Adaptace a klasifikace prvoků (parazitických Protista Možnosti studia parazitologie Bakalářský stupeň: Obecná parazitologie (Prof. Gelnar + Prof. Vetešníková-Šimková) Speciální parazitologie (Dr. Řehulková) Základy humánní parazitologie (Prof. Gelnar) Magisterský stupeň (povinně volitelné) Biologie parazitických protozoí (Prof.Koudela) Biologie parazitických helmintů (Dr.Kašný) Biologie parazitických členovců (Doc.Valigurová) Lékařská parazitologie a diagnostika (Doc.Ditrich) Další související přednášky: Parazitologický seminář I –IV (Dr. Benovics) Evoluční ekologie (Prof.Vetešníková-Šimková) Histologie (Dr.Hodová) Mikroskopická (Zoologická) technika (Dr.Seifertová) Mikroskopické zobrazovací techniky Dr.Seifertová) Biostatistika (Doc.Jarkovský) Rozmanitost života - systematika Co je to systematika ? Buněčná a strukturální organizace prvoků Historie mikroskopické technika 24. října 1632, Delft – 27. srpna 1723, Delft Antoni van Leeuwenhoek [le:uvnhuk] byl nizozemský přírodovědec a průkopník mikroskopie. Občanským povoláním byl obchodník s textilem, vrátný na radnici a výrobce mikroskopů. Vědeckému výzkumu se věnoval pouze jako amatér, dosáhl v něm však výsledků prvořadé důležitosti. Historie mikroskopické techniky Buněčná a strukturální organizace prvoků Obrovská rozmanitost prvoků Tvarová různorodost prvoků R tab trof Model parasites group: free living amoebae •Transmisní elektronová mikroskopie (TEM) •Skanovací elektronová mikroskopie (SEM) •Environmentální skanovací elektronová mikroskopie (ESEM)) Dehydration Fixation Cryo: High-pressure freezing Embedding RT: Chem. fixation Cryo: freeze-substitution RT: ethanol substitution Thin sectioning Staining TEM P1240114 •Philips Morgagni 04 03 tem • TEM senzila-15A-51 TEM mikrov-15A-17 TEM sval buc suc 16B-41 Muscle tissue microvilli Uniciliate sensilla Muscle tissue images with half‑angstrom resolution (half a ten-billionth of a meter) resolutions below one nanometer Magellan (FEI). AFM determines the topology of a surface with a resolution down to 0.8 nm. Example of AFM image is shown below where the shape of single DNA and protein molecules are seen. (http://nano.uib.no/AFM.php) TEAM 0.5 (Transmission Electron Aberration-corrected Microscope) http://www.sciencedaily.com/releases/2008/01/080122154357.htm Ultra High Resolution SEM www.fei.com ultra high-resolution imaging, analysis and characterization TECNAI (FEI) > Elektronový mikroskop je obdobou optického mikroskopu. Optické čočky jsou v něm nahrazeny elektromagnetickými čočkami, které vytvářejí magnetické pole, a fotony viditelného světla jsou nahrazeny elektrony. Poněvadž urychlené elektrony mají několikanásobně menší vlnovou délku než fotony (světlo jsou také vlny - ach ta fyzika), rozlišovací schopnost elektronových mikroskopů je neskonale větší. Nejlepší elektronové mikroskopy mohou vzorek zvětšit až jeden a půlmilionkrát. TEM a SEM Za tu dobu se vyvinuly dva typy elektronových mikroskopů, každý funguje trochu jinak. U transmisního elektronového mikroskopu (TEM) je to skoro stejné jako u optického mikroskopu - zdroj světla, čočky a vzorek se umísťuje na podložku. K TEM navíc patří plno dalších přístrojů - vysokonapěťové zdroje, elektronika k řízení mikroskopu a hlavně výkonný vakuový systém pro vyčerpání vnitřních prostor, aby měl elektron volnou dráhu. Zahřátím dodáme elektronům energii, ty uniknou, vzorek je zadrží a ostatní nezadržené dopadnou na fluorescenční stínítko. Přímý obraz není barevný, pouze má různé odstíny šedi. Právě TEM může vzorky zvětšit až 1,5milionkrát. U skanovacího, česky řádkovacího, elektronového mikroskopu (SEM) je obraz tvořen pohyblivým svazkem elektronů, nikoliv přímo, ale odražením elektronů od vzorku. Odražené elektrony jsou zachyceny detektorem a po zesílení je obraz promítnutý na obrazovku. Obraz je ostrý, barevný a i dvojrozměrné fotografie nám mohou připadat trochu jako trojrozměrné. SEM sice zvětšuje "jenom" asi milionkrát, zato má vynikající rozlišovací schopnost. Špičkové japonské mikroskopy dokážou rozlišit vzorek pod 0,5 nanometrů (to je 0,000 000 005 m)! -- TEAM 0.5, the world's most powerful transmission electron microscope — capable of producing images with half‑angstrom resolution (half a ten-billionth of a meter), less than the diameter of a single hydrogen atom — has been installed at the Department of Energy's National Center for Electron Microscopy (NCEM) at Lawrence Berkeley National Laboratory -- Technologie AFM umožňuje zobrazovat a pracovat s atomy a molekulami za normálních „pokojových“ podmínek. Zásadní výhodou oproti elektronovým mikroskopům je, že měřené vzorky nemusí být vodivé! S technologií AFM lze dosáhnout rozlišení až v řádu jednotek nanometrů. Základním principem je snímání povrchu miniaturním hrotem, který měří konkrétní vlastnosti povrchu. Vyhodnocovací jednotka (kontroler) pak měří signál z fotodetektoru polohy hrotu. Vylepšené úchyty snímacích hrotů (tzv. nose cone) urychlují a zjednodušují změny zobrazovacích režimů. Modulární koncepce přístrojů umožňuje operativně rozšířit schopnosti mikroskopického systému dle aktuálních potřeb. Každý AFM může pracovat v různých zobrazovacích režimech, jako jsou například: kontaktní režim, akustický AC režim, MAC (magnetický AC), STM (scanning tunneling), LFM (lateral force), EFM (electric force), MFM (magnetic force), fázové zobrazování, modulace síly, snímání proudu. Diverzita a evoluce parazitických strategií u bazálních Apicomplexa Modelové organismy: gregariny, kryptosporidie a „nižší“ kokcidie ze suchozemských a vodních hostitelů (bezobratlí i obratlovce) Metodické přístupy: •terénní sběr, laboratorní chovy, in vivo a in vitro experimentální přístupy •cytologie a histopatologie, (imuno)cyto- a histochemie ð světelná (+ fluorescence) a elektronová mikroskopie; biochemické a molekulárně-biologické techniky Příklady výsledků ze studie buněčného pohybu a hostitelsko-parazitických interakcí u gregarin z mořských a suchozemských bezobratlých α-tubulin F-aktin mukron B A D C myonemy (F-aktin) záhyby epicytu F-aktin 1 2 3 4 5 6 7 Archigregarina Selenidium pygospionis ze střeva mořského mnohoštětinatce. Eugregarina Gregarina garnhami ze střeva sarančete. Příklady výsledků z předešlých studií zaměřených na výtrusovce žab Eugregarina Nematopsis temporariae z jater pulců skokana Cryptosporidium fragile ze žaludku ropuchy Obsah obrázku text Popis byl vytvořen automaticky 4 5 Adaptace prvoků k parazitismu •Strukturální •Biologické •Fyziologické •Biochemické •Ekologické •Molekulární • • Hlavní události v evoluci eukaryot 1. ztráta glykopeptidické buněčné stěny 2. vývoj vnitřního cytoskeletu 3. vznik fagotrofie Vznik a vývoj fagotrofie Hypotetická evoluce organismů Eucaryota - Protozoa Jak na systém „prvoků“ ? • •Co jsou „prvoci“ ? • Historicky to byla ta část jednobuněčných eukaryot vybavených organelami pohybu a živících se heterotrofně. • •Protozoologie je věda zkoumající „prvoky“ obtížně definovatelná skupina – obrovská vnitřní heterogenita (elektronová mikroskopie – ultrastruktura) • •Protista – všechna jednobuněčná eukaryota – označuje to typ organizace - (řecké protistos – znamená prvý ze všeho) • •Protistologie – věda zkoumající jednobuněčná eukaryota. • •Nástup molekulárně fylogenetických metod ukázal, že protista (ani protozoa) netvoří přirozenou skupinu, ale že je to množina jednobuněčných eukaryot, zástupců tradičních říší živočichů, rostlin a hub, ale také řady samostatných evolučních linií. • •Molekulární fylogenetika ukázala, že jednotlivé mnohobuněčné linie (nejméně 10 evolučních linií) vznikly nezávisle na sobě z různých typů protist. • • • Evoluce klasifikačních systémů Historický přehled systémů „prvoků“ •Linnaeus, 1735 2 říše Animalia a Plantae • •Haeckel, 1866 3 říše Protista, Animalia a Plantae • •Whittaker, 1969 5 říší Monera, Protista, Fungi, Animalia a Plantae • •Cavalier-Smith, 1998 6 říší Prokaryota, Protozoa, Fungi, Animalia, Plantae, Chromista • • •Klasifikace prvoků „80“ - podle Lee et al. 1985 • •Klasifikace prvoků „1994“ - podle Corlise – iterim user friendly classification • •Klasifikace prvoků „2000“ – podle Doolittle 1999, Baldauf, 2000 – SSUrRNA • •Klasifikace prvoků podle Simpsona a Rogera 2004 – 6 superskupin eukaryot • • Opisthokonta, Amoebozoa, Archaeplastida • Chromalveolata, Rhizaria, Excavata • • • • • • Konvergence při evoluci prvoků Klasifikace prvoků „80“ - podle Lee et al. 1985 •Říše: Animalia •Podříše: Protozoa • •Kmen: Sarcomastigophora •Podkmen: Mastigophora – střevní a krevní bičíkovci (např. Giardia, Chilomastix, Trichomonas, Dientamoeba, Leishmania,Trypanosoma) •Podkmen: Sarcodina – obligátní a fakultativní améby (např.Entamoeba, Iodamoeba, Endolimax, Acanthamoeba, Naegleria) • •Kmen: Apicomplexa • Třída: Sporozoea • Podtřída: Coccidia • Řád: Eucoccidiida • Podřád: Eimeriina (např. Isospora, Sarcocystis, Toxoplasma, Cryptosporidium) • Podrád: Haemosporiina (např. Plasmodium) • Potřída: Piroplasmea (např. Babesia) • •Kmen: Microspora (např. Encephalitozoon, Nosema) •Kmen: Ciliophora (např. Balantidium) • • Trypanosomatidea Diplomonadea - Giardia Apicomplexa - sporozoit Mikrosporidia – průnik do hostitelské buňky Ciliophora - nálevníci Klasifikace prvoků „1994“ - podle Corlise – iterim user friendly classification •EUCARYOTA •Říše: Archezoa •Kmen: Metamonada (Giardia, Enteromonas, Chilomastix, Retortamonas) •Kmen: Microspora (Encephalitozoon, Enterocytozoon, NOSEMA) •Říše: Protozoa •Kmen: Percolozoa (Naegleria) •Kmen: Parabasala (Dientamoeba, Trichomonas) •Kmen: Euglenozoa (Leishmania, Trypanosoma) •Kmen: Ciliophora (Balantidium) •Kmen: Apicomplexa (Cryptosporidium, Cyclospora, Isospora, Sarcocystis, Toxoplasma, Plasmodium, Babesia)) •Kmen: Rhizopoda (Acanthamoeba, Balamuthia, Endolimax, Entamoeba, Iodamoeba) •Říše: Chromista •Říše: Plantae (sensu stricto) •Říše: Fungi (sensu stricto) •Říše: Animalia (sensu scricto) • • Evoluce protozoí - současnost Klasifikace prvoků „2000“ – podle Doolittle 1999, Baldauf, 2000 – SSU rRNA •Říše: Protozoa •Jednobuněčná Eukaryota, fagotrofní, nefotosyntetizující organismy bez buněčné •stěny. Celkem 13 kmenů, z nichž 7 parazituje u člověka • •1. Podříše - Archezoa •Jednobuněčná Eukaryota s některými znaky Prokaryot na ribosomech a tRNA: •nemají plastidy, mitochondrie, Golgiho tělíska a cytoplasmatické inkluze – •hydrogenosomy a peroxisomy – 2 kmeny: •· Metamonada ·Parabasalia • •2. Podříše – Neozoa •Jednobuněčná Eukaryota s plastidy, mitochondriemi, Golgiho •tělísky a cytoplasmatickým inkluzemi - hydrogenosomy a peroxisomy – 5 kmenů: ·Percolozoa ·Euglenozoa ·Amoebozoa ·Sporozoa ·Ciliophora · • • • Klasifikace prvoků „2000“ - základní klasifikace organismů – 6 říší – 3 domény života •Bacteria – patogenní agens - Prokaryota •Protozoa – paraziti člověka •Animalia – paraziti člověka •Fungi – paraziti člověka (patogenní agens) •Plantae – paraziti rostlin •Chromista – paraziti člověka (patogenní agens) Říše Protozoí v systému navrženém Cavalier-Smithem, 1998 Současné rozdělení eukaryotických organismů Klasifikace prvoků podle Simpsona a Rogera 2004 Zástupci parazitující u člověka Zástupci neparazitující u člověka Současné rozdělení eucaryot Adaptace prvoků k parazitismu •Strukturální •Biologické •Fyziologické •Biochemické •Ekologické •Molekulární • • Schéma živočišné buňky Základní buněčné organely Eukaryotní živočišná buňka Současné rozdělení eucaryot •Excavata Fornicata Giardia • Parabasala Trichomonas • Heterolobosea Naegleria • Euglenozoa Trypanosoma • Leishmanie •Rhizaria Haplosporidia Haplosporidium •Chromalveolata Stramenopila Blastocystis • Ciliophora Balantidium » Apicomplexa Plasmodium » Toxoplasma •Plantae Viridiplantae Prototheca •Amoebozoa Lobosa Acanthamoeba • Archamoebae Entamoeba •Opistokonta Metazoa Myxobolus, Anopheles,Taenia, Ascaris • Microspora Nosema • Pneumocystis • Excavata •· Kmen: Fornicata (Metamonada) •Jednobuněční střevní bičíkovci se dvěmi, čtyřmi nebo •osmi bičíky – řády: •Diplomonadida - Giardia duodenalis •Enteromonadida - Enteromonas hominis •Retortamonadida - Chilomastix mesnili • - Retortamonas inestinalis • •· Kmen: Parabasala •Jednobuněční bičíkovci s jedním nebo více jádry a •početnými bičíky: charakteristický komplex parabasálního •tělíska ekvivalentní Golgiho tělísku, nemají mitochondrie •Trichomonadida - Dientamoeba fragilis • - Trichomonas vaginalis • - Trichomonas tenax • - Pentatrichomonas hominis • Excavata • •· Kmen: Heterolobosea (Percolozoa) •Jednobuněční, bez pigmentů, typické jsou •jeden až čtyři bičíky, mají mitochondrie a •peroxisomy ale chybí Golgiho tělíska – řád: •Schizopyrenida – Naegleria fowleri • • •· Kmen: Euglenozoa •Jednobuněční bičíkovci s 1 až 4 bičíky; mají •Golgiho tělísko a mitochondrie – řád: •Trypanosomatida – Leishmania donovani, • L.infantum, L. major, • L.tropica, L. brasiliensis, • L. mexicana, L. aethiopica, • L. peruviana, • Trypanosoma cruzi, • T. brucei gambiense, • T. brucei rhodesiense, • T. rangeli. • • • • • • • T. Cruzi parasite Chromalveolata •Kmen: Stranemophila •Jednobuněční mající plastidy a využívající fotosyntézu, •filamentózní struktura nebo v koloniích (řasy), u některých •zástupců sekundární ztráta plastidů. • •Třída: Blastocystea – Blastocystis hominis B. spp. cyst-like forms in wet mounts under differential interference contrast (DIC) microscopy. Chromalveolata •Kmen: Ciliophora •Jednobuněční mající velký počet cilií používaných k lokomoci a •komplexní orální ciliaturu využívanou k příjmu potravy. Dva typy •buněčných jader – jedno nebo více polyploidních macronuclei s jedno •nebo více diploidních micronuclei. Většinou volně žijící – řád: •Vestibuliferida – Balantidium coli • • •Kmen: Sporozoa (Apicomplexa) •Jednobuněční vyznačující se apikálním komplexem: •polární kruh, rhoptrie, mikronemy a conoid, v životním •cyklu se vyskytují sexuální procesy, všichni parazitují •řády: • •Eimeriida: Cryptosporidium parvum,Toxoplasma • gondii, Cyclospora cayetanensis, Isospora belli, Sarcocystis hominis, S. suihominis. •Piroplasmida: Babesia microti, • B. divergens, B. gibsoni •Haemosporida: Plasmodium falciparum, • P. malariae, P. ovale, • P. vivax Chromalveolata Amoebozoa •Jednobuněční, bezbičíkatí, mají pseudopodie a používají je k příjmu •potravy a lokomoci. • •Kmen: Lobosa •Acanthopodida - Acanthamoeba castellanii, Balamuthia mandrilaris • •· Kmen: Archamoebae •Entamoebida – Entamoeba histolytica, E. coli, • E. dispar, E. hartmanni, E. gingivalis, E. moshkovski, • E.polecki, Endolimax nana, Iodamoeba buetschlii • Opisthokonta (Fungi) •Kmen: Microspora (mikrosporidie) •Eukaryotické heterotrofní organismy, nemají plastidy ale •mají buněčnou stěnu obsahující chitin a b-glykany. •Třída: Microsporea: Encephalitozoon cuniculi, E. hellem, E. intestinalis, Enterocytozoon bieneusi, Nosema ocularum, N. corneum, Brachiola connori, B. vesicularum, B. algerae, Microsporidium ceylonensis, M. africanum, Vittaforma corneae, Trachipleistophora hominis, T. anthropophthera, Pleistophora ronneafiei. Pneumocystis cariní Opisthokonta Left: Microfilariae of W. bancrofti in thick blood smear stained with Giemsa. Right: Microfilaria of B. malayi in a thick blood smear, stained with Giemsa. Center: Photograph of a female Aedes aegypti mosquito as she was in the process of obtaining a "blood meal." Laboratory strains of Aedes aegypti can be infected with Brugia. ANd9GcTzXuFcm_o3TN0KcnLQMYQSIqFb7gGRxSG25Mm9RRT8XsFQk40kAA •Kmen: Metazoa • Lokomoční organely •Tři typy lokomočních organel •Pseudopodia •Bičíky (flagella) •Řasinky (cilie) • •Undulipodia – flagella + cilie • Panožky -pseudopodia •Améby – dočasné struktury pohybu a přijmu potravy –Lobopodie –Filopodie –Rhizopodie –Axopodie – •Améby limax (Limax) • Améby - panožky Bičíky - flagella •Štíhlé, dlouhé – centrální axonema – centrální pár mikrotubulů •Na obvodu 9 párů mikrobutulů •Axonema začíná v kinetosomu (centrání tělísko) •Periflagelární kapsa •Mastigont – systém označující spojení mezi bičíkem, kinetosomem a souvisejícími organelami •Heterokont – bičíkovec se dvěma (a vice) funkčními typy bičíků Struktura bičíku nebo řasinky Stavba bičíku – mikroskopický řez Schématický řez bičíkem Giardia - pohyb tekutiny Systém mastigont u bičíkovců Mastigont system Mastigont je řada struktur nalezených u několika protistů, jako jsou thrichomonády a améby. Je tvořen bazálními těly a několika dalšími strukturami složenými z fibril. Jejich funkce není plně pochopena. Wikipedia Archamoebae – systém karyomastigontu Bičíkovci - heterokont Řasinky - cilie •Cílie jsou strukturálně analogické bičíkům – mají kinetosom, centrální axonemu a 9 periferálních dvojic mikrotubulů •2 základní typy ciliatury –Somatická ciliatura (kinetie – řady) –Orální ciliatura (různé uspořádání – systematika) Základní organely Apicomplexa Ciliophora - nálevníci Ciliatura nálevníka Diagram struktury ciliárního komplexu Rekonstrukce pelikulárních struktur Ciliata – schématická stavba Potrava a metabolismus prvoků •Heterotrofní – mnoho symbiotických zástupců – evoluce parazitismu •Cytostom - organela pro příjem potravy – Ciliata •Cytopyge – buněčná řit •Příjem potravy: –Fagocytóza –Pinocytóza –Endocytóza • Fagotyzóza Pinocytóza Receptory zprostředkovaná endocytóza Tvorba potravní vakuoly Děkuji za pozornost !