Karel Souček E-mail: ksoucek@ibp.cz, tel.: 541 517 166 INVAZIVITA A METASTÁZOVÁNÍ * Proč je autokrinní signalizace destabilizující faktor pro normální tkáně? • * Jaké mechanismy mohou buňky uplatňovat pro snížení citlivosti k působení růstových faktorů? • * Jaké molekulární mechanismy mohou vést ke konverzi protoonkogenu na onkogen? Otázky * podpůrné proliferační signály * deregulace supresorů růstu/proliferace * odolnost k buněčné smrti * neomezená replikace * neoangiogeneze * invaze a metastázování * mutace a genomická nestabilita * zánět * přestavba energetického metabolismu * únik před zničením imunitním systémem • Typické znaky nádorové buňky Výsledek obrázku pro hallmarks of cancer Douglas Hanahan & Robert A. Weinberg: Hallmarks of Cancer: Next Generation, Cell, 2011 Screen Shot 2018-02-13 at 11.11.28 AM.png Proč je rakovina tak devastující? Screen Shot 2018-02-13 at 11.11.48 AM.png cancer death portion per cancer type cancer-related death cause estimate Advocates for Breast Cancer: How is Metastatic Breast Cancer Diagnosed? Proč je rakovina tak devastující? https://www.svod.cz/graph/?sessid=o61edps4el1idtk6e5bst0cft0&typ=incmor&diag=C61&pohl=m&kraj=&vek_o d=1&vek_do=18&zobrazeni=graph&incidence=1&mortalita=1&mi=0&vypocet=w&obdobi_od=1977&obdobi_do=2017& stadium=&t=&n=&m=0&pt=&pn=&pm=&t=&n=&zije=&umrti=&lecba=# https://www.svod.cz/graph/?sessid=o61edps4el1idtk6e5bst0cft0&typ=incmor&diag=C61&pohl=m&kraj=&vek_o d=1&vek_do=18&zobrazeni=graph&incidence=1&mortalita=1&mi=0&vypocet=w&obdobi_od=1977&obdobi_do=2017& stadium=&t=&n=&m=1&pt=&pn=&pm=&t=&n=&zije=&umrti=&lecba=# https://www.svod.cz/graph/?sessid=o61edps4el1idtk6e5bst0cft0&typ=incmor&diag=C50,D05&pohl=z&kraj=&v ek_od=1&vek_do=18&zobrazeni=graph&incidence=1&mortalita=1&mi=0&vypocet=w&obdobi_od=1977&obdobi_do=2 017&stadium=&t=&n=&m=1&pt=&pn=&pm=&t=&n=&zije=&umrti=&lecba=## https://www.svod.cz/graph/?sessid=o61edps4el1idtk6e5bst0cft0&typ=incmor&diag=C50,D05&pohl=z&kraj=&v ek_od=1&vek_do=18&zobrazeni=graph&incidence=1&mortalita=1&mi=0&vypocet=w&obdobi_od=1977&obdobi_do=2 017&stadium=&t=&n=&m=0&pt=&pn=&pm=&t=&n=&zije=&umrti=&lecba=# Nádory prostaty Nádory prsu Transforming growth factor - b (TGF- b) TGF-b rodina ~ TGF- bs, activins, bone morphogenic proteins (BMP) TGF-b1 • pleiotropní cytokin • negativní regulátor Epstein, F.H., N Engl J Med 2000; 342:1350-1358, 2000 Biologické funkce TGF-b * Hraje klíčovou úlohu během embryogeneze; * reguluje proliferaci, diferenciaci, buněčnou smrt, motilitu, adhezi (v závislosti na buněčném typu) = ovlivňuje homeostázu; * reguluje expresi extracelulární matrix; –indukuje fibrilární kolagen a fibronectin; –inhibuje degradaci ECM (inhibicí MMPs a indukci TIMPs). Role TGF-b v rozvoji patologických stavů * Fibróza –deregulace exprese ECM prostřednictvím indukce proliferace fibroblastů a jejich myofibroblastového fenotypu. * Nádorová onemocnění –ztráta citlivosti epiteliálních buněk k inhibičnímu působeni TGF-b; –indukce angiogeneze. – [USEMAP] [USEMAP] Role TGF-b v carcinogenezi NEJM 342, 18 (2000) 1350-1358 Role TGF-b v carcinogenezi SMAD3 TGFR2 Prostate – normal vs. cancer normal, hyperplasia vs. cancer Role TGF-b v carcinogenezi NEJM 342, 18 (2000) 1350-1358 > Role TGF-b v carcinogenezi TRENDS in Cell Biology Vol.11 No.11 2001 figure 14-03 Figure 14.3 The Biology of Cancer (© Garland Science 2007) figure 14-04 Figure 14.4 The Biology of Cancer (© Garland Science 2007) Lokální invaze a intravazace * Invaze do cév, závislá na degradaci ECM * Závislá na proteázové aktivitě * Nádorové buňky mohou produkovat své vlastní proteázy (MMP-2, -9) nebo kooptují stromální buňky a využívají jejich aktivity figure_14_06a figure_14_06b figure_14_06c figure_14_06d Macrophages, cathepsin Immature myeloid cells Tumor cells, fibroblasts figure_14_36 Pohyb buněk figure_14_37c figure_14_39 Pohyb buněk figure_14_40 figure_14_08 Transport, cirkulace figure_14_45 Francia et al., Nat. Rev. Cancer (2011) Metastatická kaskáda Cirkulující nádorové buňky (CNB) – klíčová úloha Proč se cirkulujícími nádorovými buňkami zabývat? Ø 90% úmrtí spojených se solidními nádory – metastáze Ø Šíření primárně krví Ø Klinicky významné Ø „Liquid biopsy“ Ø Průběh terapie Ø Prognostický znak Ø Specifické mutace à cíle terapie • • – Ø Ø Schilling, et al., Nat. Rev. Urol. (2012) Vlastnosti cirkulujících nádorových buněk Ø Překonání anoikis Ø Změna fenotypu Ø Ø1g (109 buněk) tumor – uvolnění 106 buněk/24 h Ø 1 CNB na 100 mil krevních buněk Ø Poločas života: 1 – 2 hod Ø Ø Velikost a deformovatelnost Ø Exprese povrchových znaků Ø Možnosti detekce • Ø Ø Hayes et al., Science (2010) Detekce nádorových cirkulujících buněk Vojtěch Dvořák, BP, MU, 2016 Detekce nádorových cirkulujících buněk Příklad: Filtrace Ø Výhody – nezávislost na povrchových znacích Ø Heterogenní populace Ø Není nutná aktivace receptorů Ø Nativní stav Ø Ø ØNevýhody Ø Možný překryv s leukocyty Ø Nutné využít dalších znaků (CD45) Ø Různá velikost CNB? Ø Ø CNB: epiteliální původ à větší velikost Ø Platformy: MetaCell, CellSieve, Celsee,… Ø Ø Ø Ø C:\Zuzka P 12-02-2015\moje data BFU\circulating tumor cells\MetaCell\Mouse 4T1 MetaCell test 30-10-2015\metacell\SAM_1878small.jpg C:\Zuzka P 12-02-2015\moje data BFU\circulating tumor cells\MetaCell\Mouse 4T1 MetaCell test 30-10-2015\SAM_1880small.jpg Øpolycarbonate membrane with 8 mm pores (CTCs over 20 mm) Øcapilary force-driven filtration Příklad: Filtrace Příklad: mikrofluidní separace Příklad: mikrofluidní separace Příklad: mikrofluidní separace Lund Příklad: mikrofluidní separace Figure 1 Izolace CTC pomocí deplece CD45+ buněk krve RosetteSep™ Immunodensity Cell Isolation and Cell Separation Label for RosetteSep™ Human CD45 Depletion Cocktail Klinické využití detekce cirkulujících nádorových buněk Ø Odhad prognózy pacienta Ø Monitoring průběhu onemocnění Ø Včasná detekce • Ø Metastázující karcinomy prsu a prostaty – hranice 5 CNB/7,5ml Ø Metastázující karcinom tlustého střeva – hranice 3 CNB/7,5 ml Ø CellSearch system Veridex – schváleno FDA Ø www.cellsearchctc.com Množství cirkulujících nádorových buněk korelují s prognózou Molekulární charakterizace CNB à cílená terapie Ø Biopsie – identifikace mutací – zacílení terapie Ø Uvolňovány i z metastáz à komplexita Ø Vývoj onemocnění à chemorezistence, identifikace nových cílů Ø Využití v budoucnu? Ø Ø Ø Krebs et al., Nat. Rev. Clin. Onc., (2014) Cirkulující nádorové buňky – prekurzor metastáz Ø Množství CNB nekoreluje s množstvím metastáz Ø Rozsev nádorových buněk může probíhat v časných stádiích (b) Ø K vytvoření metastáz nutná další stimulace – mikroprostředí, mutageneze Ø Relaps: metastáze původem z rozesetých buněk (a) Ø „Tumor self-seeding“ Ø Oblast intenzivního výzkumu • – Ø Ø Naxerova et al., Nat. Rev. Clin. Onc. (2014) Plasticita cirkulujících nádorových buněk Ø Tvorbu metastáz ovlivňuje řada faktorů – mj. plasticita CNB Ø Ø Epiteliálně-mezenchymální přechod Ø Podíl na vzniku CNB Ø Vyšší motilita a invazivita Ø Vznik chemorezistence Ø Detailní mechanismy stále předmětem výzkumu Ø Význam popsán u řady karcinomů (prsu, prostaty, plic, tlustého střeva, vaječníků, atd.) Ø Ø Tsai et al., Cancer Cell, (2012) - upraveno Epiteliálně-mezenchymální přechod Yu et al., Science, (2014) Ø U CNB popsán epiteliální i mezenchymální fenotyp Ø M+ buňky – spojeny s progresí onemocnění Ø Dynamické změny Ø Cirkulující nádorové buňky: shrnutí •Nádorové buňky uvolněné do cirkulace Ø Klíčová úloha ve vzniku metastáz Ø Heterogenita a plasticity Ø Detekce Ø Oblast intenzivního výzkumu Ø Klinicky významné Ø Počet koreluje s prognózou Ø Molekulární charakterizace – personalizace medicíny Ø Ø V. Dvořák, 2016 Extravazace * Penetrace buněk do okolní tkáně * Interakce nádorové buňky se stěnou cévy * Možnost proliferace uvnitř lumen cévy figure_14_09d Kolonizace * Velice nízká účinnost * Dormantní mikrometastázy * Metastatický relaps figure_14_10d figure_14_11c CK+ buňky v kostní dřeni Epithelial-Mesenchymal Transition (EMT) * Změna buněčného fenotypu spojená se ztrátou adheze a zvýšením motility table_14_01 EMT & nádory figure_14_18b figure_14_18a Znaky a regulátory EMT nrc2620-f1 Kornelia Polyak & Robert A. Weinberg Nature Reviews Cancer 9, 265-273 (April 2009) Transforming growth factor-b (TGF-b) Massagué J, Gomis RR. FEBS Lett. 2006 May 22;580(12):2811-20. Jian Xu, Samy Lamouille, Rik Derynck Cell Research (2009) 19:156-172. Klíčové objevy v EMT a rakovině * EMT creates cells with cancer stem cell characteristics Mani SA, et al., Cell. 2008 May 16;133(4):704-15. * Cross-regulation between ZEB1/2 and miR-200 family Gregory PA, et al., Nat Cell Biol. 2008 May;10(5):593-601. * Cross-regulation between Twist and Slug onc2009406f1 H Zhang, Y Li and M Lai Oncogene 29, 937-948 (18 February 2010) Esmeralda Casas, Jihoon Kim, Andrés Bendesky, et al. Cancer Res; 71(1) January 1, 2011 fig1 Prachi Jain, Suresh K. Alahari Frontiers in Bioscience 16, 1824-1832, January 1, 2011 Experimentální přístupy BPH par ctrl Benign (BPH-1) EMT TGF-b Cancer associated fibroblast - tumor derived (CAFTD) EMT TGF-b EMT • EMT markers • EMT regulators • Cell shape and behavior Analýza migračního potenciálu Floating cell Protect ring Attached cell Matrix Electrodes Invading cell figure_14_41c Diseminace solidních nádorů figure 14-42 Figure 14.42 The Biology of Cancer (© Garland Science 2007) Metastatický tropismus * Thirty-three cells from a large population of human MDA-MB-231 cells were each expanded into a clonal population in culture. The mRNA expression pattern of each subclone was analyzed (columns, arrayed left to right) using probes for the mRNAs of five genes—IL11 (interleukin-11), OPN (osteopontin), CTGF (connective tissue growth factor), CXCR4 (chemokine receptor 4), and MMP1 (matrix metalloproteinase-1)—and, as loading control, a probe for GAPDH (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) mRNA. In addition, the expression patterns of the original tumor cell population (ATCC, left column) and a subcloned cancer cell population termed 2287 (which was selected for its ability to generate osteolytic metastases; 2nd column) were analyzed. The five experimental genes were chosen because of their overexpression in osteotropic metastatic cells and their known biological properties in promoting osteolytic metastases. Clone 2 cells (red box), when injected into the arterial circulation of mice, showed a tendency to produce osteotropic metastases, as indicated by in vivo imaging; these cells expressed high levels of all five experimental mRNAs. Clone 3 cells (yellow box), in contrast, expressed low levels of all five mRNAs and preferentially formed lung metastases. And clone 26 genes (yellow box), which expressed essentially none of these mRNAs, formed no metastases at all. Moreover, when otherwise poorly metastatic cells were forced to express combinations of three of these genes, they acquired the ability to form bone metastases efficiently (not shown), pointing to the causal role of these genes in forming these metastases. Metastases were visualized through the presence of a luciferase gene in the tumor cells, which causes cells to release a bioluminescent signal. (From Y. Kang et al., Cancer Cell 3:537–549, 2003.) figure_14_53 Orgánově specifické bariéry Metastatická kolonizace plic Metastatická kolonizace mozku * Metastatická kolonizace jater figure_14_47abc figure_14_48a Osteotropní metastáze Osteotropní metastáze * Parathyroid hormone-related peptide (PTHrP) * Behěm laktace produkován normálními MECs - mammary epithelial cells – > mobilizace vápníku * Nádorové buňky - adaptují tento mechanismus – osteolýza kostí vede k uvolnění řady růsových faktorů stimulujících nádorové buňky figure_14_49 figure_14_48b Aktivace růstových signálů * Metastáze před a po terapii Terapie cílená na metastázování Shrnutí * 90% úmrtí na nádorová onemocnění souvisí s metastázováním * Invazivní kaskáda zahrnuje: lokální invazi, intravazaci, transport, extravazaci, formovaní mikrometastáz a kolonizaci * Nízká efektivita celé kaskády, nejméně efektivní je kolonizace * EMT, řízena pleiotropními TF v různých fázích embryogeneze, adaptována během tumorigeneze * Motilita je řízena malými GTPasami, Rho rodina * Proteázy (MMP) umožňují invazi nádorových buněk, degradace ECM * Tkáňový tropismus nádorových buněk lze v některých případech vysvětlit organizací oběhového systému, často prozatím neobjasněn Otázky * Jaké je možné vysvětlení nízké účinnosti kolonizace mikrometastáz? • * Jaký mechanismus může vysvětlit korelaci mezi velikostí nádoru a prognózou vzniku metastáz? * * Jaké důkazy podporují zapojení EMT v nádorové patogenezi, jaké jsou naopak proti?