CYTOLOGIE A MORFOLOGIE PROKARYOT 7 Růstové cykly bakterií II. •střídání přisedlé a volné (plovoucí) formy života u prokaryot •nutná přítomnost vodního prostředí •mořské i sladkovodní •tělní tekutiny – sliny, střeva, krev • •typický příklad biofilm - Caulobacter crescentus, Sphaerotilus natans • • •přizpůsobení přisedlému způsobu života mechanismy adheze k povrchům: • reverzibilní – van der Waalsovy síly • irreverzibilní – chemická vazba (elektrostatická, kovalentní, vodíková) •Biofilm •…společenství buněk usazených v polysacharidové matrix •přichycených k povrchu nebo okolním buňkám, se změněným fenotypem růstu •Antony von Levenhoek - jako první pozoroval biofilm - na zubech • • •Biofilm •Aktivní biologická vrstva složená z mikroorganismů (baktérií,řas, hub,mikroprotozoa, metazoa) a jejich extracelulárních polymerních produktů,která je přichycena na povrch nejrůznějších podkladů, které mohou být či jsou v kontaktu s vodou… • •Biofilm • •volně plovoucí (planktonické) buňky se usazují na vhodném povrchu •zahodí bičík a začínají produkovat matrix z polysacharidů •formují se „hřibovité“ útvary s dutinami a kanálky •složky biofilmu: bakteriální buňky a jiné organizmy uvnitř hřibovitých shluků propojených kanálky a póry •jednodruhový biofilm – př: aerob P. aeruginosa – bývá mnohem tenčí než vícedruhový • •odolnější vůči patogenům • vyšší odolnost v biofilmu vůči imunitnímu systému hostitele !!!!! •biofilm se v přírodním prostředí většinou vyskytuje jako multidruhový •různé ekologické vztahy - kompetice o ziviny, symbioza, syntrofie •adheziny jsou zasadite nebo neutralni... •extracel. polysacharidy jsou kyselé • •Vznik biofilmu • •přizpůsobení přisedlému způsobu života •mechanismy adheze: adhesiny, fimbrie – curli, glykokalyx •reverzibilní – van der Waalsovy síly – slabé vazby •Irreverzibilní – chemická vazba (kovalentní, vodíková) •přítomnost extracelulárních polymerů •změna fenotypu - ustává syntéza bičíků, mukózní látky • • •Spouštěcí podněty: •osmotický tlak •snížený obsah kyslíku •rostoucí hustota poulace - quorum sensing •např: acyl-homoserin lakton (G-), malé peptidy (G+) • •adheze - buňka produkuje více adhezinu - potom extracelul.matrix ... •bičík slouží k tomu aby se buňka k povrchu dostala -po přisednutí bičík odpadá • https://www.youtube.com/watch?v=1XNM4bLgt_U •Po přichycení změna vlastností bakterií • •zprvu na úrovni regulace genů •po přisednutí - změna produkce bílkovin – vyrábí se ty, které se účastní se tvorby matrix •1/3 bílkovin se produkuje v rozdílném poměru • více tvořeny bílkoviny pórů, transportní a proteiny syntetizující mimobuněčnou hmotu •po přichycení je nutno vytvořit matrici z polysacharidu •př: P. aeruginosa - alginát, již 15 minut po přisednutí • • •Adheze buněk k povrchu je ovlivněna: • •1) povrch • hrubost, chemickým složením, povrchovou úpravou •buňka je schopna kolonizovat jakýkoli povrch, dává ale přednost hrubým,drsným povrchům - lépe se přichytí • •2) hydrodynamické vlivy •biofilmy vznikající v pomalu proudící tekutině izotropní struktury •biofilmy vznikající v rychleji a jednosměrně proudící tekutině jsou vláknité, zřetelně nasměrované útvary buněk •růst biofilmu záleží na toku (jednosměrný, obousměrný), proudící/stojatá • • • • • • •Dostupnost živin • •živiny se dostávají k buňkám biofilmu pomocí kanálků •pokud kapalina proudí je zdrojem čerstvých živin •kapalina stoji (pak živiny putují díkymolekularní difuzi) •metabolity odváděny kanály ven •buňky na povrchu jsou na tom nejlíp s přístupem živin •jsou aktivnější, často v log fázi •buňky u báze v biofilmu jsou ve fázi až stacionární •díky změnám v dostupnosti živin i kyslíku, vznik heterogenních lokalit v jednom biofilmu •př. možná přítomnost anaerobních mikrohabitatů v jinak aerobním źralém biofilmu • •Stabilita biofilmu • •mechanismy vazby buněk - EPS, DNA, bílkoviny, fimbrie, bičíky, fágy • •disperzi biofilmu ovlivňují: •dostupnost živin •množství kyslíku •pH •přítomnost chemických sloučenin •proudění tekutiny •„surface sensing“ •specifita mezi konkr. dr. patogena a povrchem •ne všechny buňky na všechny povrchy ho mají • •Roli hrají: •vhodné receptory a kompatibilita s cílovou molekulou •(C. diphtheriae epitel hrdla; S. salivarius – zub, chlopně...) •hydrofobicita buněčného povrchu •interakce buňky s povrchem indukuje změnu exprese genů buněčné morfologie, motility a adheze • •streptokok – vytváří velmi odolné biofilmy…proč??? •na biofilmu se nepodílí jen polysacharidy, ale taky složky pouzdra • •Quorum – sensing • •soustava malých organických molekul produkovaných buňkou •tvořeny v závislosti na koncentraci buněk v prostředí •buňka tak reaguje na hustotu populace •kaskáda reakcí po vazbě na receptor spouští syntézu sekundárních metabolitů a komunikaci v rámci bakt. společenstva •vnitrodruhová organizace komunity •signalizace mezi buňkami podmíněná jejich koncentrací • •integrace signálů z prostředí - předávány buněčnými transdukčními mechanismy •koordinace genové exprese v závislosti na místní hustotě populace • •podobně činí některé sociální druhy hmyzu, kde používají quorum sensing ke kolektivním rozhodnutím, např. kde vybudovat hnízdo • •u planktonních bakteriálních populací může upozorňovat na stres a jako ochranu zahájit tvorbu biofilmu, který je vůči němu odolnější • •může kontrolovat velikost a hustotu biofilmu a případně podněcovat disperzi nebo rozklad buněčných subpopulací • •může působit na chování buněk v biofilmu a indukovat nebo potlačovat např. sekreci EPS a adhezinů či pohyblivost jednotlivých skupin buněk, což ovlivňuje strukturu biofilmu •Autoinduktory • •signální molekuly jsou produkovány uvnitř bakteriálních buněk •vysoký stupeň specificity receptoru a transport přes buněčnou membránu, který může být aktivní nebo pasivní. •3 třídy na základě jejich struktury a specifické funkce: • 1)AHL (Acyl Homoserine Lactones) •AHL jsou malé difuzní molekuly s jádrovým laktonovým kruhem a acylovým postranním řetězcem, které jsou odpovědné za usnadnění signalizace v gramneg. bakteriích 1) 2)AIP (Autoinducing Peptides) •snímání kvora u grampoz. bakterií •krátké peptidové řetězce syntetizované v buňce •AIP postrádá volný transport přes buněčnou membránu •vyžaduje speciální membránové transportní proteiny • •3) AI-2 (Autoinducer-2 ) • signální molekuly odvozené od furononu •u G+ i G- bakterií •vykazují vlastnosti AHL i AIP •G+ •induktory se vážou na receptor •ten pak aktivuje regulátor odpovědi • pak spustí regulaci genu...receptor je stále aktivován - dochazí k expresi molekul • G- •malé molekuly induktorů prochází přímo přes membránu. .. •Quorum – sensing • regulace luminiscence u Vibrio fischeri, symboóza s mořs. bezobratlými •LuxI produkuje autoinduktor N-(3-oxohexanoyl)-homoserinelactone https://www.youtube.com/watch?v=mQ43fuJJW7M https://www.youtube.com/watch?v=e-CIJyc8xXg •načasování rozmístění faktorů virulence v hostiteli je kritický bod • patogen se může hromadit bez vykazování faktorů virulence •více než 4% z téměř 6 000 genů P. aeruginosa regulováno pomocí quorum-sensing • •Dva QS systémy : •Las (indukce Rhl) •Rhl (indukce genů virulence) • •jeden systém ovládá geny Las - indukuje tvorbu genu RHL • Rhl potom indukují geny virulence • •Rezistence k ATB •vnitřní mechanismy rezistence: omezená difuze antibiotik biofilmem •metabolická aktivita bakterií v biofilmu •perzistentní buňky •u biofilmu je az 1000x větší než u planktonního organismu.... protože je tam hodně bakterií, mají různou metabolickou aktivitu •taky dochází k tvorbě perzistetních buněk... proto ta rezistence k ATB • ATB rezistence https://www.youtube.com/watch?v=8Ss1cGyOyEk •omezená difuze antibiotik biofilmem • • • • • • • • • • • •metabolická aktivita bakterií v biofilmu • • • •Perzistentní buňky • •podle teorie perzistentních buněk přežívá malá subpopulace bakterií i radikální léčbu antibiotiky poté, co tyto buňky přechází do dormantního stádia podobného sporám • •jsou schopny přejít do dormantního stadia...způsobují problém při léčbě... •protože unikají ATBiotikům a taky imunitnímu systému... • •unikají asi proto, ze spustí antistresové faktory • uměle sníží replikaci dna, transkr, transl •přečkají nevhodné podmínky.... po zlepšení zase obnoví svoji aktivitu • •Početná populace…. •přenos genů až 1000x úspěšněji než u buněk planktonických •fenotyp buněk se rytmicky mění •odplavení díky aktivaci genu pro syntézu enzymu štěpícího matrici •po odplavení si zachovají urč. dobu vlastnosti jako v biofilmu •Studium struktury biofilmu • • větš. u G- •polysacharidová glykokalyx • •mikroskopie: •světelný mikroskop: obtížné •elektronový: nepracuje se živými buňkami •konfokální: - plochy ve zvolené hloubce, z řezů skládána struktura •řádkovací elektronoptická technika… • •studium složení •studium přítomnosti genů/látek souvisejících s tvorbou biofilmu •mikrotitrační destičky, mikročipy, sondy, •PCR, hmotnostní spektrometrie.... • •Shewanella biofilm – konf.mikr. •Horniny a bakterie – koevoluce • •složení minerálů ovlivňuje počet a diverzitu mikrobů •síru oxidující bakterie silně okyselují prostředí a tvoří póry •potenciální vliv hornin na složení a tvorbu biofilmu • •Biofilm v lidském těle • •zubní povlak •střevní sliznice • •chronické infekce: •dýchací cesty •ušní infekce •močové cesty •chronický zánět prostaty •sliznice nebo uvnitř tkáně •endokarditida • rány; bércové vředy; spáleniny •Biofilm skloviny • •700 kmenů z 18ti rodů •mezibuněčný kontakt – role adhezinů (lektiny) a receptorů (sacharidy) •kontak s povrchem zubu – pelikula proteinů, lektiny... (Rickert et al. 2003) 41 •Morfologické struktury orálního biofilmu • •“corncobs” – koky koagregující s vláknitými bakteriemi • •“rosette” - 1 kok koagregující s koky jiného typu • •Biofilm a medicína • •cévky – arteriální, žilní •močové katetry •dýchací a dializační přístroje •umělé chlopně •kontaktní čočky •děložní tělísko •bakterie jsou unášeny proudem krve a mohou začít infekční proces na odlehlém místě…. •vytrvalá syntéza a uvolňování toxinů… •nemusí být kontakt s vnějškem! - kovové náhrady kloubů •Výhody přisedlých stadií: •lepší dostupnost a využitelnost substrátu •adsorpce makromolekul a malých hydrofobních molekul na povrch •lepší využitelnost koncentrovaných živin •ochrana před inhibičními účinky antibakteriálních látek (antibiotika, chlor, těžké kovy) •ochrana před bakteriofágy a parazitickými bakteriemi • •Nevýhody přisedlých stadií: •sedimentace, vyčerpání živin a •neschopnost kolonizovat nové, vhodnější prostředí •konzumace substrátu (částic) zooplanktonem •vznik gradientů v biofilmů od povrchu k podkladu – snižují se živiny, kyslík • •Růstový cyklus Caulobacter crescentus • •Caulobacter - je modelovým organismem pro studium diferenciace u prokaryot •má asymetrické dělení •G- oligotrofní bakterie •přes 3000 genů - to mu umožňuje přežít v nepříznivých podmínkách •kolonizuje všechny půdní prostředí •..... stopkatá buňka - velice silná adheze!!! • využití v biologických lepidlech • •Stádia růstového cyklu • •1. bičíkaté, volné stádium (swarmer cell) •nerostoucí, nepodléhá dělení • bičíkatá dceřiná buňka • •2. stélkaté přisedlé stádium – reprodukční • „nezkušená buňka“ – ještě se nedělila • „zkušená buňka“ – již „vyprodukovala“ dceřinou pohyblivou buňku • • • •Zvláštnosti růstového cyklu • 1.růstová stádia se nutně střídají, žádné není alternativou, která se nemusí realizovat (viz klid. stádia) 2. •2. mateřská buňka je v jistém slova smyslu „nesmrtelnou buňkou“, produkuje velké množství dceřiných buněk • (na rozdíl od konvenčního dělení, kde nelze striktně odlišit mateřskou a dceřinou buňku) • •plovoucí bičíkatá buňka se nereplikuje •odhození a nahrazení bičíku a pilusů polární stélkou, která umožní přichycení buňky k podkladu •nezralá stélkatá buňka se prodlužuje •přisednutí na místo s vhodným substrátem a diferenciace •poté iniciace replikace DNA •reproduktivní stélkatá buňka replikuje DNA, vznik dceřiné buňky • syntéza nového bičíku na pólu proti stélce • •dva typy vývoje - cyklický a necyklický •cyklický - začíná v G fázi buňky - přechází do S fáze (dochází k replikaci DNA) •b. roste --> dělení --> vzniknou dvě buňky (jedna je stále stopkatá, druhá má bičík!!)... • •po rozdělení buněčného obsahu bičík rotuje --> oddělení buněk --> vytvoří se pilli.... jedna b. stále přilnuta k povrchu, druhá je volná (v této neprobíhá replikace dna)..... potom se z ní stane stopkatá b. • přilne k podkladu a probíhá opět cyklický vývoj • Růstový cyklus Sphaerotilus natans •žije v organicky znečištěných vodách, ale dobře prokysličených •schopna fixovat polyalkoholy, polysacharidy... •ráda se vyskytuje v čističkách vod (problémy!!!) •volné buňky najdou vhodné životní prostředí •přichytí se k podkladu •odhodí bičík •začnou tvořit pochvu •dělí se uvnitř pochvy •z pochvy se uvolňují dceřiné pohyblivé buňky • •volné buňky = G- tyčky ... •když je třeba, odhodí bičík •vzniká přisedlé stadium •tvoří pochvy (přichycení, obalu a zisk živin) •obsahují Fe a Mn .... taky jako ochrana proti predátorům • •Střídání volného a přisedlého stadia u Actinoplanes • •přisedlé stadium – vegetativní mycelium, množící se •volné stadium – bičíkaté spory, které se tvoří ve sporangiu (zoospory) DĚKUJI ZA POZORNOST