Praktikum z genetiky rostlin JS 2021 Identifikace genů přístupy klasické a molekulární genetiky a genomiky 1. Genetická analýza a využití genetických markerů u modelových a kulturních druhů 2. Asociační mapování Cíle praktika 1. Genetická analýza a zjištění počtu genů odolnosti k padlí u ječmene. 2. Identifikace genů - určení DNA markerů v genetické vazbě s genem odolnosti k padlí travnímu u ječmene. Práce s balky. 3. Genetické mapování genů odolnosti k padlí travnímu u ječmene. Využití mapovacího softwaru. 4. Celogenomová genotypizace u jetele lučního Genetické markery Marker (genetický marker) = signálni gen, signálni linie • morfologické • bílkovinné (izoenzymy) • DNA Vlastnosti markerů 1. vysoký polymorfizmus 2. kodominantní charakter dědičnosti 3. častý výskyt v genomu 4. nezávislost na podmínkách prostředí 5. snadná dostupnost 6. snadné a rychlé testování 7. vysoká reprodukovatelnost 8. snadná výměna údajů mezi laboratořemi Typy DNA markerů 1. založené na hybridizaci DNA 2. založené na polymerázové řetězové reakci amplifikace - specifických sekvencí - náhodných sekvencí 3. založené na sekvenování - jednonukleotidové polymorfismy Klasifikace DNA markerů podle použitých sond = cílových lokusů (genů) 1. jednokopiové a vícekopiové sondy RFLP (Restriction fragment length polymorphism CAPS 2. mnohokopiové sondy mikro satelity RFLP Technology ^■gĽĽLdíiLtfeflnndccl a rd 3 Tá. í e ď í, B B !!!M Denature l .-'Ir- 3-iLk :: o n iď a nAttcttkjfett liner IJl^vjlĎpli T1 J X-I3f Mi Wash tri lHilPU Hítd.-ů su.arw -----1 ) Prentice-Hall Schéma RFLP markerů (restriction fragment length polymorphism) - I zolace DNA - Reštrikční analýza - Elektroforetická separace - Přenos DNA na membránu - Značení sondy - Hybridizace - Vizualizace Schéma SSR markem (simple sequence repeat) A PCR přímý primer _ _ I 1 (GA) I □ n - zpětný primer mmmméMmmĚmmMmmmmmm^mmmšmm fragment poiymorfní dna B Elektroforéza A B AB A 1. ekotyp B 2. ekotyp AB kříženec A x B Schéma CAPS markem (cleaved amplified polymorphic sequences) B ekotyp 1 PCR stepem restrikčními enzymy ekotyp 2 R .....\, R .....\m \ \ PCR heterozygot R U W K W I J t stepem restrikčními enzymy elektroforéza v agarozovém gelu I R \ Využití genetických markerů Základní výzkum i šlechtění Studium rostlinných genomů 1. Otisk DNA (fingerprinting) 2. Stanovení evolučních vztahů (příbuznost genotypů), taxonomie 3. Genetické mapování 4. Celogenomové studie - asociační studie (GWAS, GBS) 5. Korelace mezi fyzickými a genetickými mapami Genetické mapování 1. Konstrukce genetických map určitého rostlinného druhu Vysycenost markery 2. Vytváření nástrojů přo MAS (marker-assisted selection) 3. Poziční klonování genů Populace využívané k mapování F2 znak dominantní 3:1 znak kodominantní 1:2:1 Bt 1:1 Aneuploidní linie Dihaploidní linie - homozygotní materiál Rekombinantní inbrední linie (RIL) Blízké izogenní linie (NIL) Znaky kvalitativní x znaky kvantitativní Velikost populace Počet DNA markem pro zachycení vazby Genetické mapování u modelových druhů mutace u Arabidopsis thaliana Výhoda: malý génom morfologická mutace ly hcopodioformis Populace F2 DNA markery — SSR (simple sequence repeats ) mikfosatelity - CAPS (cleaved amplified polymorphic sequences) Schéma krížení m...........mutantní alela na pozadí S96 resp. DiG M.......... mikrosatelit na pozadí S96 resp. DiG +........... standardní alela na pozadí Col M...........mikrosatelit na pozadí Col 0 x CO.... žádný crossing-over 1 x CO.... jeden crossing-over 2 x CO ...dva crossing-overy Rámečkem jsou označeny rostliny F2 generace mutantnflio fenotypu 9 S96 S96 m M m X S96 S96 m M m M 0 x CO S96 S96 m M " M S96 S96 + M + M S96 Col m M S96 Col m M 1 x CO S96 Col i u + M S96 Col + M Col Col r m M J I- 2 x CO Col Col M) M J M Col Col + M - - M 11 Lokalizace základní sady DNA markerů v genetické mapě Arabidopsis thaliana 1CH 2CH 3CH 4CH 5CH EAT nga63 F19G10-23714 M235 nga280 9,6 34,5 50.7 57,0 73.8 87,6 90,8 nga1145 8,4 20,6 P HYB nga1126 C2SOD2 nga168 43,8 59,2 60,0 75,2 86,4 GAPC nga162 AthGAPAb Bgl1 nga6 5,1 17,7 29,6 F1P2-TGF 57,6 78,9 82.3 83.4 85,3 104,7 MI122 GA1.1 nga1111 nga1139 nga1107 8,5 9,0 14,3 15,0 16,0 17.0 18.1 23,7 38,7 50,5 68,4 79,9 93,1 MUK11 DCIW15 nga225 CIW18 CIW16 PAI2 nga158 nga249 R89998 nga139 nga76 AthS0191 FM4 AthATPASE CAPS zeleně SSR černě 125,1 134,5 G2368 PDC2 Postup 1. Lokalizace lokusu v genomu 20 až 30 vzorku DNA z mutantů 7/2F2 Kontroly: rodiče, F1 20 markerů • PCR pro SSR markery • ELFO • PCR pro CAPS markery • Štěpení enzymem • ELFO Segregující populace F2 a molekulární analýza - příklady M C ly H 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 150 bp 140 bp nga249 M C ly H 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 199 bp 191 bp ngall26 Výpočet podílu rekombinace r: 7 C chromozomů (1) r = ^i- y ^. všech chromozomů C... rekombinovaný chromozom Výpočet střední chyby podílu rekombinace sr: (2) * = JS V n n... celkový počet chromozomů Odhad mapové vzdálenosti D dle Kosambiho mapovací funkce (Kosambi, 1944): ŕ (3) £>=25 ln V 100+ 2r 100 -2r J Výpočet střední chyby odhadu mapové vzdálenosti sD: (4) Sd = 2500 2500 - r Lokalizace mutantní alely ly v genetické mapě Arabidopsis 1CH 2CH 3CH 4CH 5CH -\ J> NT7I23 280-4-4 ^~YT1G11-89778 Jl \vnga63 PVV4.1 EAT 83,8-87,0—1 117,8 135,0 VIII-111 F19G10-23714 NF19G9 NF21J9 ZFPG ■T27K12SP6 nga280 9,6 34,5 — 73,8- 90,8 97,0 ngal145 — PHYB ngal126 CZSOD2 T27E13 C4H nga168 Ml 97 5,8 x xnga32 38,1 ■ 43,8- 59,2-60,0-68,2-73,9-75,2- 83,4-86,4- 101,0- AthATPASE nga162 AthGAPAb F1P2-TGF AFC1 BqM 280-4-8 nga6 101 135 černá - SSR markery zelená - CAPS markery červená - analyzované mutace 5,1 —I 17,7-29,6- 57,6- 85,3 104,7- 125,0 MI122 GA1.1 nga1111 ATMYB3R ngal139 CAT2 ngal107 125 8,5 MUK11D CIW15 C"* l\A/ -\ ' 9 0 \^ 12^4 ly 14,3 V" n9a225 15,0 J - VCIW18 16,07/ \VCIW16 17,0-y - \ 23,7-V V-nga249 Há-// V nnainfi 33.4 JJ 38,7 J 50.5 68,4-79,9- 93,1 - 112,0 — 125,1 — 139,0 nga106 nga139 nga76 AthS0191 ■ FM4 >CD2 368 139 2. Zpřesnění mapové pozice (200 mutantních rostlin) vzdálenost 1 až 3 cM (200 až 600 kb, 45 až 135 genů) 3. Identifikace kandidátních genů až 2000 F2 rostlin, identifikace dvou DNA markerů v co nejbližší pozici, identifikace rekombinantů Nezbytná vysoká vysycenost genomu DNA markery SNP, In/Del Charakterizace mutace na úrovni DNA aagttacaaaagaaaATGGAGAATATGGGAACTAGAGTGATAGAGCCATTGATAATGGGGAGAGTGGTAGGAGATGTT CTTG ATTTCTTC ACTCC A AC A ACTA AG ATG A ATGTTAGTTATA AC A AG A AG C A AGTCTCC A ATG G CC ATG AG CTCTTTC CTTCTTCTGTTTCCTCCAAGCCTAGGGTTGAGATCCATGGTGGTGATCTCAGATCCTTCTTCACTTTGgtaaatacatatattt aaattattttataataatgttggttttatttatattgtgccaaaaaaaaccatataaaacgtctcacttccttttcctcttacaagttttccatttctaactcaa taatctptaaattgtagctttagtttttatcattcctttttccagtcttttttttttaatggtaaaactcaaccgaaatgcaaaacagGTGATGATAG CCAGATGTTCCAGGTCCTAGTGACCTCTTTCTAAAAGAACACCTGCACTGgtacgtttaatttatttattctttcttttcattttgggcc catattccatatacattgcatttaaatcatttcgttataaccctaataaagttttttttgggtgtaagttatatacatttgagttggtcaaagatctccatcec catgagttctcagaactttttctgtaaagtaataatattagtattgttgaatgtttcaatagGATCG™CAAACATTCCCGGCACAACA(Srl G™SGTTTGgtaaggcctm^ AAAGAGGTGGTGAGCTATGAATTGCCAAGGCCAAGCATAGGGATACATAGGmGTGTTTGTTCTGTTCAGGCAGAA GCAAAGACGTGTTATCTTTCCTAATATCCCTTCGAGAGATCACTTCAACACTCGTT AAATTTGCGGTCGAGTATGATCTTGGTCTCCCTGTCGCGGCCGTCTTCTTTAACGCACAAAGAGAAACCGCTGCACGC TAGtttcatgattgtcataaactgcaaaaatgaaagaagaaaatttgcatgtaatctcatgtttatttgtgttctgaatttccgtactctgaa taaaaactgccaaagatgagttgaatccgaaatatcaattgagtttacagaagtattgataacgatctgtcgattatcagaataaaaactagattaattg catatcatgtttagcattgtaatactacaaaaatagtaaactcttgattaattaataaaatctaagttgctgtagtatataaatcattaaatcctcatacat ggcttgataggtcacatcacatgtagtgaaccttattatatgataaacgtggagatacggaaaaggatagttaaacgatgaaaactttttttagttctggt caaagtgacaagaccttgatgaccatctaaaatatgatcctctcc Genetické mapování u kulturních druhů s velkým genomem Identifikace DNA markem v těsné vazbě s genem Speciální populace pro mapování RIL Rekombinantní linie NIL Izogenní linie BSA (Bulk Segregant Analysis) RIL (recombinantisogenic lines) R ekom binan tníinbrední linie ® časová náročnost © vysoká homozygotnost Křížení polymorf nich (fenotypově kontrast nich) linií F2 50,0% F3 75,0% F4 87,5% F5 93,8% F6 96,9% F7 98,7% F8 99,5% !!!!!! nim mm. 95 NIL (near isogenic lineš) Izogennílinie ® časová náročnost - vytvoření F1 + 6 x BC, selekce na daný gen (znak) v každé generaci © vysoká homozygotnost, rozdíl jen v lokusu konkrétního genu a jeho okolí © polymorfismus (DNA) mezi NIL s vysokou pravděpodobností souvisí s vazbou marker-gen Pj Ďonor P2 Recipientní rodič 12,5% Pí ..........► 0,42% Pí Náchylné Rodič S R-Bulk S-Bulk Rezistentní Náchylné Genetické mapování genu odolnosti u ječmene Hordeum vulgare Padlí ječmene původce Blumeda graminis f. sp. hordei v CR i celosvětově jedna ze závažných chorob ječmene • Šlechtění odolných odrůd • Zdrojem genů odolnosti jsou plané ječmeny - H. vulgore ssp. spontaneum, H. bulbosum Genetické aspekty choroby Rostlina (hostitel) Patogen ^ interaction „ génom 1 «-► génom i geny odolnosti R geny avirulence Avr většinou dominant alela dominantní i i . rozpoznaní . protein 1 «.-► protein 2=ehcitor Aktivace mechanismů odolnosti koncept gen - proti - genu geny R rasově specifické 1. Mají schopnost detekovat (rozpoznat) patogena 2. Mají schopnost aktivovat obranné mechanismy Analýza rezistence ječmene Využití donorů rezistence 1. Zjistit charakter dědičnosti genů u nových zdrojů odolnosti ječmene k padlí ječmene 2. Lokalizovat zjištěné geny odolnosti v genomu ječmene pomocí DNA markem 3. Vyvinout molekulární markery alespoň pro některé ze zjištěných genů odolnosti (MAS) Postup řešení Vytvoření vhodných populací pro analýzy odrůda 'Tiffany'x zdroj odolnosti -► F2 Fytopatologické testy - P, F2 fenotypování Genetická analýza Určení počtu genů determinujících odolnost Statistické ověření. Určení typu dědičnosti. Získání DNA markerů pro ječmen H. vulgare Určení polymorfismu u rodičů Molekulární analýza Určení DNA markerů (SSR, CAPS) ve vazbě s jednotlivými geny odolnosti: Analýza balků - náchylného a odolného Lokalizace genů na chromozomech ječmene Druh — ječmen Hordeum vulgare Hodnocený znak - odolnost k padlí travnímu Původce padlí travního —Blumetia graminis f. sp. hotdei (houba) Populace F2 Křížení 2 náchylná (S) x odolná (R) H. vulgare cv. Tiffany x H. vulgátě ssp. spontaneum PI391004 (zdroj odolnosti - planý ječmen) 1 Vx - F2 (100 rostlin) 1 Fenotypování — identifikace počtu genů • Rostliny rodičovské, Ft i jednotlivé rostliny F2 jsou otestovány virulentním izolátem Bgh • Stupnice hodnocení fenotypu - odolnosti: 0, 0-1,1,1-2, 2, 2-3, 3, 3-4, 4 0 až 3 - rostliny odolné, 3-4 a 4 - rostliny náchylné Tiffany RT4 Zdroj odolnosti 2 RTO Ft RT1 typ dědičnosti • F2 210 rostlin (fytopatologická analýza) 2 Molekulární analýza — lokalizace genů v genomu • F2 balky (DNA, rostliny RT 0 a RT4 ) každý asi 15 rostlin • F2 asi 100 rostlin (DNA) Mapa SSR markerů ječmene využívaných v laboratoři 1H 2H 3H 4H 5H 6H 7H 1313 1325 1385 1395 645 ■ [(GMS02T) ■GBM1007 f(Bmac0399) r abaoo4 Bmac0213 fABG053 GBM1042 Bmag0504 f(EBmac0656) Bmac0345 ■GBM1311 Bmag0211 GBM1451 Bmac0090 |EBmac0405 lEBmacO501 Bmac0063 Bmac0032 Bmac0154 Bmag0332 WMC1E8 Bmag0579 yt^(EBmac0783) 139,8 29.5- 67.0" 0 B MS247 Bmac0134 ■ GBMS031 MWG878 ■ŮBM1187 ■ŮBM1281 ■OBMS0O0 IGBM1035 1GBM1121 HVM36 )(ABG318) LGBM5018 ' GBMS002 'GBM1052 Bmac0222 Bmag0692 |(Bmac0218) Bmac0093 |EBmac0557 lEBmac0607 EBmac0715 EBmac0640 (CBmag0518) ' Bmag0378 [CHVHOTR1) Bmag0140 Bmag0125 EBmac0415 GBM1047 Bmag0749 '156,5 13.9- 20.5- 32.0- 52,6" 54.6-57.6" 65.5-75.5- 91.2" 101.8-113.7- 157.5- ■GBM1450 EBmacO705 GBM1284 BmagOSOS Bmag0603 ^ EBmac0371 Bmag0112 Bmag0225 Bmag0841 Bmag0606 Bmag0013 EBmac0541 HVM62 EBmag0705 -157,5 □ ,o- 22,4- 133,3- HVM40 HvOLE HVM03 |(EBmac0540) 'l(EBmac0669) "-(Bmag0490) - EBmac0658 ť EBmac0635 - EBmao0701 v EBmac0788 - WMS6 - HVM67 ■133.3 0,0- 18,6- 37,7 -41,9 ^ 53,1 - 65,0- 73.8- 36.9-102,3 ■ 156,9- GBM1176 Bmac0163 (HVM30) I Bmac0303 lBmac0096 Bmag0357 EBmac0684 Bmag0223 - GBM1231 (HvLO.X) (GMS06T) EBmac0824 EBmatcO003 &MS027 Bmag0222 GBM1164 GMS001 133.3 139S ■ -O - Bmac0316 - BamgOSOO - GBM1355 s Bmag0173 - EBmac0674 ^(Bmag0219) EBmac0602 EBmac0806 -ŮBM1140 Bmac0040 ■ 139,9 35 ■ 79.1 HVPLASC1B Bmag0021 GBM1060 GBM1126 G B MS 192 (EBmac0713) Bmag0206 EBmag0794 BmagOOOP (HVM04) GBM1326 EBmac0603 AF022725A HVCMA Bmac0187 Bmag0341 (Bmag0109) Bmag0189 Bmag0217 Bmag0321 Bmag0516 Bmac0162 EBmac0785 EBmac0827 (Bmac0224) BmagOOH CBmac05S2) Bmag0507 Bmag03S5 EBmac0764 Bmag0120 EBmac0755 (Bmac0035) Bmac0156 HVPRP 157,1 Určení markerů ve vazbě s genem odolnosti k padlí travnímu u ječmene Práce s balky Krajní třídy RTO a RT4 DNA markery SSR (simple sequence repeats ) CAPS (cleaved amplified polymorphic sequence) chromozom 1H RGHlaE2I2 (AM), Bmac0213, Bmac0032 chromozom 2H Bmac0134, GBM1281 chromozom 6H Bmac0316 chromozom 7H Bmac0156 Analýza bulku při dominanci odolnosti S - z náchylných rostlin F2 R - z odolných rostlin F2 51 - testovaný SSR marker není ve vazbě s genem odolnosti 52 - testovaný SSR marker je ve vazbě s genem odolnosti rodiči rodič 2 F1 F2 drůdaTiffany zdroj odolnosti bulk R bulk S1 S2 DNA markery na chromozomu 1H SSR CAPS štěpení enzymem AIuI 3h/37°C