Cytologie a morfologie bakterií I. Morfologie •Charakteristických shluků buněk •Buněčných útvarů (spory, • konidie, sporangia, pouzdra…) • • •Bakteriální kolonie • •Pozor na: •stáří kultury a •pleomorfní buňky •buňka char.shluk •sporangium •spory • •Většinou druhově charakteristické •= identifikační znak Arthrobacter kolonie sporangium spory Clostridium botulinum endospora •Tvary bakt. buňky •Koky - sférické, oploštělé, lancetovité •- diplokoky, streptokoky, tetrády, •sarciny, stafylokoky •Tyčinky – rovné, zakřivené, větvící se, •palisády pleomorfní •Kokobacily •Pupeny •Prostéky •Spirily •Hvězdice, Mycelia Velikost bakt b. v μm Chlamydia 0,3 x 0,3 Bdellovibrio 0,8 x 0,3 Rickettsia 1 x 0,3 S. aureus 0,8-1 x 0,8-1 E. coli 2-3 x 0,4-0,6 B. subtilis 1,8-4,8 x 0,9-1,1 Streptomyces vlákno x 0,7-1,6 Chromatium 25 x 10 Spirochety 500 Mycoplasma 0,1–0,3 μm •různé velikosti a tvary bakteriální buňky •velký poměr povrch/objem •velká plocha kontaktu buňky s prostředím Morfologie charakteristických shluků buněk •typické shluky napomáhají identifikaci •řetízky koků: Streptococcus •řetízky bacilů: Bacillus •palisády: Corynebacterium •tetrády koků: Micrococcus •balíčky = sarciny: Methanosarcina • •hrozníčky •Staphylococcus •Streptococcus Staphylococcus Micrococcus Methanosarcina Mikrokolonie E. coli vznikající ze tří mateřských buněk (na agaru) - charakteristický vzhled vznikajících útvarů dělících se buněk u růz. rodů…. Morfologie bakt. kolonií •potřeba zvážit typ media, ne kterém kolonie hodnotíme! •kultivace - zda vůbec kultivovatelné?? - sledování typu kolonií •stáří kultury • •Př: sledování morfologie kolonií •univerzální media, jiný vzhled na selektivním – zda vůbec růst či ne? barevná reakce? •S- (hladká) , R-(drsná) a M-(mazlavá) formy •sledování pohybu terasovité kolonie (Př: Proteus) Nocardia Proteus – pohyb buněk Bacillus mycoides Streptomyces Serratia marcescens Bakteriální kolonie na běžných mediích Bakteriální kolonie na diagnost. půdách Jeden druh bakterie a různá media…(E. coli) Kontaminace na misce! J Morfologie pleomorfních buněk •Další potíž: •Jsou barvitelné Gramem? •Haemophilus – ano •NE mykobakteria (obs. mykolové kyseliny) •NE mykoplazmata (bez bun.stěny) Pleomorfní buňky rodu Corynebacterium Acidorezistentní buňky: •odmítají Gramovo barvení •odmítají se po nabarvení odbarvit ethanolem i kyselinou Př: Nocardia… Mycobacterium avium-intracellulare Acidorezistentní barvení buněk histologického řezu lymfatické uzliny Živý (nativní) preparát bez fixace– vidíme nedeformovaný tvar buňky, spory, morfologii seskupení buněk, pohyb buněk Cíl mikroskopie? Typ preparátu Typ mikroskopie (typ b. stěny, průkaz struktur, růstového cyklu) Je neznámý vzorek barvitelný Gramem? Není gramlabilní? Fáze tyčka – kok? Fluorescenční mikroskopie D:\Users\Uživatel\Desktop\IVA\FOTO\kult kal L-D\live dead kult kal\LD1green.tif D:\Users\Uživatel\Desktop\IVA\FOTO\kult kal L-D\live dead kult kal\mikroZOO výběr\methanosarcina barkeri.jpg D:\Users\Uživatel\Desktop\IVA\FOTO\PropagačníMikra\Cylindrocarpon (3).jpg Volba správného typu mikroskopie pro pozorování cytologických a morfologických znaků • Anthony van Leeuwenhoek, 17. st První nákresy bakterií (z ústní dutiny člověka) Světelný mikroskop (1000x) vs. Elektronový (100 000x) Světelný mikroskop - Fázový kontrast Světelný mikroskop - Jasné pole •Popularita SEM pramení z možnosti získat obrázky povrchů širokého spektra objektů • Rastrovací elektronová mikroskopie (skenovací, řádkovací, Scanning Electron Microscope - SEM SEM Skenovací tunelová elektronová mikroskopie (scanning tuneling electron microscopy, STM) •využívá k zobrazování pohyblivého svazku elektronů •převážně k topografické analýze různých materiálů – 3D Transmisní elektronový mikroskop (TEM) •umožňuje pozorovat detaily buňky a virových částic • •ke kontrastnímu znázornění zvýraznění struktur se používá negativní barvení • • soli těžkých kovů, které nepropuštějí elektrony • • např. uranyl acetát, molybdenan amonný PREPARÁT pro světelnou mikroskopii •co chceme vidět? podle toho příprava preparátu • tvar buňky a struktur – fázový kontrast, barvený fixovaný prep. pohyb buňky – fázový kontrast, fluorescence barvené struktury – pomáhají identifikaci (PHB, síra..) typ buněčné stěny – Gramovo a acidorezistentní b. Cytologie a morfologie buňky nativní preparát barvení buněk a spor za horka Gramovo barvení •Př: tyčky bacilů U jednoho bakteriálního rodu různý vzhled char. tvaru buňky! Bacillus anthracis Bacillus cereus Bacillus subtilis Bacillus mycoides Pseudomonas aeruginosa Haemophilus influenzae H. ducrei P. fluorescens •velmi málo vnitřních struktur •většina dějů na CM membráně •obvykle samostatné buňky Bakteriální prokaryotická buňka - stuktura Zvláštnosti prokaryotické buňky •živý, otevřený systém schopný regulace a autoreprodukce • •jádro neodděleno od CPL membránou •větš. kruhová (i lineární) DNA, bez intronů •haploidní buňky (1 alela) • •bez buněčných organel, jediná membrána je cytoplasmatická •ribosomy se liší od ribosomů eukaryotních buněk – menší, volně v CPL •16S rRNA (malá podjednotka), 5S rRNA a 23S rRNA (velká p.) •translace začíná N-formylmethioninem • •specifické struktury a vlastnosti bakt. buňky: •peptidoglykan (až na mykoplasmata) •steroly v membránách zcela výjimečně •bičík – globul. bílk. flagelin, pohyb rotací bakter. ribozom E.coli S. aureus Buněčná stěna •tvořena peptidoglykanem (bakterie) G- meso-diaminopimelová kys. G+ L-lysin Stěna spory: jiné a unikátní složení peptidoglykanu! Cytoplazmatická membrána •semipermeabilní obal ohraničující vnitřek buňky od vnějšího prostředí • kontrolující pohyb látek do buňky a ven z buňky •selektivně permeabilní pro ionty a organické molekuly •chrání buňku před vnějšími vlivy •z lipidové dvouvrstvy s vmezeřenými molekulami bílkovin •buněčná adheze, výměna iontů a buněčná signalizace •cílová struktura pro několik extrabuněčných struktur (buněčné stěny, glykokalyxu a vnitřního buněčného cytoskeletu) •„model tekuté mozaiky“ tvořený tekutou fází lipidů je prostoupen globulárními •proteiny, které jsou jednak periferní (umístěné na povrchu membrány) •tak i tzv. integrální, prostupující celou membránu Bičík Rozdíl mezi G+ a G Uspořádání bičíku: taxonomický znak •Organizovaná •Difúze či řízené mechanizmy Cytoplazma Weng and Xiao; 2014 Bakteriální cytoskelet •Bakteriální buňka obsahuje řadu vláknitých proteinů nutných pro: • regulaci tvaru buňky • buněčné dělení •segregaci chromozomů • rozdělování plazmidů • buněčné polaritě • •jsou analogické všem třem cytoskeletárním • strukturám eukaryotní buňky • •3D strukturou a biochemickými vlastnostmi Bakteriální buňka je polarizovaná Shapiro; 2002 •Archea –jen extrémní podmínky? •Již neplatí….. • •pseudopeptidoglykan •cytoplasm. membrána – 1 vrstevná • •strukturní shody, ale rozdílné chemické složení •rozdílná citlivost na ATB •tRNA archeí podobná eukaryotické • Bacteria vs. Archaea Morning Glory, Yellowstone Cytoplazmatická membrána archeí •Sulfolipidy, glykolipidy, nepolární isoprenoidní lipidy, fosfolipidy, větvené lipidy, mnoho proteinů v membráně • •FOSFOLIPID: •(1) chiralita glycerolu (L-glycerol; dáno enzymy) •(2) etherové vazby - glyceroldiether, tetraether •= jiné chem.vlastnosti fosfolipidů •(3) řetízky isoprenoidů namísto MK •(4) větvení isoprenoidu • •Nepřítomnost sterolů •Často jednovrstevná •glycerolové jednotky na obou koncích MK •tvoří 1vrstvu • •Lepší přizpůsobení extrémům •monolayer rezistentnější k narušení teplem Buněčná stadia •Cytologické a morfologické proměny •Struktury a jejich konformace závisí....... • dělení buňky •vstup parazitické, patogenní fáze do buňky •(př: remodelace proteinů listerií) • •Od jakých procesů se odvíjí cytologie a morfologie bakteriálních buněk? • •Prosté binární dělení anebo přítomnost růstových cyklů? • Binární dělení bakteriálních buněk •Funkce bakteriálního cytoskeletu •(přepážka, pohyb struktur) •Ori C •Zdvojení genetické informace Posuzujeme-li vzhled buňky kmene určitého bakteriálního druhu, je třeba si uvědomit: 1)Prochází sledovaný druh růstovým cyklem? 2) •v každém z nich má pak buňka jinou cytologii a morfologii •Př: Chlamydia, Bdellovibrio, Streptomyces, Caulobacter,myxobakterie…. •mění se nejen vzhled buňky •ale buňka v cyklech prochází typickou změnou vnitřních struktur •tzv. buněčný cyklus Jiné životní cykly než binární dělení Střídání přisedlého a volného stadia Caulobacter Sphaerotilus Jiné životní cykly než binární dělení Střídání infekčního a reprodukčního stadia Chlamydie Elementární tělísko je metabolicky inaktivní, není schopno se dělit. Retikulární tělísko je metabolicky aktivní se schopností se dělit. Do buňky hostitele vniká infekční elementární tělísko procesem, který se podobá endocytóze. Bdelllovibrio Myxobakterie Baccilus „Voják umírající na tetanus“ Sir Charles Bell, lukovité prohnutí zad (opistotonus) křečovitý výraz •2) Vytváří posuzovaný druh endospory? • v preparátu pak mohou měnit tvar buněk! Clostridium difficile Bacillus anthracis •3) Stárnutím mění buňky tvar • •4) Závislost tvaru buňky na vnějším prostředí •- živiny, tlak, osmolarita 5) Pleomorfní buňky •př. rody Mycobacterium, Corynebacterium, Haemophillus, Mycoplasma •Sylabus cvičení jaro 2020 • •samostudium! • •testy - odpovědníky • • •bloková výuka na konci semestru: • •Gramovo barvení, negativní barvení, nativní •preparát •struktury buňky •pohyb buněk •acidorezistentní barvení •zaočkování sklíčkových kultur; flourescence •pozorování sklíčkových kultur