ÚVOD DO KVANTITATIVNÍ REAL-TIME PCR VI. Aplikace qRT-PCR Aplikace 1. Detekce DNA - Diagnóza infekčních onemocnění (přítomnost patogenů v krvi, séru, plazmě ...) - Sledování minimální reziduálni nemoci - Detekce patogenů v potravinách a v životním prostředí - Detekce GMO - Autenticita potravin 2. Detekce RNA - Minimální reziduálni onemocnění (Her2 - karcinom prsu, Bcr-Abl - CML, ELAVL-4 - neuroblastom) - Detekce RNA virů - Diagnóza nádorových onemocnění (PSA - karcinom prostaty) - Validace microarray experimentů 3. Detekce SNP 4. Detekce miRNA Aplikace Aplikace v klinické mikrobiologii Diagnóza - rychlá, citlivá a přesná determinace patogenů Klasické kultivační metody - časově náročné (24-48hod), nízká citlivost, omezené spektrum druhů qRT-PCR - např. geny kódující 23S rRNA nebo 16S rRNA Rutinní diagnostika - Helicobacter pylori, Chlamydia pneumoniae, Streptococcus pneumonieae Monitoring zneužitelných druhů - biodefense - Yersinia pestis, Bacillus anthracis Výzkum - testování antibiotik - multidrug resistant strains (analýza bodových mutací v genech zodpovědných za metablismus ATB) - Mycobacterium tuberculosis, Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus Houbová a parazitární onemocnění - Aspergillus fumigatus, Candida sp. - Entamoeba histolytica, Giardia lamblia, Cryptosporidium parvum Aplikace Aplikace v klinické mikrobiologii Příklad protokolu: Detekce Prevotella intermedia Stěr z úst Resupendovat stěr v 1xPBS Vortex 30s, cfg. 20min/15 OOOg Izolovat bakteriální DNA ze supernatantu Návrh primerů (Primer Express) - oblast 16S rDNA Např.: Forward: 5'-AATACCCGATGTTGTCCACA-3' Reverse: 5'-TTAGCCGGTCCTTATTCGAA-3' Reakční směs PCR 2x SYBR green Master Mix (Applied Biosystems) 26,0|al 95°C 1min Forward primer (10|aM) 2,0\x\ Reverse primer (10|aM) 2,0\x\ 95°C 15s PCR grade H20 15,0|al 60°C 1min Vzorek DNA nebo standard 5,0|al f 40X ) Disociační křivka - 60-95°C Aplikace Aplikace v klinické virológii Typizace virů (např. chřipka) nepřítomnost signálu - variabilita v sekvencích/falešně negativní výsledky Hydrolyzační (TaqMan) i hybridizační sondy Kvantifikace - virový titr např. hepatitída B/C, HIV, EB, cytomegalovirus atd. Transplantace Detekční limity - genomové ekvivalenty (ge) End-point analýza - detekční limit 5x101 ge; dynamický rozsah 101-104ge Hybridizační analýzy - detekční limit 2x101 ge; dynamický rozsah 101-104 ge Inter- a intra assay variabilita >40% qRT-PCR - detekční limit 1x101 ge; dynamický rozsah 101-108 ge Inter- a intra assay variabilita <5-10% Interní amplifikační kontrola - Paralelní PCR známého standardu - Tzv „Spiking" vzorků známými sekvencemi - Paralelní analýza příbuzného viru (např. pro lidský HSV - tulení PhHV) Aplikace Aplikace v klinické virologii Příklad protokolu: Detekce viru chřipky (Influenza A) - 5' nukleázová assay Stěr z nosohltanu Resupendovat stěr v 1xPBS Vortex 30s, Izolovat virovou RNA ze supernatantu Návrh primerů a sondy (Primer Express) - oblast M1 (influeznaA matrix gene) Např.: Forward: 5'-CTTCTAACCGAGGTCGAAACGTA-3' Reverse: 5'-GGTGACAGGATTGGTCTTGTCTTTA-3' Sonda: Fam-TCAGGCCCCCTCAAAGCCGAG-BHQ+ Reakční směs - One Step PCR (Qiagen) PCR Qiagen One Step RT-PCR Enzyme Mix 1,0jal 50°C 20min (Reverzní transkripce) Qiagen One Step RT-PCR Buffer (5x) 5,0|al Qiagen One Step RT-PCR dNTP mix (10mM) 1,0jal 95°C 15min (Aktivace polymerázy) Forward primer (10|aM) 2,0|al Reverse primer (10|aM) 2,0|al 95°C15s i 45X ) Sonda (20|aM) 0,2|al 60°C1min \__^/ PCR grade H20 8,8|al Vzorek DNA nebo standard 5,0|al Aplikace http://www.idahotec.com/BioDefense/ Terénní qRT-PCR - Detekce patogenů mimo laboratoř - Komerční specializovaná řešení http://www.rapidcycler.com/GSA/index.html Aplikace Jednonukleotidové polymorfismy SNP DNA sekvence lišící se v jediném nukleotidu Kódující i nekódující oblasti Záměna nukleotidu nemusí nutně vést k záměně AA - Variabilita v odpovědi k patogenům, léčivům, atd. Senzitivita k onemocněním http://www.ncbi.nlm.nih.gov/proiects/SNP/ Detekce Taqman SNP microarray Aplikace SNP genotypizace pomocí real-time PCR Zejména molekulární majáky a TaqMan sondy End-point analýza • 2 alelově specifické sondy které mají specifické fluorofory a PCR primery, které detekují specifický target • Vysoká specificita • Próby s MGB (minor groove binder, 3') - zlepšují hybridizaci stabilizací vazby MGB s templátem • Proby cca 13bp Aplikace SNP genotypizace pomocí real-time PCR Zejména molekulární majáky a TaqMan sondy End-point analýza '. Ass-ay components and DNAtemplate ■ Iii i Foniarol primer E Prot» V.........fr mtm I I I h ľTT^ŕ T......................................... l&Tl 2. Denatured temp-ale and annealing assay QomponEwts 5- p^J Prot* J& rcrAľirn prrrcr i i - - r i i— i i Reverse primer .........1 J-.........> ' '■.......L t j.i I I I 1ST 3. PolymerizatMn and s^uJ generation Hi-~Ľ 1- Re¥en* prtrier Probe E.......ilTi i í I if .......... .V I ffľrrrrrr :■ vrah .tit': QueiĽhtr Minor Groove hmpHTaq GoliP C ^ =C y- j.j;.;. UnrlrtíMTniripd • Allele X »Allele Y • Both ■ NTC -A h ■ ■ * ■h ■ ■ M L* K 4 ■ K H ' Allele X [SNP Allqlq 1) Figure 1. Allelic discrimination is achieved by the selective annealing of TaqMan* MGB probes. Aplikace SNP genotypizace pomocí real-time PCR Zejména molekulární majáky a TaqMan sondy End-point analýza • Detekce pomocí dvou majáků - 1 se váže na wt alelu, druhý na mutantní alelu • Různé fluorofory Molecular Probe Target Sequence Emission of Fluorescence Aplikace SNP genotypizace APEX (Arrayed primer extension) - 2D matice, oligonukleotidy imobilizované 5'koncem - PCR produkt je hybridizován a prodloužen DNA polymerázou - Fluorescenčně značené terminátorové nukleotidy Aplikace SNP genotypizace SNP array Array pomocí použití tisíce prob Amplification Digestion Probe labeling B. SNP array Patient DNA SNP array I Hybridization ^ Allele A ^ Allele B Normal Deletion Duplication Aplikace Analýza křivek teplot tání = High resolution melting analysis Analýza komplexních sekvencí PostPCR analýza Snadná analýza neznámých sekvencí Sledování disociace řetězců DNA v závislosti na teplotě B. Normalized Melting Curves 100 ■u 15 75 c * 50- 25 W \ Double-stranded DNA Single^tranded DNA HÍS DNA) ^ (random coils) V «f 76 79 82 Tm 88 91 Temperature [°C] ■ oo 80 | 60 s 20 25 20 15 C [I c 7 /ild Typ ^alleli ^\ Mutc jnts „ i „ \ (I all Hi 3teroz^ /gote; ^\ \^ fi ? 05 3 m f\ 1=1 a oj Fi 0r i Mid types ;C allele) M \ < P yiutar T allel ts 3) / \ X > /£ M 1 Hete rozyg otes 02 8ZI 03 33.! 34 04.Í TompTHliirí; ("Q 35 85 80 80.! Aplikace miRNA detekce MikroRNA (miRNAs) -Malé molekuly RNA - rostliny i živočichové - konzervativní sekvence - 21 mery - regulují expresi genů vazbou na 3' nepřekládaný region mRNA (3'UTR) miRNA genes Pre-miRNA Nucleus Cytoplasm ^Dicer I TOTTTT~m.RNA duplex ^^^^^TTCTtTTTn- T^^TT^- DSnmr _n2n One strand incorporated into Rlz C r ~\ RlzC^ T Target MjUh.l mRNA mRNA Translation cleavage inhibition Tumor suppressor gene ;Tumor suppressor gene expression Aplikace 75 ng/ul Thymus Total RNA 40 60 Fig. 1A. Image of a typical electropherogram for small RNA analysis performed with the Small RNA Assay on the 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies) (http:// www.chem.agilent.com/Library/technicaloverviews/Public/5989-7002EN.pdf). Becker C. et al. 2010. Methods 50(4):237-243 Aplikace miRNA detekce Specifický primer pro RT 5' nuclease assay (TaqMan) PCR Endogenní kontrola: malá jaderná RNA(snRNA) 111111111111 -i- ____ Trm oř ML llllllllllllllllllll Aplikace Analýza DNA metylací • Více než 70% C lidského genomu v sekvenci CpG je metylováno • Významná modifikace, regulující např. architekturu chromozomu i řadu dějů na buněčné úrovni • regulační úseky genů - promotory C + bisulfit = U mC intaktní STEP 1 NH| Sulphonation nh, HS03- .HNÍ-^ OH vSO,- Cytosine N H Cytosine sul p h on ate Endonukleázy citlivé metylovaným sekvencím BsoFI, Hpall, Mspl and Hhal Hydrolytic Deamination HS03 OH I STEP3| Alkali Uracil Desulphonaäon Uracil Histone (ails The two main components of the epigenetic code DNA methylation Methyl marks added to certain DNA bases repress gene activity. Histone modification A combination of different molecules can attach to the 'tails' of proteins called histones. These alter the activity of the DNA wrapped around them. Aplikace Kvantitativní analýza DNA metylací pomocí real-time PCR Nemetylováné cytosiny jsou konvertovány na U bisulfitovou metodou 1. Pro každou sekvenci dva páry primem nebo 111 22Í 2. Jsou použity oligonukleotidy hybridizující k nemetylovaným sekvencím a blokující PCR Aplikace Single cell profiling tion > A B Total number of ^ transcripts = 6 Total number of ^ transcripts = 6 Total number of ^ transcripts = 7 Total number of \ transcripts = 6 Total number of ^ transcripts ■ 7 Total number of ^ transcripts = 6 Cell collection Cell lysis Reverse transcription Real-time PCR Data analysis ■glass capillaries ' flow cytometry laser capture • purification • detergents • heat • osmotic • mechanic * reverse transcriptase ► priming ' temperature profile 1 pre-amplificalion mastermix ■ priming temperature profile ■ detection chemistry pre-amp I ideation normalization quality assessment statistics Stahlberg A. and Bengtsson M. 2010. Methods 50(4):282-288 Aplikace Circulating tumor cells (CTCs) Alluni-Fabbroni. 2010. Methods 50(4):289-297 Droplet digital PCR • Precizní sensitivní stanovení NK • Kombinuje klasické PCR postupy s fluorescenčním stanovením produktu • Rozdělení PCR reakce na stovky až tisíce subreakcí- někde dojde k replikace, někde ne - přítomnost/nepřítomnost hledané sekvence • Subreakce individuálně analyzovány • Ratio pozitivních a negativních reakcí- počáteční množství molekul templátu • Absolutní kvantifikace bez externích standard ddPCR-využití • Kvantifikace virů a patogenů • Genové exprese - pokud rozdíly menší než dva krát • Copy number variations • Single cell analysis • Rare mutations.... ddPCR Eniyme PCR Pringrs Oeieciion sysi*n (prctoe ui dye) Sample Fig. 3 Components of a Digital PCR reaction and Partitioning. dPCR reactions con-n e m Iff cc~pon£n:s x that typical / used r a cPCR reac: :m. These cc~p:-nents should be thoroughly mixed and then partitioned into uniform subpartitions m ■no ... MM •o I E g 3000 8 2000 i BOB Ch2 Conc:1230 POS9887 Neg:4062 0 2000 4000 6000 8000 10000 12000 Event Numoer Rg. 4 (a) Partitioned reactions are placed in a vessel compatible for the PCR amplification to take place, (b) Amplification can take place in a standard ttiermocycler using typical qPCR protocols. For example 95 °C for 10 min followed by 40 cycles of 95 °C for 30 s and GO °C for 1 min. No optical analysis is required at the amplification phase, (c) Individual subreactions are collected and subsequently interrogated for the presence of a positive fluorescent signal, (d) Individual reactions are deemed either a positive or negative event, counted, and the concentration is calculated ddPCR Chi CNV 2 02 Cone l040Pos$?2?Neg«1?2 Rg. 5 Temporal plot of a dPCR reaction. X axis represents individual subreactions in the order they were analyzed. Vaxis represents fluorescent signal generated in each corresponding subreaction. Bkiedots are deemed as positive events; grey flbteare deemed negative. Purple Une is the threshold for determining what is positive from negative (can be set automatically by software algorithms or manually as in the case above)