CYTOLOGIE A MORFOLOGIE PROKARYOT 5 Struktury vybraných bakteriálních toxinů Toxiny •zodpovědné za toxicitu a invazivitu •enzymy - peptidy způsobující póry v membráně •nebo převážně proteiny (exotoxiny) •superantigeny •toxiny jsou také virulentní faktory https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fmicb.2016.00042/full •Toxin je složen ze dvou domén • •A a B doména •A….. katalytická fce (modifikace proteinů hostitele) •např: glykosylace, proteolýza, nekovalentní modifikace • •B….. vazebná doména •když domény oddělíme, samotná A doména je toxická, ale nedostane se do buňky • •B doména je schopná se do buňky dostat, ale není nijak toxická • •existuje zde také translokační doména - inzerce toxinu pomoci endozomu • (= toxin díky tomu lépe proniká do cytoplasmy) A B •Vstup toxinů do cílové buňky • •Dva mechanizmy vstupu přes membránu: • •1) přímý vstup po vazbě B jednotky na receptor a vytvoření póru v • membráně pro transport A podjednotky do CPL • •2) vazba A+B komplexu na receptor, ten zprostředkuje endocytózu •uvnitř endozomu přibývá H+ iontů a okyseluje se, to vede k oddělení jednotek •B podjednotka následně napomáhá průniku A jednotky • •některé toxiny vstupují oběma cestami •podobná enzymatická fce nemusí znamenat stejnou cestu vstupu •př. anthrax a adenylát cykláza Bordetella pertusis - obojí katalyzují produkci • cAMP z rezerv ATP, ale anthrax vstupuje receptorem Cyklický adenosinmonofosfát (cAMP, cyklický AMP) je derivátem adenosintrifosfátu (ATP) a většina prokaryotických i eukaryotických buněk ho využívá jako vnitrobuněčného druhého posla v řadě signálních drah. Působí tak obvykle jako aktivátor proteinkináz. •Póry formující toxiny •nejpočetnější skupina toxinů • způsobují póry u rostlin, živočichů •tím dojde k narušení membrány • •pór je tvořen podjednotkami přisedajícími na membránu •tak vznikne komplex , dojde ke změně konformace proteinu a vznikne pór • •dominují dvě podskupiny proteinové konformace- alfa a beta (alfa helix, beta list) Póry formující toxiny UTI - urinary tract infections Superantigeny •další skupina toxinů •vyvolávají velkou systémovou odezvu, protože se váží na molekuly MHC druhé třídy •modifikují pomocné T-lymfocyty •to způsobí imunitní odpověď •např. syndrom toxického šoku je způsobé superantigenem • •TSS - syndrom toxického šoku •reakce těla na toxiny uvolňované bakteriemi Staphylococcus •může způsobit nutné amputace i smrt způsobenou hypovolemickým šokem •tj. náhlá porucha průtoku krve orgány a tkání •přestanou fungovat srdce a plíce •je rel. vzácný ale častou příčinou je nevhodné používání menstruačních tampónů •příznaky - vysoká horečka se zvracením • Hlavní histokompatibilní komplex (MHC) je označení pro několik typů glykoproteinových komplexů nacházejících se na vnějších stranách cytoplazmatické membrány buněk obratlovců. Mají významnou funkci v imunitním systému, konkrétně se podílejí na rozeznávání cizorodých struktur (například virových bílkovin, jež značí infekci). MHC totiž slouží jako jakési „podstavce“, na něž se upevňují náhodně vybrané peptidy pocházející zevnitř buňky a vystavují se ke kontrole buňkám imunitního systému. •Superantigen - mechanismus •superantigen je virový nebo bakteriální protein, který se váže současně na Vβ doménu T-buněčného receptoru a na řetězec α molekuly MHC II •tj. makrofág a na T-buněčný receptor T-lymfocytů •T-lymfocyty schopné účinně regulovat imunitní systém tím, že vylučují do krve cytokiny •když se v krvi objeví superantigeny, dochází k aktivaci 2–20 % všech T-lymfocytů •superantigen vede k masivnímu uvolnění cytokininů a chemokininů •superantigeny jsou rezistentní k proteázám a denaturaci teplem •jejich proliferace a diferenciace pak vede produkci zvýšeného množství prozánětlivých faktorů (TNF-α, IL-2, IFN-γ) a TSS •streptokoky a stafylokoky • Bakteriální exotoxiny •exotoxiny jsou vysoce toxické, působí v místě vzdáleném od místa vstupu •nezvyšují teplotu •vylučovány živými buňkami v exp. fázi •produkovány G+ i G- bakteriemi •proteiny, málo polypeptidy (př: enzymy) •vážou se obvykle na specifické receptory – GP, sialoglykosidy (G proteiny) •kódovány geny plazmidů •termolabilní; inaktivovány při 60 °C •produkovány: V. cholerae, enterotoxigenní E. coli (ETEC), některé kmeny S. aureus •Bakteriální exotoxiny a makroorganizmus • •vysoce toxické, pro zvířata letální i v malých dávkách •vysoce antigenní, stimulují vznik antitoxinu •spojené s průjmovými onemocněními a otravami z potravin •to je způsobené tím, že chlor jde z buňky ven, ale sodík nejde dovnitř •tím dochází k poškození epitelu ve střevě = průjem •většinou exotoxin působí v místě vzdáleném od vstupu •tj. je invazivní - botulin, tetanospazmin • •specificky toxické – botulin, tetanospazmin – neurony • •nespecificky toxické - pro celou řadu cílových buněk, způsobují nekrózu • (kolagenáza, hyaluronidáza, streptokináza, fosfolipáza, lecitináza, hemolyziny, leukocidiny) •neindukují horečnaté stavy; zvyšují hladinu nitrobuněčného cAMP • (choleratoxin stimulující kinázu A) •inhibují syntézu proteinů (difterický toxin - záškrt) • mají afinitu k nervovým vláknům • Bakteriální exotoxiny jako vakcíny •exotoxin lze konvertovat na toxoid –tj. modifikované toxiny •toxicita byla snížena nebo odstraněna, imunogenicita zachována •po konverzy na toxoidy jsou využity jako agens pro imunizaci - vakcíny •tj. můžou imunizovat organismus •endotoxiny nelze takto použít!!! • •nejsou toxické, pouze antigenní, použití ve vakcínách (př: difterický toxoid, tetanový o.) •konverze exotoxinů do toxoidů probíhá např. působením teploty nebo chemicky formalin,iodin, kys.askorbová, pepsin, keton (směs: 37 °C, v rozmezí pH 6 – 9; několik dnů) Letalita bakteriálních exotoxinů Toxiny z Clostridií •Clostridium tetani, Clostridium botulinum • toxiny rozkládají SNARE proteiny - umožňují část tzv. vezikulárního transportu uvnitř buňky - splývání membránových váčků v buňkách •tím blokují přenos signálu na nervových synapsích •SNARE proteiny se specializují na konkrétní membránové organely •obvykle transmembránové proteiny a obsahují sadu alfa-helixů •SNARE proteiny se na sebe vážou, přičemž helikální doména jednoho proteinu se omotá kolem helixu druhého - tzv. trans-SNARE komplex Autor: Danko Dimchev Georgiev, M.D. – http://en.wikipedia.org/wiki/Image:Exocytosis-machinery.jpg, CC BY-SA 3.0, https://commons.wikimedia.org/w/index.php?curid=3735566 •Clostridium perfringens - poškození epiteliální buněčné vrstvy •Clostridium septicum - srdce vstup Ca do bunek --> poškození buněk (pokud se tento toxin dostane do jater = smrt působí toxicky na srdce, pokud se dostane do krve... způsobuje ale taky nekrózu jiných svalů Bakteriální endotoxiny •endotoxiny –jsou součástí buněčné stěny G- bakterií •tvořeny lipopolysacharidem •nelze je konvertovat na toxoid (NE vakcíny) • •uvolnitelné lyzí buňky •nemají specifický receptor •mírně toxické - ve větších dávkách letální pro zvířata •termostabilní- toxicita zachována často i při vícehodinovém působení 60 °C •slabě antigenní •syntéza řízena geny nukleoidu https://abbiosciences.com/blogs/science-blog/regarding-endotoxin •Bakteriální endotoxiny a makroorganismus • •účinky endotoxinů – shodují se u většiny G- bakterií •jsou pyrogenní - vyvolávají horečku •stimuluje odpověď imunitního systému – aktivace makrofágů, neutrofilů, lymfocytů B •vznik lokální zánětlivé reakce •při vyšších koncentracích může dojít ke vzniku endotoxického šoku • • • horečka – působí na makrofágy, uvolňuje se IL-1, působí na centrum termoregulace •leukopenie – může být následována leukocytózou •hypoglykémie – LPS způsobuje glykolýzu v buňkách různého typu •septický šok – při bakteriémii •koagulační kaskády, která vede ke konverzi fibrinogenu na fibrin (srážení krve) • endotoxin způsobí adhezi destiček na endotelium cév • aktivuje přeměnu plazminogenu na plazmin (rozpouštění fibrinových vláken krevní sraženiny) •vznik diseminované intravaskulární koagulace (DIC) - vede k zvýšení krvácivosti •může způsobit smrt (septický šok) •Enterotoxigenní E. coli •dvě skupiny - LT1 a LT2, obě maji podjednotku A • a)Tepelně labilní enterotoxin •dvě skupiny (LT-I, LT-II) •jedna podjednotka A, pět podjednotek B • •b) Tepelně stabilní enterotoxin • malé monomery s mnoha cysteinovými zbytky • pospojovaných disulfidickými můstky (stabilita) • dvě skupiny STa a STb působi na cyklický guanosin-monofosfát •inhibuje adsorpci Na - výsledek je průjem •STb taky poskozuje klky a vyvolává atrofii • • •Enterohemoragická/Shigatoxigenní E. coli • •způsobuje shigatoxin 1, shigatoxin 2 •Enterobacteriaceae, zejména původce úplavice (Shigella dysenteriae) a některými kmeny Escherichia coli •toxin blokuje tvorbu bílkovin v střevních epiteliálních buňkách tím, že poškozuje 23S rRNA nutnou pro správné fungování ribozomu •hemoragická kolitida- krev ve stolici, silna bolest břicha, zvraceni, horecky • •hemolyticko-uremický syndrom •krvavý průjem, neuropatie (poškození nervové soustavy), selhání ledvin, trombocytopemie (pokles destiček) • •trombotická trombocytopenická purpura •shigaroxin --> do buněk endocytózou, přes GA jde az do ER • •toxin cestuje přes Golgiho aparát a end.retikulum •receptorem toxinu je GM1 receptor •Enteroagregativní E. coli • •tepelně stabilní enterotoxin EAST1 a Pet toxin •nutí buňky střevniho epitelu vytvářet biofilm •produkuje dva toxiny • Pet (působi na fodrin-protein potřebný k napojení aktinového vlákna na CM) • a EAST1 fce neni uplne jasná, ze dochází k průjmům :) • •Toxiny u Staphylococcus aureus • •a) Superantigeny – toxin syndromu toxického šoku (TSST-1) a stafylokokové enterotoxiny (SE) • •Diagnostická kritéria syndromu toxického šoku: • vysoká teplota (nad 38,9 oC) •vyrážka •pokles krevního tlaku •1-2 týdny po počátku onemocnění olupování pokožky na dlaních a ploskách •zvracení •průjem •bolest svalů •kombinace těchto příznaků mohou znesnadňovat určení správné diagnózy! •b) toxiny tvořící póry v buněčné stěně – dvě podskupiny: •leukotoxiny a α-hemolyzin •α-hemolyzin • produkované téměř všemi kmeny S.aurea •působí na fibroblasty, epitel, redukuje srážlivost krve •existuje taky Gama hemolysin - pusobí na neutrofily, makrofágy a č.krvinky • •c) toxiny vyznačující se proteolytickou aktivitou – exfoliativní •toxiny a toxiny způsobující epidermolytické infekce • α-hemolyzin Cyanotoxiny •Cyanotoxin je toxin produkovaný sinicemi •mohou působit problémy zejména při přemnožení sinic („vodní květ“) •vodní květ je často způseben eutrofizací vody (obohacení živinami – např. splach z polí) • •účinky mohou být akutní nebo chronické •záleží na síle a koncentraci toxinu...a taky na době vystavení tomuto toxinu •toxiny sinic často vyvolávají alergické reakce • • •Proč sinice toxiny produkují? •nejasná odpověď, několik možností… • •strukturní či metabolická funkce - tzn. že představují zásobní látky, chelatace železa •mohou představovat signální molekuly ke komunikaci •potlačení růstu konkurenčních fotoautotrofních organismů - alelopatie (cyanobakteriny či nostocyklamid) •alelopatické účinky na lidi mají pravděpodobně mikrocystiny – neg. účinek hlavně na vyš. rostliny •řada případů otrav dobytka a zvěře sinicemi Aphanizomenon flos-aquae, Anabaena flos-aquae a Microcystis aeruginosa •v Evropě často působí problémy sinice Microcystis a Planktothrix •zaznamenána i lidská úmrtí přičítaná cyanotoxinům •teorie o vymření několika velkých savců v pleistocénu - na základě chemických rozborů fosílií přičítáno rovněž cyanotoxinům • •Rozdělení cyanotoxinů: • •1.) podle chemické struktury se rozlišují cyanotoxiny na bázi alkaloidů, cyklické a lineární peptidy a lipopolysacharidy • •2.) podle biologické aktivity •hepatotoxiny (toxické pro činnost jater), •neurotoxiny (toxický účinek na nervový systém), •imunotoxiny (negativně ovlivňují imunitní systém), •imunomodulanty (alergenní vliv, podnícení závažnějších autoimunitních chorob, a podobně), •mutageny a genotoxiny (způsobují mutace DNA, často schopné vyvolat rakovinu), •embryotoxiny (toxické pro embryo), •cytotoxiny (toxické pro buňky bakterií, řas či např. lidské buňky) • • •nodularin, mikrocistin = hepatotoxiny (poškozují játra teplokrevných živocichů-strukturu i fci) • •anatoxiny = neurotoxiny (neurotoxické efekty, narušení signalizace mezi neurony a svalstvem-pozor - i u dýchacích svalů - udušení) • •dermatotoxiny (zpusobuji vyrážky) • • DĚKUJI ZA POZORNOST