování PCL membrán s aminovými skupinami •Indukují vysokou adhezi neendoteliálních buněk •Buňky na nich mírně zpomalují proliferaci •Buňky neumírají, nediferencují •Cytokinetické parametry jsou nejstabilnější při kultivaci na 100W membráně • •M2 proregenerační fenotyp makrofágů nejlépe indukuje vrstva 150W a hned za ní 100W • •Pro další testování je nejvhodnější membrána 100W Membrány z nanovláken polykaprolaktonu jako obvazy na chronické rány -S naspreovanými solid lipid particles (SLPs) obsahujícími antibiotika - tetracyklin a gentamicin -S naspreovanými nanočásticemi ligninu -Modifikace přidáním růstových faktorů a chitosanu Lignp4Wound M-ERA.NET grant: Antibacterial breathable wound dressing based on polymer electrospun nanofibers COOH funkcionalizace •GAČR projekt: Plasma and ion-implantation processing of microporous polymer nanomaterials for bioapplications • •plazmou modifikované PCL membrány s záporně nabitými COOH funkčními skupinami •Posílení antimikrobiálních účinků nanostříbrem naprášeným magnetronem • •Využitelné buď ke krytí chronických ran nebo jako filtry vzduchu • Functional properties of ceramic-Ag nanocomposite coatings produced by magnetron sputtering - ScienceDirect Velasco et al. 2016 https://angstromengineering.com/tech/magnetron-sputtering/?utm_medium=cpc&utm_source=google&utm_ter m=&utm_campaign=s-dsa-landing-pages&utm_content=&gclid=Cj0KCQjws-OEBhCkARIsAPhOkIYuINmFNk4y5s0UWjyp ZXoCMah218M2J5K_eJEycZEroSYaYA_ExwIaAssfEALw_wcB A magnetron sputtering source takes advantage of the above phenomena by using very strong magnets to confine the electrons in the plasma at or near the surface of the target. Confining the electrons not only leads to a higher density plasma and increased deposition rates, but also prevents damage which would be caused by direct impact of these electrons with the substrate or growing film. Chronické rány Nejčastější chronické rány •bércové vředy venózní etiologie (jsou jedním z projevů chronické žilní insuficience) •arteriální kožní vředy (projev pokročilé ischemické choroby dolních končetin) •Dekubity - proleženiny •neuropatické kožní vředy (jsou jedním z důsledků onemocnění diabetes mellitus) •kožní vředy v terénu lymfedému • • • Moderní léčba - vlhká terapie rány • profesor Winter, v roce 1962 jako první popsal, že udržování rány ve vlhkém stavu urychluje reepitelizaci • • aktivní povrch potlačující infekci a podporující hojení rány Rána, která i přes adekvátní terapii nevykazuje po dobu 6–9 týdnů tendenci k hojení http://www.hojeniran.cz/moderni-lecba.aspx Chronické rány :: Hojení ran https://ibidi.com/img/cms/applications/live_cell_imaging/MV_CI_2Well_3Well.gif Culture-Insert 2 Well in µ-Dish 35 mm Wound healing assay Jak rychle „rána“ zaroste? Life imaging microscopy - Ibidi komůrka na hladkém povrchu - Buňky v želatině v Ibidi – obvaz položen na povrch Neuro-PlasGQDs •Marie-Curie grant: Využití grafenových mikroteček (GQD) k terapii neurodegenerativních onemocnění •GQD jsou atomy uhlíku dopované NH4, které nejsou toxické, autofluoreskují, prochází krevně mozkovou bariérou, narušují tvorbu peptidových komplexů (alfa synuklein, amyloid beta) a mohou sloužit i jako vektory pro konjugovaná léčiva •Teranostika – terapie + diagnostika Shrnutí •Dlouhá a pestrá historie náhrad tkání a orgánů • •Funkcionalizace povrchů vede k širokému spektru vlastností materiálů • •Využití plazmy pro modifikace povrchů oZvýšení adheze, které ovlivňuje i rychlost dělení buněk oNěkteré povrchy mají schopnost aktivovat pro regenerační oImunitní odpověď o oPCL s CPA jsou potenciálně využitelné jako nosiče buněk v náhradách tkání a nebo jako funkční krytí ran lSkupina plazmových technologií na CEITEC (Doc. Zajíčková) lBiomateriály a tkáňové inženýrství, (FGÚ AVČR, doc. Bačáková) http://www.fgu.cas.cz/departments/biomaterialy-a-tkanove-inzenyrstvi?publicationsCount=20 https://www.ceitec.cz/plazmove-technologie-lenka-zajickova/rg9 Spolupráce Výsledek obrázku pro biomaterial science Děkuji za pozornost! jipro@sci.muni.cz