CYTOLOGIE A MORFOLOGIE PROKARYOT 6 Růstové cykly bakterií I. Jednoduché růstové cykly (RC) •Jednoduché RC •střídání dvou stadií •rostoucí a klidové •přisedlé a volné •infekční a reprodukční • •Komplexní RC •více než dvě vývojová stádia •Myxobakterie, Streptomycety • •RC vedoucí ke vzniku diferencovaných populací •sinice Anabaena Růstový cyklus •období mezi „narozením buňky“ a iniciací replikace •období replikace •období mezi koncem replikace a dokončením buň. dělení Dělení bakteriálních buněk •dělení binární •dělení asymetrické •dělení vedoucí ke vzniku diferencovaných populací •Generační doba - doba potřebná ke zdvojení • v optimálních podmínkách 30 minut • •Reprodukce bakterií • • Binární dělení •buňka zvětší svůj objem • replikace chromozomu • vznik septa - (G+ dosyntetizováním PG vrstvy... G- konstrikcí) •rozdělení buňky • •Replikace •místa ori (počátek) a ter (konec) na chromozomu •prodlužování buňky •nová replikace ještě před úplným rozdělením buňky.. • •hodně živin v prostředí - množí se mikroorganismy rychle •replikace může probíhat několikrát •než se jedna dokončí, druhá může začít •nemusí se čekat do konce replikace, než se další zdvojí •až 8 replikací v jedné buňce současně •Jednoduché růstové cykly •(střídají se dvě stádia) • •adaptace či příprava (u sporulace) na změny podmínek životního prostředí • nikoli odpověď!!! •u parazitů - jedna faze je infekční, jedna je reprodukční •prostředí těla vyšších organismů do vnějšího prostředí (např. voda) • •Buněčné formy prokaryot • •vegetativní formy buněk - fyziologicky aktivní • •cysty neboli exospory odolné proti dehydrataci, ne však proti horku •hl. u G-, rody Metylosinus , Actinobacteria, Rhodomicrobium • •endospory - odolná klidová nereproduktivní stadia - hl. u G+ •endo jsou stabilnější než exo •cysty jsou méně odolné, ale stejně umožní vysokou toleranci UV záření, teploty, vysychání než vegetativní buňky •Azotobacter, Myxococcus, Sporocytophaga, Bacillus, Clostridium • •konidie - asexuální reprodukční struktury aktinomycet 1)Vegetativní a klidové stadium • Tvorba spor 1) •Endospory •- převážně G+ bakterie •Bacillus (aerobní tyčky), Clostridum, Thermoactinomyces a •Desulfotomaculum (anaerobní tyčky), Sporosarcina (aerobní koky), Sporolactobacillus, Oscillospira, Thermoactinomyces •výjimečně i G– bakterie (Coxiella burnetii, původce Q-horečky). • • Cysty (exospory) •- méně rezistentní, odolné zejm.vůči vysychání •Azotobacter, Methylosinus •Vegetativní st. - růst a binární dělení (formování mezozomu, septa) • buň.dělení trvá průměrně 2 minut, p. podmínek růstu se může měnit • Bacillus megaterium – zelené spory obarvené varem v malachitové zeleni •Endospora, sporulace • •několik výjimečných charakteristik… •spora eukaryot - stadium schopné reprodukce •spora u bakterií - je to klidové stadium •oproti Eucarya pouze jedna endospora v buňce • (https://ziva.avcr.cz/2017-5/mikrosporidie-houby-co-nevypadaji-jako-houby-aneb-sestry-rise-fungi.ht ml) • •peptidoglykan v kortexu spory je jiný než v buňce •stabilizace makromolekul ve spoře! • díky specifickým bílkovinám, ztrátou náhradou vody vápníkem • (pouze zde se nachází v přírodě unikátní kys. dipikolinová) •vysoká odolnost napomáhá přečkat podmínky nevhodné pro život i po tisíce let (?) •šíření bakterií i na značné vzdálenosti v různém prostředí •tvorba endospory však není odpovědí na prostředí, ale přípravou na nepříznivé podmínky •již odstartovaný proces sporulace již nejde zastavit •endospory odolné k působení UV a γ záření, vysoušení, lysozymu, teplotním změnám, nedostatku živin a působení mnoha dezinfekčních prostředků… •v ethanolu mohou přežívat několik měsíců • • •sporicidní látky: •ethylenoxid, β-propionlakton, koncentrované louhy •formaldehyd při prodloužené expozici •kyseliny, kyselina peroctová – Persteril, jodové preparáty, chloramin Pozorování endospor •nebarví se Gramem •vysoce světlolomné útvary •spory mají nižší kontrast, jsou hustší nez okolí - ve fázovém kontrastu jakoby září •neobarvené endospory lze pozorovat fázovým kontrastem (zářící spory) •nebo Nomarského kontrastem (plastický povrch buňky) •jednoduchým barvením nezvýrazníme spory samotné, jen vyklenutí buňky (díky přítomnosti spory) •obarvit endosporu od stadia vzniku kortexu je možné pouze za horka (prospora je pro barvivo ještě propustná!) fázový kontrast Nomarského kontrast •Strukturální barvení endospor • •tvar, velikost a umístění spory v buňce je dalším charakteristickým znakem napomáhajícím identifikaci •př: oválné spory B. cereus, B. anthracis, Cl. botulinum •kulaté spory Clostridium tetani či B. sphaericus •cylindrické či elipsoidní spory •u velikosti spor hodnotíme zda a kde vyklenuje buňku •spory barvíme za tepla (strukturální barvení - k barvení různých struktur, nejen spor) spory jsou težko odbarvitelné... je to spíše moření nez barvení • •tvorba spor je důlezity taxonomický prvek - ale pozor - buňky tvoří spory jen v některých stadiích - čím starší kultura, tím víc tvoří spory •v labině můžeme využít tzv. sporulační média • • • • •spory se velmi těžko barví i po fixaci •silný, špatně prostupný obal • •používají se koncentrovaná barviva •moří se za tepla •obarvené spory se těžko odbarvují kyselinami (aj., např. etanol) • •Barvitelnost spor záleží na: •vývojovém stádiu •stáří kultury •kvalitě živné půdy •individuálních vlastnostech mikrobů •barvitelnost spor se také (podobně jako u plísní) zlepší použitím sporulačních médií • (s přídavkem manganu nebo urey) •Uložení v buňce • • terminální - na konci tyčinky (C. tetani, B. stearotermophilus) • • centrální (C. histolyticum, C. novyi, C. septicum, B. anthracis, B. cereus) • •subterminální - uložena paracentrálně = mezi středem a pólem buňky, nejčastěji (C. botulinum, C. sporogenes, B. brevis) •rozšíření buňky: C. botulinum, C. tetani, Bacillus stearothermophilus •mírné rozšíření: C. histolyticum a C. novyi •u některých druhů spora buňku nezduřuje: B. anthracis, B. cereus • C. perfringens C. tetani Clostridium botulinum B. cereus Clostridium difficile •Klinicky významné jsou spory rodů Bacillus a Clostridium • •Clostridium botulinum •sporulující buňky odolávají 2-6 hodin teplotě 100 °C •nesporulující hynou po 30 min při 70 °C •spory inaktivovány po 20 min při 121 °C vodní páry při 2 atm •nebo po 90 – 180 min při 160 - 200 °C suchého tepla •opakovaný var (vysoce termorezistentní přežijí až pětihodinový var) • •Clostridium tetani •ke zničení spor nutno působit 100°C po 90 min • •Bacillus anthracis •biologická zbraň, anthrax • • •Stavba zralé bakteriální spory • •jádro spory – gelová matrix (nukleoid), kalcium dipikolinát (CDPA) • •nebo pyridin-2,6- dikarboxylová kyselina, jež nahrazuje vodu při udržování kvarterní struktury DNA •vnitřní (20%) a zevní kortex (80%) • •kortex zajišťuje nepropustnost, nebarvitelný •kortex - peptidoglykany - 20-30 % je shodných s peptidoglykany z bun. stěny •50-60 % představuje N-acetylmuramovou kys. modifikovanou na N-acetylmuramyl–laktam •18-20 % kyseliny N-acetylmuramové je spojeno s L-alaninem namísto tetrapeptidu • •exosporium - mají některé spory - uděluje buňkám rezistenci vůči chem. látkám, taxon. znak •často z proteinů bohatých na cystein (a podobných keratinu), zajišťují odolnost proti chemikáliím (exosporium Bacillus) Jedinečné a charakteristické struktury spory •Kalcium dipikolinát •Proteiny stabilizující DNA (SASPs) •Kortex •DNA reparační enzymy v procesu germinace •Proces sporulace •tvorba spory •je zkoumána nejčastěji u bacilů •začíná ve fázi G1 – zde je už jasné, jestli vznikne spora nebo vegetativní buňka •začíná přechodem od binárního k asymetrickému dělení •probíhá i při dostatku živin, hlavně však ve stacionární fázi •ke studiu sporulace je používáno bakteríí rodu Bacillus, hlavně B. subtillis Dvojité obalení spory CPL membránou! •7 fází sporulace B. subtillis (I –VII) • •lze charakterizovat morfologicky •i na molekulárně biologické úrovni •za proces vzniku endospory zodpovídá 7 – 8 genů • Fáze 0 Mateřská vegetativní buňka (sporangium) přechází v G1 od binárního k asymetrickému dělení v průběhu vzniku přepážky (na konci G1) je již jasné, zda vznikne vegetativní buňka nebo spora • Fáze 1 •replikace DNA •buňka začne přijímat polyfosfatová granula •dojde k tvorbě prepážky - dvojité vchlípení CM •můžeme rozlišit prosporogenní zónu (jiná hustota b.mat.) • •DNA není aktivní v této prosporogenní zóně •tvorba axiálních filament k rozdělení bakteriálního chromozomu •jeden z prvních signálů sporulace je •vznik kvanta volutinu •druhým signálem – zvýšení mn. enzymů Krebsova cyklu a hydroláz, spotřeba acetátu • Fáze II •ukončena replikace buněčného genetického materiálu • ten se rozestupuje k pólům buňky • končí invaginace CM •místě přepážky se dvojitě vchlípí CM Fáze III •proliferace CM kolem obou vydělených částí buňky • u spory dochází k zaobalení (prospora - barvitelná) •vznik intina a extina •dochází k zahušťování •není hotový kortex ani plášt • spora není světlolomná - nelze pozorovat ve fázovém kontrastu Fáze IV •tvoří se kortex •vzniká světlolomnost •spory s PG s jiným složením než PG buněčné stěny •ve spoře obsažena kys. dipikolinová (stabilizuje kvarterní strukturu DNA ve vazbách) •také velké množství Ca+ – aktivní transport - antiport •Fáze V •syntéza pláště, vícevrstevný •již minimum vody •u rodu Bacillus vzniká exosporium které se u druhu liší ve složení bílkovin •chemotaxonomie na základě unikátních bílkovin pláště Fáze VI •maturace endospory a lyze mateřské buňky •uvolnění zralých spór Fáze VII • volná zralá spóra •Germinace spory • •rychlý proces klíčení spory •spontánní aktivace spory při vyrovnání podmínek v prostředí •aktivace – působením teploty 70-85 °C po 5 – 10 min •další aktivátory: vitamíny, aminokyseliny (L-Ala, Ado a Ino) • •destabilizace pláště, rozklad extiny •ztráta rezistence, jako první je ovlivněna proteosyntéza až pro dostatku energie začne replikovat DNA... •lytický enzym (kortikohydroláza) – depolymerizuje kortex pro nástupný průnik vody •po 2h po germinaci spory - dělení vegetativní buňky •zdroj bílkovin, polysacharidů fosfolipidu je extina •inhibice klíčení: D-Ala, MgCl2, PMSF • • • • •Exospory = cysty •nejsou tolik rezistentní vůči teplu •rezistentní vůči vysychání •granula PHB – typická pro cysty •odlišné obaly – algináty, různé polysacharidy •nejpodrobněji popsány u Azotobacter vinelandii, mnohovrstevný obal (vnější části vyšší hustota), unikátní lipidy •za příznivých podmínek cysty klíčí a mění se ve vegetativní buňky Nepohyblivé stadium encystuje •intina - slouží jako zdroj sacharidů, lipidů •v intině cysty dostatek volutinu - porušení cysty - jádro si bere volutin – narůstá •dojde k prasknuti vnější vrstvy extiny a k uvolnění vegetativní buňky ....jakmile se veg. buňka dostane do prostředí - začne absorbovat kyslík a vylučovat CO2 … Růstový cyklus Azotobacter vinelandii V podmínkách vhodných pro vznik cysty se vegetativní buňka zakulacuje a odhazuje bičíky Buňka se stává světlolomnou, z vnější strany depozice lipidických látek Akumulace lipidů i uvnitř buňky Tvorba exospory Methylosinus trichosporium •2) Střídání extracelulárního, infekčního stádia, a intracelulárního, reprodukčního stádia Chlamydia trachomatis Bdellovibrio bacteriovorus (žluté buňky) •Bdellovibrio • •drobné aerobní G- bakterie 0,3-0,5 x 0,5-2,4 μm •všudypřítomné v moř., sladkovodní, odpad.vodě, půdě •obligátní (primárně) intracelulární parazité G- bakterií • • 2 stádia: • • A) nemnožící se - napadá G- buňky, je pohyblivé •pohybliví predátoři, polární •bičík, extracelulární •až 100 μm/s. = „útočná fáze“ • • •B) reprodukční • •nemnožící se stádium •nepohyblivé, žije v periplazmatickém prostoru hostitelské buňky. •„růstová fáze“ https://www.youtube.com/watch?v=YNxjWvTFzOc https://www.youtube.com/watch?v=b5GJ98S7Ewo https://www.youtube.com/watch?v=-uZjo0ohjFw •poprvé popsáno Bdellovibrio bacteriovorus (Stolp and Starr in 1963) •Bdellovibrio starrii a Bdellovibrio stolpii rod Bacteriovorax • •analyzován jeho neobvykle velký genom – 3,7 mil.bazí •schopno syntetizovat jen 11 AMK • •Popsány dva jejich viry: • Kentucky: sférický, 70nm, 1sDNA •Praha: 2sDNA, hlavička 40nm, bičík 200nm •Pohyblivá extracelulární forma • •protáhlý konec buňky slouží jako „příchytka“ •na protilehlém konci je umístěn polární bičík • obalený pochvou, která je tvořena vnější membránou, odlišnou od CM •kontakt s hostitelem – pravděpodobně není založen na chemotaxi – reverzibilní a irreverzibilní stádium •biosynteticky neaktivní – bez proteosyntézy •bdellovibrio začíná leptat stěnu kořisti •po kontaktu se aktivují pil geny pro syntézu fimbrií •Infekce hostitelské buňky • •kolize s hostitelem: 160 μm/s • •vhodný hostitel •penetrace vnější membránou – rotace 100ot/s •ztráta bičíku • •usídlení v periplazmatickém prostoru • mezi PG vrstvou a vnější membránou •přeměna ve vegetativní buňku, replikace DNA •přeměna hostitele ve sféroplast, hydrolytické enzymy • •elongace, vyrůstá septované vlákno •po vyčerpání živin fragmentace vlákna (ještě před lyzí) •fragmentací vznikají pohyblivé, infekční buňky •lyze hostitelské buňky • •přesné řízení buněčného cyklu, aby se v potřebném sledu aktivovaly četné geny pro degrad. enzmy •mohou se buňky replikovat bez parazitické fáze? •za určitých podmínek jsou bdelovibria schopna replikace bez hostitele, stačí extrakt z host.buněk • •životní cyklus: 1-3h •produkce až 15ti nových predátorů •Ekofyziologie bdellovibria • •výskyt – půda, odpad, voda •specifická metabolická přizpůsobení parazitickému životu – •reprodukční stadium metabolizuje vysokomolekulární •látky obsažené v hostitelské buňce •efektivita metabolismu až 65% materiálu hostitelské buňky •přemění na vlastní buněčný materiál •uvnitř hostitele je buňka rezistentní k záření, fágům a •environmentálním polutantům •některé kmeny tvoří tzv. bdelocysty = 3. klidové stadium, za vhodných podm. mění na infekční stadium •Další predátoři • •více než 12 podobných mikroorganismů •obligátní nebo příležitostní parazité •nitrobuněční nebo na povrchu buňky •myxokoky a lysobactery se kořisti zmocňují kolektivně, když dosáhnou potřebného quora •„strategie vlčí smečky“ (https://imgur.com/r/gifs/tbs7UgU) •mycovibria a vampirokoky zůstávají na povrchu •daptobactery pronikají přímo do cytoplazmy • • https://temata.rozhlas.cz/myxokoky-7852608 •Chlamydie •obligátní parazité buněk vyšších organismů •Chlamydia trachomatis - urogenitální sexuálně přenosné infekce, trachom, lymphogranuloma venereum, infekce novorozenců •Chlamydophila pneumoniae – pneumonie, záněty horních cest dýchacích, význam u kartitid •Chlamydophila psittaci – epizootické nákazy u zvířat, psitakóza u člověka •Parachlamydia acanthamoebae – parazit améb Chlamydia trachomatis Elementární tělíska útočící na spermii Courtney S. Hossenzadeh Chlamydia psittaci •Dvě fáze reprodukčního cyklu chlamydií • •dva typy tělísek u chlamydií: • • •1) elementární tělíska (EB) • klidová stádia, nemetabolizující, rezistentní a vysoce infekční •napadají buňky, významný podíl adheze na povrchu buněk •přizpůsobeny pro přežití ve vnějším prostředí • •3) retikulární tělíska (RB) •větší, neschopné žít mimo buňku (jen ve fagozomu) •reprodukční stádium •obsahuje ribozomy a využívá biosyntetický aparát hostitelské buňky •probíhá přepis DNA 4 elementární tělíska obklopená retikulárním, které je produkuje •EB •elementární tělíska •malá, 0,3mm • pevná BS – disulfidické můstky – proteiny bohaté na cystein •neprokázán peptidoglykan, nicméně geny pro jeho syntézu jsou přítomny •vliv betalaktamových ATB •kompaktní genom – histon-like proteiny •infekční - adheziny •RB •retikulární tělíska, 1μm •VM – pouze málo propojení, osmotická nestabilita •metabolicky aktivní, mnoho ribozomů •relaxovaná DNA – difúzní a vláknitá, mizí histon-like proteiny •objevuje se mRNA a velké množství ribozómů •Vstup do hostitelské buňky • •vazba na povrch buňky •endocytóza - tvorba endocytických vakuol •diferenciace v RB, binární dělení RB •endozom postrádá normální markery, proto není fusogenní (nefúzuje) •blokována maturace •blokován vznik fagolysozomu, tj. fagocytózy •přesun do perinukleárního prostoru endocytozou... •vznikne fagozom, ale nevznikne fagolysosom •… a vesele si tam žijí, dokud se z RB zase nestanou EB....J • Proces fagocytózy ukazující tvorbu fagolysozomů. Lysosom (zobrazený zeleně) fúzuje s fagozomem za vzniku fagolysozomu při fagocytóze. Fagolysozom - https://cs.qaz.wiki/wiki/Phagolysosome Životní cyklus chlamydií •1. elementární tělísko infikuje hostitelskou buňku • specifická interakce, fagocytóza, •fagozóm, narušení obrany • •2. elementární tělísko se mění v retikulární tělísko • inkluze •10 – 15h – syntéza ribozómů, •reorganizace DNA, vytvoření nové BS •dělení • •3. retikulární tělíska se dělí •až do úplného naplnění fagozómu • •4. retikulární tělíska se mění v elementární tělíska •lyze buňky •Změny provázející diferenciaci EB v RB • •změny buněčné stěny •relaxace DNA •ztráta denzity cytoplazmy 3hod 9h – RB Inkluze chlamydií 15h po infekci •mnoho retikulárních tělísek (R) •membrána endozomu (EM) •bublinky membrán (mb) •lipopolysacharid chlamydií exportovaný z R je důležitý pro některé imunologické testy –detekce antigenu 18-22 h po infekci retikulární tělíska se začínají diferencovat v elementární 30 h po infekci •chronické infekce - blokována diferenciace RB v EB – např. interferon gama •Biopesticidy • •Bacillus thuringiensis var. israelensis •protoxin se v těle změní toxin •toxin účinný az po pozření • • • •Bacillus thuringiensis •spory obsahují toxiny (δ-endotoxiny, tzv. Cry) •mají insekticidní účinky na některé skupiny hmyzu •a proto se užívají k produkci pesticidů a také GMO rostlin •spory a krystalinové proteiny této bakterie se užívají jako specifické insekticidy •aplikují se v tekutých postřicích na pole a považují se obecně za šetrné k ŽP •předpokládá se, že tento insekticid perforuje výstelku střev hmyzu a některé zprávy nalezly vztah mezi účinkem těchto látek a přítomností střevních bakterií v hmyzím těle •GMO plodiny s toxiny Bacillus thuringiensis jsou dnes poměrně široce využívané • • https://www.youtube.com/watch?v=nNWWIzBVqRA https://www.slideshare.net/Suvanthinis/2015-0325-agb-12022